IDEGTUDOMÁNYOK PROGRAM

Átírás

1 IDEGTUDOMÁNYOK PROGRAM Neurofarmakológia alprogram Témavezetõ: Dr. Sperlágh Beáta, az orvostudományok kandidátusa A NIKOTINOS ACETILKOLIN ÉS A KANNABINOID RECEPTOROK SZEREPE A NEUROTRANSZMITTER- FELSZABADULÁS SZABÁLYOZÁSÁBAN A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN Kõfalvi Attila Ph.D. értekezés MAGYAR TUDOMÁNYOS AKADÉMIA KÍSÉRLETI ORVOSTUDOMÁNYI KUTATÓINTÉZET MOLEKULÁRIS FARMAKOLÓGIAI LABORATÓRIUM ÉS SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA 2003 Budapest 1

2 ÖSSZEFOGLALÁS 6. SUMMARY 7. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 8. ELOSZÓ 8. A KANNABINOIDOK FARMAKOLÓGIÁJA 9. A kannabinoidok hatása in vivo 9. A kannabinoidok hatásának hátterében álló receptorok 10. Kannabinoid ligandok 13. Kannabinoid receptor agonisták 14. Kannabinoid receptor antagonisták/inverz agonisták 20. A kannabinoidok inaktiválása 21. A VANILLOIDOK FARMAKOLÓGIÁJA 22. A vanilloid receptor (VR 1 ) 22. Vanilloid ligandok 23. BIZONYÍTÉKOK TOVÁBBI KANNABINOID HATÁSHELYEK MEGLÉTÉRE 24. A KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ 26. A KÖZPONTI IDEGRENDSZER NIKOTINOS ACETILKOLIN RECEPTORAINAK FARMAKOLÓGIÁJA 27. A nikotin hatása in vivo 27. A nikotinos acetilkolin receptorok 27. A receptorok farmakológiai profilja 30. A NIKOTIN ÉS A HIPPOKAMPUSZ 31. CÉLKITUZÉSEK 33. A kannabinoid receptorokkal kapcsolatos kérdések: 33. A nikotinos receptorokkal kapcsolatos kérdések:34. MÓDSZEREK 35. ANATÓMIAI KÍSÉRLETEK 35. Preembedding immunfestés 35. Preembedding kettos immunfestés peroxidáz reakcióval 36. Kombinált immunarany-immunperoxidáz kettos immunfestések 36. Kontroll kísérletek 37. Tükörkép módszer a neurokémiai markerek kolokalizációjának megállapítására 37. Fluoreszcens kettos immunfestések 38. 2

3 A CB 1 receptor szubcelluláris eloszlásának és a neurokémiai markerek kolokalizációjának megállapítására végzett elektronmikroszkópos kiértékelések 38. FARMAKOLÓGIAI KÍSÉRLETEK 39. Agyszeletek preparációja és elokészítése a kísérletekre 39. A tríciált transzmitter-felszabadulás mérése 40. Szinaptoszóma preparálása és elokészítése a kísérletre 41. Statisztika 42. Elemzési módszer aminosavak elválasztására 43. INTRACELLULÁRIS KALCIUM MÉRÉS 44. EREDMÉNYEK 46. A KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ 46. A KÉTFÉLE MEGKÖZELÍTÉSI MÓDSZERROL ELÖLJÁRÓBAN 46. A CB 1 RECEPTOR EXPRESSZIÓS MINTÁZATA A RÁGCSÁLÓK HIPPOKAMPUSZÁBAN 46. A CB 1 receptor expressziós mintázata fénymikroszkópos szinten 46. A CB 1 kannabinoid receptor szubcelluláris lokalizációja, elektronmikroszkópos vizsgálat 49. A CB 1 immunoreaktivitás specifikussága 49. A CB 1 RECEPTOR SZEREPÉNEK FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATA A RÁGCSÁLÓK HIPPOKAMPUSZÁBAN 51. A [ 3 H]GABA felszabadulás patkány hippokampusz szeletekben 51. A kannabinoid receptor agonista hatása a [ 3 H]GABA-felszabadulásra 52. A glutamát szerepe a WIN hatásának közvetítésében 53. Befolyásolja-e a kannabinoid receptorok aktivációja a GABA transzporteren keresztüli visszavételét? 54. A CB 1 receptor gátlása 54. A CB 1 RECEPTOR EXPRESSZIÓS MINTÁZATA A HUMÁN HIPPOKAMPUSZBAN 55. A CB 1 receptor eloszlása az ember hippokampuszában fénymikroszkópos szinten 55. A CB 1 receptor eloszlása elektronmikroszkópos szinten 56. A CB 1 RECEPTOR SZEREPÉNEK FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATA A HUMÁN HIPPOKAMPUSZBAN 57. A kannabinoid receptor agonista hatása a [ 3 H]GABA-felszabadulásra 58. 3

4 A glutamát szerepe a WIN hatásának közvetítésében 59. A CB 1 receptor gátlása 59. A KANNABINOIDOK GLUTAMÁTERG TERMINÁLISOKRA GYAKOROLT HATÁSÁNAK FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATA A RÁGCSÁLÓK HIPPOKAMPUSZÁBAN 60. A kannabinoidok közvetlen hatása a hippokampális glutamát felszabadulásra patkányban 60. A [ 3 H]glutamát felszabadulás patkány hippokampuszából preparált szinaptoszómában 60. A kannabinoidok hatása a glutamát felszabadulásra 61. A CB 1 receptor antagonistáinak hatása 62. A milyen szerepet játszhat a vanilloid receptor a kannabinoidok hatásában? 63. A kannabinoidok közvetlen hatása a hippokampális glutamát felszabadulásra CB 1 receptor génkiütött egérben 64. A [ 3 H]glutamát felszabadulás egér hippokampuszából preparált szinaptoszómában 65. A KANNABINOIDOK ÉS A STRIÁTUM 67. A kannabinoidok hatása a striatális dopamin, GABA és glutamát felszabadulásra 67. A [ 3 H]DA felszabadulás patkány striátum szeletekben 67. A kannabinoid receptor agonisták hatása a [ 3 H]DA-felszabadulásra 68. A kannabinoidok hatása a striatális GABA felszabadulásra. A [ 3 H]GABA felszabadulás patkány striátum szeletekben 70. A kannabinoid receptor agonista hatása a [ 3 H]GABA-felszabadulásra 70. A CB 1 receptor gátlása 71. A glutamát szerepe a WIN hatásának közvetítésében 71. A [ 3 H]glutamát felszabadulás patkány striátumából preparált szinaptoszómában 72. A kannabinoidok hatása a glutamát felszabadulásra 72. A NIKOTINOS ACETILKOLIN RECEPTOROK ÉS A HIPPOKAMPUSZ INTERNEURONJAI 73. A [ 3 H]GABA felszabadulás patkány hippokampusz szeletekben 73. A nikotinerg agonisták hatása a [ 3 H]GABA-felszabadulásra 73. Az nikotin hatását közvetíto receptor(ok) érzékenysége különféle nachr antagonistákra 76. 4

5 Az a7 nach receptor aktivációjától az elektromos ingerléssel kiváltott [ 3 H]GABAfelszabadulás fokozódásáig vezeto folyamatok vizsgálata 77. MEGBESZÉLÉS 82. EREDMÉNYEINK A CÉLKITUZÉSEK FÉNYÉBEN 82. A kannabinoid receptorokkal kapcsolatos válaszok:82. A nikotinos receptorokkal kapcsolatos válaszok: 82. KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ INTERNEURONJAI 83. De mire jó a CB 1 receptor? 87. KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ GLUTAMÁTERG SEJTJEI 90. A feltételezett CB 3 receptor 95. A KANNABINOIDOK ÉS A STRIÁTUM 97. A NIKOTINOS RECEPTOROK ÉS A HIPPOKAMPUSZ INTERNEURONJAI 98. Az a7 nach receptor aktivációja a legvalószínubb kiindulópontja a vizsgálatainkban látott nikotin hatásnak 100. A NIKOTINOS ACETILKOLIN ÉS A KANNABINOID RECEPTOROK SZEREPE AZ IDEGRENDSZER FIZIOLÓGIÁS ÉS PATOFIZIOLÓGIÁS MUKÖDÉSE SZEMPONTJÁBÓL 104. A nikotinos és a kannabinoid receptorok szerepe a nikotinaddikcióban. A dohányzás és következményei 104. A nikotinos és a kannabinoid receptorok az epilepsziában 105. A nikotinos és a kannabinoid receptorok a neurodegeneratív betegségekben 107. A nikotinos és a kannabinoid receptorok neuroprotektív funkciói 109. ZÁRSZÓ 111. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 112. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 113. IRODALOMJEGYZÉK

6 ÖSSZEFOGLALÁS Az elmúlt egy évtizedben a lipid mediátorok iránti érdeklodés jelentosen megugrott, aminek egyik oka a kannabinoid rendszer. A nikotinos acetilkolin receptorok pedig az Alzheimer-kór és a dohányzás kapcsán kerültek elotérbe. Mivel a kannabinoidok egyik legszembetunobb hatása a kognitív és motoros funkciók megzavarása, a hippokampusz és a striátum voltak az általunk vizsgált agyterületek. Megállapítottuk, hogy a CB 1 kannabinoid receptor expressziója az egér, a patkány és az ember hippokampuszában rendkívül konzervatív: a kolecisztokinin-pozitív interneuronok axonterminálisain fejezodik ki. Közvetlen neurokémiai vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a CB 1 receptor aktivációja mind emberben, mind a rágcsálókban preszinaptikusan, és hasonló mértékben csökkenti a GABA felszabadulását. A kannabinoidok azonban gátolták a glutamát felszabadulását is. A szakirodalom eleddig nem volt konzekvens a tekintetben, hogy vajon gátolják-e a kannabinoidok a glutamát felszabadulását, és ha igen, akkor hogyan? A kérdést két technikával jártuk körbe, és genetikailag módosított egérben tisztáztuk a folyamatokat. A válaszunk az, hogy nem a CB 1 receptor közvetít preszinaptikus gátlást a glutamáterg terminálisokon. A striátumban több transzmitter felszabadulásának változását terveztük nyomon követni a kannabinoid receptor aktivációját követoen. Eredményeink tanúsága szerint a hippokampuszban tapasztaltakhoz hasonlóan a kannabinoidok gátolják a GABA és a glutamát felszabadulását, ám a dopaminét nem. Hippokampusz szeletben a nikotinos acetilkolin receptor agonistái nem váltottak ki GABA felszabadulást. Ugyanakkor az agonista kimosása után jelentosen megemelkedett az elektromos ingerléssel kiváltott GABA felszabadulás. Az agonisták az Alzheimerkórban kulcsszerepet játszó a7 nach receptor aktiválásán keresztül a GABA transzporterfüggo felszabadulását fokozták hosszantartóan, fél órás féléletidovel. A jelenség függött az elektromos ingerlés frekvenciájától, az extracelluláris Ca 2+ jelenlététol és a feszültségfüggo Na + csatornák aktivációjától. A kannabinoid rendszer evolúciós konzervativizmusa fontos szerepet sejtet. A kannabinoidok és a nikotin kognitív funkcióra gyakorolt ellentétes hatása, illetve a kannabinoidok motoros tevékenységet megzavaró tulajdonsága már könnyebben értelmezheto eredményeink láttán. 6

7 SUMMARY Last decade the lipid messengers got in the lime-light, which is partly due to the research of the cannabinergic system. The nicotinic acetylcholine receptors have drawn increased attention because of smoking and the Alzeimer s disease as well. The most conspicuous effects of cannabinoid intake both in animals and humans are the hampered cognitive and motor functions. Thus the objects of our investigations were the rodent and human hippocampus, and the rat caudate-putamen. We have shown that the expression and function of the CB 1 cannabinoid receptor is highly conservative at the cellular and subcellular level in the rodent and human hippocampus: the receptor is expressed on the axon terminals of CCK-positive interneurones. We demonstrated with direct neurochemical methods that activation of the receptor by exogenous agonists results in the same extent of inhibition of GABA release both in rat and human as well. Cannabinoids inhibit the release of gutamate also from rodent hippocampal synaptosomes. Our results, which are based on neurochemical approaches, involving a CB 1 knockout mouse strain, and immunocytochemistry, however, clearly authenticated that it is not CB 1 receptor that mediates presynaptic inhibition onto glutamatergic terminals. This subserves the theory of the existence of a new central G-protein coupled cannabinoid receptor. In the rat caudate-putamen, our goal was to explore how cannabinoids affect the release of several neurotransmitters. We found that CB 1 receptor activation decreases the release of GABA according to that CB 1 receptor is located to medium spiny interneurones. Cannabinoids decreased the release of glutamate as in the hippocampus, whereas they didn t influence the release of dopamine. In the hippocampal slice, nicotinic agonists didn t evoke GABA release per se. However, after their washout, a dramatic increase of the release was observed during a subsequent electrical field stimulation. The agonists enhanced the transporter-dependent release of GABA via activation of the a7 nach receptor. The effect of nicotine depended on external Ca 2+, of voltage-dependent Na + channels and the frequency of electrical stimulation. The underlying mechanism needs further investigation. The evolutionary conservative expression and role of CB 1 receptors assume important regulatory function. The effect cannabinoids and nicotine on cognitive function, and the cannabinoid effect on motor function is clearer in the light of our results. 7

8 BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS ELOSZÓ A nikotin és a? 9 -THC a legszélesebb körben használt drogok. Segítségükkel fedeztünk fel két alapveto szignalizációs családot: a nikotinerg és a kannabinerg rendszert. A kannabinoid rendszer végigkíséri az életünket, nélküle nincs megtermékenyülés és terhesség. Osi és alapveto fontosságú szabályozó rendszert alkotnak a biokémiai, genetikai, élettani, és kórélettani folyamatokban. Az alvás-ébrenlét ciklust szabályozó szerepük vagy a fájdalomküszöb emelése csak a jéghegy csúcsa. Manapság jövünk rá, hogy a súlyos pszichiátriai, neurológiai, onkológiai és immunológiai kórképekben a kannabinoid rendszer valóban "ápol": potens gyógyszerek kifejlesztése várható a közeljövoben. A specifikus kannabinoid kötohelyek az állatok legtöbb osztályában megtalálhatóak a csalánozóktól kezdve 251. Ám 13 évvel az elso (CB 1 ) és 10 évvel a második (és ezidáig utolsó, CB 2 ) emlos kannabinoid receptor felfedezése és megklónozása után egyre nehezebb eligazodni a kannabinoid ismeretanyagban, s egyre több érdekes kérdés merül fel. Ezek egy része új receptorok meglétét feszegeti, mások pedig egyre több összefüggést, átfedést találnak más hírvivo rendszerekkel. Szükség van tehát egy objektív, szélesköru összefoglalóra, hogy a saját eredményeink tudományos értékét az olvasó jobban el tudja helyezni az eklektikus, rendkívül heterogén, néha egymásnak ellentmondó szakirodalomban. Ezért a bevezetésben az általános nézeten felül egy kissé bovebb, szintetikusabb összefoglalót láttam szükségesnek. Az acetilkolin résztvesz a neuroneuronális, neuromuszkuláris, neuroepitéliális stb, ingerületátvitelben. Metabotróp (muszkarinos) és gyors ionotróp (nikotinos) receptorai is ismertek. E tézisben a központi idegrendszer nikotinos acetilkolin receptoraival (nachr) kapcsolatos ismeretanyagon túl nem tárgyaljuk a kolinerg rendszert. A dohányzás okozta egészségkárosodás a nikotin centrális nach receptorokon eloidézett igen eros addiktív hatása miatt alakul ki. De káros hatásai mellett a nikotin számos pozitív tulajdonsággal is rendelkezik. A kognitív funkciókat serkenti, a neurodegeneratív betegségekben preventív lehet, és citoprotektív tulajdonságai is ismertek. A nach receptorok szerepe a központi idegrendszerben nem teljesen ismert, de az Alzheimer-kór kutatása megnyitotta Pandora szelencéjét. Az újabban megismert 8

9 nikotinos receptortípusok már messze vannak a klasszikusan megismert nach receptoroktól, összeépülhetnek más, például szerotonin receptor alegységekkel is, keresztbe aktiválhatóak vagy gátolhatóak más transzmitterekkel is. Például az antidepresszánsok hatásmechanizmusában egy újkeletu elmélet szerint nem a monoaminerg, hanem a nikotinerg teória magyarázhat meg eddig kevéssé értelmezheto jelenségeket. E doktori tézis tárgyát e két rendszernek a hippokampális és striatális neuronok muködésének szabályozásában kifejtett szerepe képezi. A hippokampusz a magasabbrendu agymuködésben, elsosorban a memória és bizonyos limbikus folyamatok szabályozásában játszik szerepet, és mélyen érintett a neurodegeneratív és pszichiátriai betegségekben, illetve az epilepsziában. Jól körülírt, könnyen vizsgálható agyterület, mely morfológiailag és funkcióját tekintve is talán a legjobban jellemzett struktúra a kisagy mellett. Bemenetei, kimenetei, az ot felépíto sejtek és azok belso kapcsolatai, szubrégiókon belüli eloszlásai mind fiziológiailag, mind neurokémiailag, mind morfológiailag részletesen definiáltak 115,352. Talán ezért is könnyebb kiértékelni a hippokampuszon végzett kísérletek eredményeit. A nikotinerg és a kannabinerg rendszer több ponton összefügg, sok érdekes felfedeznivalót kínálnak. A nikotinaddikcióért például részben a kannabinerg rendszert teszik felelossé. A kannabinoid rendszer gátló metabotróp receptora és a nikotinerg rendszer egy érdekes tulajdonságú, serkento ionotróp receptora, melyek expressziója ráadásul átfedést mutat a hippokampusz interneuronjaiban, számos patofiziológiás folyamatban vesz részt. A KANNABINOIDOK FARMAKOLÓGIÁJA A kannabinoidok hatása in vivo In vivo az exogén kannabinoidok akut alkalmazása a szomatikus és a vegetatív muködés megváltozásának egy jellegzetes spektrumát váltja ki 169. Ilyen például a katalepszia, az analgézia, a spontán aktivitás és a testhomérséklet csökkenése 6, vagy a memóriafolyamatok akadályozása 178. A krónikus hatások közül megemlíthetjük a testtömeg növekedését (fokozott táplálékbevitelt) eloidézo hatásukat, amit mind az exogén, mind az endogén kannabinoidok esetén bizonyítottak 69. Az étvágyfokozó és 9

10 antiemetikus hatásukat hatásukat a rák- és AIDS-betegek gyógyításában kamatoztatják (Marinol, Dronabinol, Roxane Laboratories és Cesamet (Nabilone, Eli Lilly). A marihuánás cigaretta alkalmazásával a rákos betegeknél testsúlynövekedést és a fájdalom csillapodását érték el. A kannabinoidok ezen tulajdonságai önmagukban is remek segítség lenne a rák elleni harcban - mint tüneti kezelés. Érdekes módon azonban a kannabinoidok a daganatos sejteket is elpusztítják bizonyos körülmények között 125. A kannabinoid rendszer jelen ismereteink szerint néhány kannabinoidokat köto receptorból, számos zsírsav eredetu ingerületátvivo molekulából, feltételezhetoen egy visszavételi rendszerbol és többféle bontóenzimbol áll. A kannabinoidok hatásának hátterében álló receptorok Az ismert (megklónozott) kannabinoid receptorok száma ketto 105, de beszélnünk kell a vanilloid receptorról is a késobb ismertetettek miatt. Tekintve, hogy az 1964-óta ismert kannabinoid hatású vegyületek mind lipofil molekulák 126, általános nézet volt eleinte, hogy e vegyületek nem szelektív módon és helyen hatnak. Úgy hitték, hogy hasonlóan az alkoholhoz és az oldószerekhez, a membránfluiditást befolyásolva megváltoztatják a sejtek, elsosorban az idegsejtek muködését, és ily módon fejtik ki a tudatmódositó hatásukat 283. A 80-as évek közepén derült ki, hogy a kannabinoid vegyületek szterospecifikusan és helyspecifikusan hatnak, és a membránra felkötött agonista leszorítható egy másik liganddal. Devane és munkatársai bizonyították eloször a kannabinoid kötohelyek létét 80. Az elso kannabinoid receptort (CB 1 ) 1990-ben klónozták meg patkányból 246, majd 1991-ben emberbol 131, amit nem sokkal a második receptor (CB 2 ) felfedezése követett egy humán promielocita leukémia sejtvonalból, a HL60- ból 194,266. A közös e két receptorban az, hogy mindketto G i/o proteinnel kapcsolt 58, hét transzmembrán-szegmensu protein, és a sejtmembránban találhatóak. Legközelebbi rokonaik az ún. edg receptorok, amelyek szintén lipideket, például lizofoszfatidsavat és szfingozin 1-foszfátot kötnek 123. A CB 1 receptor A CB 1 receptor aktivációja gátolja az adenilciklázt, az N- és P/Q-típusú kalcium csatornák és az M- és D-típusú kálium csatornák áramait, emellett serkenti a befelé egyenirányító és az A-típusú kálium csatornákat 77,105,176,177,230,231,264,287,

11 Megindíthatják a protein-tirozin foszforilációt focal adhesion kináz (FAK) útján 78, és aktiválhatják a mitogén-aktiválta proteinkináz (MAP-K) útvonalat 35. Mind a gerinctelenek, mind a gerincesek idegrendszerében a CB 1 receptor aktivációja nitrogénmonoxidot szabadíthat fel 178,325. A CB 1 receptorok a gátló G i és G o proteinek legalább hat altípusát aktiválják, amin keresztül egy igen kiterjedt intracelluláris kommunikációs útvonalat képesek befolyásolni 295. Kevéssé ismert, hogy a CB 1 receptor aktiváció arachidonsavat szabadíthat fel, és bezárhatja az 5-HT 3 receptor ioncsatornáját 287. Emellett bizonyos feltételek megléte esetén a CB 1 receptor képes G s proteineken keresztül camp akkumulációt is kiváltani, ha a 2-es, 4-es vagy 7-es típusú adenilátcikláz van jelen 50,137, és/vagy csökkenteni az outward kálium áramot, feltehetoleg arachidonsavon keresztül stimulálva a proteinkináz C-t 158. A CB 1 receptor aktiválhatja a foszfolipáz C-t a G a -alegységen keresztül 171. Gátolhatja az L-típusú kalcium csatornákat a macska kisagyi artériáinak simaizomsejtjeiben 130. Egy másik új felfedezés szerint a CB 1 receptorok a kisagyi szemcsesejt kultúrában foszfolipáz C-n keresztül serkentik az NMDÁ-val kiváltott, inozitol-1,4,5-trifoszfáton keresztüli kalcium-felszabadulást az intracelluláris raktárakból 272. A CB 1 receptor aktivációja a szfingomielinázokon keresztül a szfingomielin ceramiddá és foszforilkolinná történo hidrolízisét indukálja. A ceramid közismert apoptózist és géntranszkripciót megindító hatása már komoly figyelmet kapott. A ceramid az egyik kulcsa lehet az Alzheimer-kór során fellépo neuronvesztésnek 139. A legfontosabb folyamatok összegzése az 1. ábrán látható. Endokannabinoidok 1. ábra. A CB 1 receptor Ca 2+ anandamid 2-AG noladinéter legfontosabb szignalizációs kapcsolatrendszerei. 2-AG: 2- arachidonoil-glicerol; AC: N P Q G i CB 1 G i AC adenilátcikláz; NOS: nitrogénmonoxid szintáz; FAK: focal adhesion kinase; IEG: K + NOS ATP immediate early genes; MAPK: mitogén-aktiválta FAK IEG camp protein kináz; N, P, Q: MAPK kálcium csatorna típusok. 11

12 Már régóta ismert, hogy a kannabinoidokkal szemben egy ido után tolerancia lép fel a laboratóriumi állatokban 1 és emberben is 174. Az akut hatás csökkenése annál gyorsabb és erosebb, minél potensebb az agonista (pl.: CP55940 > levonantradol >?9-THC). A specifikus CB 1 receptor antagonista SR141716A szisztémás adagolásakor a?9-thc-ra toleráns állatokban kannabinoid-függoséget lehet kiváltani 2. Nemrégiben bizonyítékokat szolgáltattak a marihuana-élvezok fizikális függoségére is 160. Mindezek hátterében az áll, hogy a krónikus kannabinoid kezelés (pl.?9-thc-vel) bizonyíthatóan csökkenti a kannabinoid-kötés mértékét és a kannabinoidok által kiváltott G-protein aktivációt is az agyban 39,40,303. Sejtkultúrában krónikus kannabinoid kezelés hatására elobb a CB 1 receptor deszenzitizálódása és/vagy a G-proteinekkel való kapcsolat megszunése figyelheto meg, majd ezt követi a receptorok internalizálódása 127,199. Ezzel kapcsolatos egy további érdekes megfigyelés is, ám az már átvezet minket a még feltáratlan kannabinoid receptorok/funkcionális kötohelyek témakörébe. A CB 1 receptorok megjelenése patkányban a 11. embrionális napon, illetve emberben a 14. embrionális hétben történik 31,44. A kannabinoid-hatás (azaz a kiváltott viselkedésmintázat) fokozatosan alakul ki a fiatal állatok érésével 118, ami jól korrelál a posztnatálisan idoben elorehaladva növekvo mennyiségu CB 1 mrns-sel és agonista kötohellyel 250. Más tanulmányok arra is utalnak, hogy a kannabinoid receptorok a fejlodés során olyan helyeken is megjelennek, ahol felnott korban már nem detektálhatók 29. Mindez akkor válik fontossá, amikor az embrionális korban kinyert idegsejt-tenyészetben észlelt eredményeket vetjük össze a felnott állatokban mért adatokkal. A CB 1 receptor legjellemzobb elofordulási helye a központi és környéki idegrendszer neuronjai. Az autoradiográfiás kötodési vizsgálatok és az in situ hibridizációs kísérletek szerint legnagyobb suruségben az agykéregben, a hippokampuszban, a nucleus caudatusputamen régióban, a substantia nigra pars reticulatában, a globus pallidusban, a nucleus entopeduncularisban és a kisagykéreg molekuláris rétegében találjuk meg a receptort 287,289. Ez összhangban van a kannabinoidok okozta jellegzetes kognitív és motoros zavarokkal. A kannabinoidok analgetikus tulajdonságait az magyarázza, hogy a fájdalomérzo pályák is surun ellátottak a receptorral mind a gerincveloben, mind az érzoneuronok perifériás végzodésein 288. A receptor emellett szinte mindenütt megtalálható, például a szívben, a vaszkuláris endotéliumban, a tüdoben, a reprodukciós szervekben, a vas deferensben, a vékonybélben, a mellékvesében, a csontveloben, a 12

13 lépben, a tímuszban és az immunsejteken 37,38,51,124,129,166,168,194,233,234,245,246,275,312. Érdemes megemlíteni, hogy a rendkívül eros jelölodésu területeken a kutatók becslései szerint a kannabinoid receptor surusége nagyságrendileg elérte a GABA és glutaminsav receptorok mennyiségét. A CB 1 receptor génjének transzkriptjei különbözhetnek szövettol függoen. A C57BL/6 egér agyában háromféle splice-variánst lehet találni, míg az ICR és a DBA/2 egértörzsek agyában csak egyet 280. Shire és munkacsoportja emberi tüdo cdns-könyvtárából izolálta a CB 1A splice-variánst 318. A teljes hosszúságú humán CB 1 receptort 472 aminosav építi fel, míg a splice variánst csak 411. Azonban a CB 1 A variáns farmakológiailag nem sokban különbözik az eredeti receptortól, és kifejezodése sem jelentos. A CB 2 receptor A CB 2 receptor 68% homológiát mutat a CB 1 receptor transzmembrán részeivel, és 44% az egyezés a kettejük teljes aminosav-sorrendje között. Aktivációja szintén gátolja az adenilciklázt és aktiválja a MAP-K útvonalat, illetve a Krox-24 kaszkádrendszert 36, de az ioncsatornákat közvetlenül befolyásoló hatása nem ismeretes 105. A gerincesek és a gerinctelenek immunrendszerében a CB 2 receptor aktivációja nitrogén-monoxidot szabadít fel 178,325. A CB 2 eloszlása viszont limitált, ez idáig úgy tunt, hogy exkluzívan az immunrendszerben és az immunrendszerrel kapcsolatban álló sejteken, illetve a lépben expresszálódik, de az idegrendszerben nem 44,226,266. Ez lehet a magyarázat a marihuana régóta ismert immunszuppresszív hatására. Mostanában azonban felmerül a CB 2 receptor neuronális expressziójának a gondolata is 184,267,281,320,322,370. A kérdés végleges eldöntése rendkívül fontos lenne. Kannabinoid ligandok A kannabinoid molekulák a jelenlegi osztályozásuk szerint legalább nyolc fo csoportra oszthatóak, és az új alapvegyületek, azaz az ebbol eredo csoportok száma csak növekszik. Most hat csoportot mutatunk be. Ezek az: A. endokannabinoidok (amid, éter, észter és zsírsav típusúak) B. klasszikus kannabinoidok C. nem-klasszikus és hibrid kannabinoidok 13

14 D. szintetikus eikozanoidok E. aminoalkilindolok F. diarilpirazolok Meg kell jegyeznünk azt is, hogy az említett endokannabinoidokhoz hasonló vagy azoktól eltéro szerkezetu olyan ismert endogén molekulák száma is növekszik, amelyek nem kötnek a CB 1 vagy a CB 2 receptorhoz, és mégis kiváltják a fontosabb kannabinoid-hatásokat. Ezeket itt bovebben nem taglaljuk. Bár 30 évvel megelozi az endokannabinoidokat a kannabinoid hatású exogén anyagok felfedezése, de az endokannabinoidokat célszerunek láttam elsoként tárgyalni. A következoekben tehát az ismert endogén ligandokról, a kulcsvegyületnek számító?9-thc-rol, illetve az általunk használt szintetikus vegyületekrol lesz szó. Kannabinoid receptor agonisták A) Endokannabinoidok Az endokannabinoidok négyféle típusba sorolhatóak jelenleg: a zsírsavak amid, éter, észter konjugátumai, és a nem konjugált zsírsav típusú endokannabinoidok. A két, leginkább széles körben vizsgált és elfogadott endogén kannabinoid receptor agonista az N-arachidonoil-etanolamid (AEA vagy anandamid) és a 2-arachidonoil-glicerol. Anandamid Elsoként az amid típusú anandamidot fedezték fel 81. Nevét a szanszkrit ananda - "boldogság" szó után kapta, ugyanis viselkedésbiológiai vizsgálatokban nagy mértékben utánozza a?9-thc hatásait 117. Az anandamid elsoként megismert endogén szintézise szerint depolarizáció hatására enzimatikus úton képzodhet arachidonsavból és etanolaminból 79. Az enzim a hippokampuszban mutatja a legnagyobb aktivitást, míg a legalacsonyabbat a kisagyban és a medullában 79. Receptoron keresztül kiváltott Ca 2+ - beáramlás, a foszfolipáz-a 2 aktivációja és az arachidonsav felszabadulása mind aktivátora az anandamid-szintáznak 104,266. Mint aztán utólag kiderült, az anandamidszintáz ekvivalens az anandamid bontóenzimével, a FAAH-val (l.o.). Ennél jelentosebb szintézis-útvonalnak bizonyult, hogy N-arachidonoilfoszfatidil-etanolaminból 14

15 depolarizáció hatására egy foszfodiészteráz enzimatikus hasítással szabadítja fel az anandamidot 85. Egy nagyon hasonló reakcióút is ismert: foszfatidilkolin és foszfatidiletanolamin keresztreakciójából N-acil-foszfatidiletanolamin jön létre, amit a foszfolipáz-d hasít anandamiddá és foszfatidsavvá 72. Az anandamid relatíve nagy affinitással (K i = nm) kötodik a patkányagyból izolált membránokhoz, a megklónozott patkány és az emberi CB 1 receptorhoz 81,104. Az anandamid interakcióba lép mind a CB 81 1, mind a CB 2 receptorral 104, de eltéro disszociációs állandóval rendelkezik a két receptoron (CB 1 : 72 nm, CB 2 : 2 µm). Ugyanakkor a forskolinnal stimulált camp termelodés gátlása során mért EC 50 érték a humán CB 1 receptoron 444 nm, míg a CB 2 receptoron nagyobb, mint 10 µm. A CB 1 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva EC 50 = 276 nm-t kapunk egér kisagyi membránban 170. Ráadásul a hatásmaximuma csak 75%-a a lentebb tárgyalt potens agonistákénak. Ez utóbbi adatok azt sugallják, hogy az anandamid nem a "legfontosabb" endogén ligandja a CB 1 receptornak, és nem ligandja a CB 2 receptornak. Az anandamid szöveti koncentrációja nem haladja meg a pmol/kg friss szöveti tömeget arachidonil glicerol Az elsoként megismert észter típusú endokannabinoid a 2-arachidonil glicerol (2-AG, kutya tápcsatornából 253 és sertésagyból 329 izolálva). Bár sem az anandamid, sem a 2-AG nem mutat nagy affinitást a CB 1 és a CB 2 receptor iránt, mindketto megfelel a neuromodulátorok kritériumainak 87. A rágcsálók agyában már az embrionális korban megtaláljuk az endokannabinoidokat. Az anandamid szintje ekkor még három nagyságrenddel alacsonyabb, mint a felnott állatokban, míg a 2-AG szintje állandó a felnottkorig, csupán a posztnatális élet elso napján ad kiugró értéket 29. Az anandamid szintje tehát körülbelül ezerszer alacsonyabb a 2-AG koncentrációjánál a központi idegrendszerben, és csupán parciális agonista a CB 1 és CB 2 receptorokon a 2-AG-hez képest. Ezért nemrégiben általánosan elfogadott nézetté vált, hogy a CB 1 és CB 2 receptorok 2-AG receptorok 330. A 2-AG K i értéke a két receptoron 472 and 1400 nm. Noladinéter A 2-AG további egy további enzimreakció kiindulási pontja lehet. Az éterezési folyamat során képzodik a 2-arachidonoil-glicerol-éter vagy noladinéter. Elso izolációja sertésagyból történt, bár a noladinétert régóta használták mint szintetikus CB 1 -szelektív 15

16 agonistát nem tudván, hogy ez egy endokannabinoid 162. Az elozo két endokannabinoiddal szemben nem agonistája a CB 2 receptornak (K i > 3 µm), de a CB 1 - en a disszociációs állandója igen alacsony, csupán 21 nm patkányban. Egérben kiváltja a kannabinoidokra jellemzo tüneteket: szedációt, hipotermiát, a tápcsatorna mozgásának gátlását, és a fájdalomküszöb emelkedését. A régóta ismert 1-alkil-glicerol-éterek számtalan típusa vesz részt az összes élolény alapveto fiziológiás és patofiziológiás folyamataiban. Érdekes, hogy a noladinéter az elso felfedezett 2-alkil-glicerol-éter. Csak a 2002-ben került fel az endokannabinoidok listájára 43,108. N-arachidonoil-dopamin Az N-arachidonoil-dopamin (AA-DA, NADA) egyrészt az amid típusú endokannabinoidok körébe tartozik, másrészt az endogén hírvivok egy új családjába, a nemrégiben felfedezett arachidonoil-aminosavak csoportjának is tagja. Ilyen vegyület például az arachidonoil-glicin, aminek receptora egyelore nem ismert (a CB 1 -re és a CB 2 -re nem köt), de meglepo módon néhány kannabinoid hatást, például analgéziát kivált in vivo 179. Ezzel szemben a NADA aktiválja a CB 1 receptort (K i = 500 nm), és a vanilloid receptor egyik legpotensebb endogén agonistája (l.o.), de nem aktiválja a dopamin D 1 és D 2 receptorokat 180. A másik fontos rokon vegyületrol, az OLDÁ-ról a vanilloidok körében ejtünk szót, mert annak a CB 1 receptoron mutatott 1,6 µm-os K i értéke nem feltételez jelentos kannabinoid funkciót. Dokozatetreniletanolamid A dokozatetreniletanolamid (DEA) potens amid típusú endokannabinoid (anandamid analóg). A CB 1 receptor aktivációját mikrogliában mutatták ki eloször. A patkány szinaptoszómális membránjához nagy affinitással köt (K i = 34 nm). In vivo kannabimimetikum 163. Palmitoil-etanolamid A palmitoil-etanolamid (PEA) szintén enzimatikus úton képzodik palmitinsavból és etanolamidból számos szövetben 19. Csupán a CB 2 receptor valószínu agonistájaként tartják számon, és a CB 2 receptorokat hordozó immunsejtek aktivitását gátolja, emellett analgetikus hatású. Mégis, antikonvulzáns tulajdonságot is mutat, holott elvileg az agyban nem található receptora 52,

17 A dihomo-?-linolénsav, adrenénsav, és konjugátumaik A dihomo-?-linolénsav és az adrenénsav a nem konjugált zsírsavak közé tartozik. Az anandamidhoz hasonló hatáserosséget mutatnak mind a humán CB 1 receptorhoz való kötodésben, mind a camp képzodés gátlásában 178. Az etanolamidjaikat sertés agyában kimutatták, de a dihomo-?-linolil-etanolamid az anandamidnál kisebb hatékonysággal gátolja az N-típusú Ca 2+ -csatornákat. Szerepük nem ismert. Virodhamine A virodhamine (O-arachidonil-etanolamin) szintén az észter típusba tartozik, az arachidonsav etanolamin-észtere (az etanolamin "fordítva" kötodik az arachidonsavra, mint az anandamid esetében). Ennek megfeleloen eléggé fonák tulajdonságai vannak. Koncentrációja az agyban egyezik az anandamidéval, míg perifériásan, azokban a szövetekben, ahol CB 2 receptor is kimutatható (pl. szívpitvar), akár kilencszerese is lehet az anandamidénak. A CB 2 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva EC 50 = 1,4 µm-t kapunk, de a maximálisan kiváltott válasza egyezik az anandamidéval. A CB 1 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva EC 50 = 1,9 µm-t kapunk, és az anandamid maximális hatásának csak a 60%-t mutatja. Érdekes módon azonban 930 nm-os IC 50 értékkel gátolja az anandamid hatását a CB 1 receptoron. Ugyanígy in vivo körülmények közt csökkenti az anandamid által kiváltott hipotermia mértékét, még annak figyelembe vétele nélkül is, hogy lassítja az anandamid metabolizmusát. Önmagában adva viszont - ahogy aktiválja a CB 1 receptort is in vitro - hipotermiát vált ki 294. Az ismeretlen peptid ligand Az említés szintjén érintjük, hogy az utóbbi tíz évben számos bizonyíték gyult össze egy depolarizáció- és Ca 2+ -függo módon felszabaduló, savval, vízzel extrahálható és proteázokra érzékeny CB 1 receptor agonista létezésére is 242. B) Klasszikus kannabinoidok A klasszikus kannabinoidok triciklikus terpénszármazékok, amelyek benzopirán gyökkel is rendelkeznek. Ide tartozik minden, a Cannabis sativából nyerheto, kannabinoid receptorokat aktiváló farmakon. Erre a kémiai szerkezetre alapozva számos 17

18 új molekulát állítottak elo.?9-tetrahidrokannabinol (?9-THC) A?9-THC mindkét kannabinoid receptorhoz egyforma erosséggel köt. A két receptoron a K i értéke egyaránt 40 nm. A CB 1 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva kapott EC 50 érték 74 nm-nak bizonyult, ugyanakkor a hatásmaximuma csupán 1/5-e a késobbiekben tárgyalt potens, szintetikus ligandokénak 39. Érdekes, hogy balra forgató THC változatok aktiválják a kannabinoid receptorokat, míg a kannabidiolok esetén ez fordítva igaz 178. C) Nem klasszikus kannabinoidok A klasszikus kannabinoidok benzopirán gyuruje kicserélheto nyílt fenol vagy rezorcinol analógokra. Igy jutott el a Pfizer az igen potens nem klasszikus kannabinoidok alapvegyületéhez 221. CP55940 A CP55940 affinitása a két receptorhoz igen nagy (K i = 0,5 nm a CB 1 -en és 2,8 nm a CB 2 -n 170. A forskolinnal stimulált camp termelodés gátlása során mért IC 50 érték a humán CB 1 receptoron 2,5 nm, míg a CB 2 receptoron 2,8 nm 170. A CP55940 az egyik legpotensebb, kereskedelemben elérheto kannabinoid receptor agonista. A hibrid kannabinoidokról ritka alkalmazásuk miatt most nem ejtünk szót. D) Szintetikus eikozanoidok E csoport tagjai az anandamid szerkezetének további finomítása során jöttek létre. R-metanandamid Az R-metanandamid (AM356) alacsony nanomólos koncentrációban egy CB 1 receptorra szelektív ligand. A receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva kapott EC 50 = 74 nm, K i értéke a CB 1 -en 20 nm, míg a CB 2 -n 815 nm. Ugyanakkor a hatásmaximuma a CB 1 -en ¾-e más potens, szintetikus ligandokénak 39,142. Fontos tudni, hogy a tulajdonságai nem maradnak el az anandamidétól, de nem kerül 18

19 metabolikus útra, tehát az anandamid helyett elonyösebb ezt használni. Arachidonil-2-klóretilamid Az arachidonil-2-klóretilamid (ACEA) K i értéke 1,4 nm a CB 1 és 3100 nm a CB 2 receptoron. A forskolinnal stimulált camp termelodés gátlása során mért IC 50 érték a humán CB 1 receptoron 4,5 nm, míg a CB 2 receptoron > 10,000 nm. Ezzel a jelenleg létezo legszelektívebb CB 1 agonistát állította elo Hillard munkacsoportja, pedig "csak" az anandamid hidroxilgyökét cserélték ki egy klóratomra 170. A CB 1 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva kapott EC 50 = 51 nm 170. E) Aminoalkilindolok A Sterling Winthrop által kifejlesztett, eredetileg gyulladáscsökkentonek szánt molekulák tartoznak ide. WIN A WIN a legszélesebb körben alkalmazott kannabinoid receptor agonista, K i értéke 4,4 nm a CB 1 és 1,2 nm a CB 2 receptoron. A CB 1 receptoron keresztüli [ 35 S]GTP?S-kötést stimuláló hatását vizsgálva EC 50 = 120 nm-t kapunk egérben 170. A népszerusége abban rejlik, hogy hatásmaximumában rendre 10-15%-kal magasabb értékeket produkál, mint a CP55940 vagy az ACEA. Nem gátolja a FAAH-t 74,104,147,200. Kannabinoid receptor antagonisták/inverz agonisták F) Diarilpirazolok A jelentos számú antagonisták közül két fontosat emelek ki, amelyeket a kísérleteinkben is használtunk. SR141716A Az SR141716A (Rimonabant ) a Sanofi Recherche molekulája, és jelenleg pszichiátriai/neurológiai betegségek (Alzheimer-kór, skizofrénia és addikciók (etanol, nikotin, kokain, stb)), illetve kóros elhízás kezelésében klinikai tesztsorozatban szerepel. 19

20 A leggyakrabban használt és az egyik legfontosabb kannabinoid ligand, ezért érdemes elidozni mellette. Rendkívül potens és szelektív CB 1 receptor antagonista 301, in vivo és in vitro kísérletekben is meggátolja a a CB 1 receptor által közvetített hatásokat. In vivo serkenti a memóriát 337, de alacsony és közepes dózisban nem vált ki változást a kísérleti állatok viselkedésében, míg nagy dózisban motorstimuláns hatású, ami lehet akár CB 1 receptortól független folyamat is 65,299. Ismeretes, hogy gátolja a FAAH-t, az endokannabinoidok egyik bontóenzimét is 200. K i értéke 11,5 nm a CB 1 -en, míg a CB 2 receptoron 1,6 µm. Meg kell jegyeznünk azonban azt, hogy mint általában a metabotróp receptorok antagonistái, az SR141716A sem csöndes, azaz inverz agonista tulajdonságokkal rendelkezik. Ez egyrészt a konstitutívan aktív receptorok kiiktatása révén léphet fel, de más elméletek is léteznek ezzel kapcsolatban 134,182. Emellett tudjuk azt is, hogy 5 µm feletti koncentrációban nem specifikusan gátolja a CB 2 receptort, a feszültségfüggo Ca 2+ -csatornákat 362, és már 1 µm-ban 8%-ban gátolja a K Ca -csatornákat (a maximális gátlás 10 µm-nál látható: 60%, IC 50 = 4 µm 46,362 ). Ennek megfeleloen az SR141716A általánosan elfogadott CB 1 receptorra szelektív maximális koncentrációja 1 µm in vitro kísérletekben. Az SR141716A antagonizmusával kapcsolatban is megoszlanak a vélemények. Bár a WIN és az SR141716A disszociációs konstansa nagyjából egyezik, patkány kisagyi membránpreparátumban a WIN szörös affinitással szorítja le a felkötött [ 3 H]WIN t a felkötött [ 3 H]SR141716A-val szemben, azaz nem egyforma módon ismeri fel a két ligand a kötohelye(ke)t 290. Elképzelheto tehát, hogy nem csak a CB 1 receptor az egyedüli kannabinoid kötohely az agyban. AM251 Az SR141716A továbbfejlesztett változata az AM K i értéke 7,5 nm a CB 1 receptoron, és az SR141716A-nál kétszer szelektívebb a CB 1 -re. Az ára azonban ennek az, hogy a CB 2 receptoron is inverz agonista tulajdonságú lett, bár nem antagonistája eme receptornak 273. A kannabinoidok inaktiválása Mint általában a hírvivo molekulák esetében, a kannabinoidok számára is léteznie kell visszavételi rendszernek és lebontó enzimeknek. Mostanáig úgy tudtuk, hogy az 20

21 anandamidot nagy sebességu transzporter veszi fel (K m = 0,1-0,2 µm, V max = pmol/perc*mg protein) 26,229. Magas arachidonsav-koncentráció gátolja az anandamid transzporter (ANT) muködését, míg a nitrogén-monoxid 70%-kal is képes növelni azt. Egy friss közlemény azonban azt taglalja, hogy mégsem létezik anandamid transzporter. Az összes ANT gátlószer (arvanil, olvanil, AM404, VDM11) csupán az anandamid bontóenzimének gátlószere, és az endokannabinoidok pusztán diffúzióval haladnak át a membránon 136. Az anandamid a citoszólba kerülés után vagy a lentebb ismertetett módon a VR 1 receptoron fejti ki hatását, vagy metabolikus útra kerül. Lebontó enzimei a zsírsavamidhidroláz (fatty acid amide hydrolase, a továbbiakban FAAH 71 ), és a monoacilglicerollipáz (MAG lipáz). A FAAH-t testszerte megtalálhatjuk (például a májban 71, vagy a központi idegrendszerben 340,344. A FAAH a hippokampuszban és a kisagyban a principális sejtekben mutatható ki inkább, míg a CB 1 receptor a principális sejtet innerváló interneuronon 98,343. Az emberi FAAH egy 67 kda-os protein 2 µm-os K m értékkel, és 800 pmol/perc*mg protein V max értékkel 229. A MAG lipázt régóta ismerjük mint citoszolikus szerin-hidrolázt, ami a 2- és 1- monoglicerideket zsírsavra és gliceridre bontja 141,195. A kannabinoidok metabolizmusában kifejtett szerepére úgy derült fény, a FAAH gén kiütése után is mérheto volt 2-AG metabolizmus az egerekben 217. A megklónozott MAG lipáz egy 33 kda-os, 303 aminosavból álló enzim 93. Úgy gondoljuk, hogy a FAAH-nál fontosabb bontóenzime a 2-AG-nek. Eloszlása sejttípusonként és szubcelluláris szinten is variál a központi idegrendszerben, és korrelál a CB 1 receptorok eloszlásával. Az endokannabinoidok a többszörösen telítetlen zsírsav (arachidonsav, linolénsav, stb) eredetük okán szubsztrátjai a lipid-oxigenázoknak is. Aktuálisan tucatnyi lipid-oxidázról tudjuk már, hogy inaktiválják az endokannabinoidokat, és kiindulási pontul szolgálnak újabb endogén hírvivo molekulacsaládok szintéziséhez. Mivel a rendszer elég bonyolult, csak két fo példát emelek ki: A prosztaglandin-endoperoxid-szintáz (COX-2, indukálható neurális és immun ciklooxigenáz) az anandamidot prosztaglandin-etanolamiddá alakítja, míg a 2-AG-ból prosztaglandinok és hidroxieikozatetraénsavak glicerol-észtereit hozza létre 205,368. A nem-hem típusus ferroproteinek csoportjába tartozó lipoxigenázok (LOX) többsége is metabolizálja az anandamidot és a 2-AG-t 262,348. A leukocita típusú 12-LOX, a humán 15-LOX-1 és a 15-LOX-2 a 2-AG-t többféle termékké, például 15(S)-hidroperoxi- 21

22 eikozatetrénsav-gliceril-észterré, 15(S)-hidroxieikozatetrénsav-gliceril-észterré (ami a peroxisome proliferator-activated receptor-a - egy sejtdifferenciációt megindító receptor - agonistája), vagy 12(S)-hidroperoxieikozatetrénsav-gliceril-észterré (ami egy katalitikus lépés után a vanilloid receptor agonistája lesz) alakíthatják. A továbbiakban érdemes figyelembe venni, hogy a COX-2 gátló gyógyszerek egyik hatása az, hogy az analgetikus endokannabinoidok inflammatorikus lipidekké történo átalakulását gátolják. A VANILLOIDOK FARMAKOLÓGIÁJA Napjainkban nyilvánvalóvá vált, hogy már szemellenzovel sem lehet megfeledkezni a kannabinoid rendszer tárgyalásakor a vanilloidokról. Jelenleg egy megklónozott receptor, és számos, a kannabinoidokkal szorosan összefonódó ligand alkotja e családot. A vanilloid receptor (VR 1 ) A VR 1 egy nem szelektív, ligand vezérelt kation csatorna. Újabban a transient release potential channel család vanilloid 1-es típusú receptorának kategorizálják (TRPV 1 ) 83. A legnagyobb mennyiségben a perifériás C és Ad érzorostokban fejezodik ki, de számos agyterületen is megtalálható. A receptor megklónozása 1997-ben történt 54. Érdekes módon a receptor ligandkötohelye intracelluláris. A VR 1 ioncsatornáját az alacsony ph, a ho, és az erospaprika csípos ízéért felelos kapszaicin, vagy az Euphorbia resiniferában található resiniferatoxin is képes megnyitni 3,54,334. Mivel az agyban nyilván nem a ho vagy a közeg savanyodása a csatornanyitó tényezo, ezért endogén ligandok után kutatva néhány igen érdekes felfedezésre került sor. A lipid mediátorok közül például az eddigiekben csak a kannabinoid rendszer kapcsán emlegetett anandamid és néhány lipoxigenáz származék is képes aktiválni a vanilloid receptort, bár kisebb hatáserosséggel 374. Ennek az az oka, hogy bár rendelkeznek a szükséges telítetlen acilgyökkel, de nincs vanillilamin gyökük 76. Az emlos idegrendszerben ez utóbbi gyökbol csak kétféle fordul elo: a dopamin, és annak 3-O-metil-származéka: a homovanillilamin. 22

23 Vanilloid ligandok N-oleoil-dopamin (OLDA) A VR 1 receptor muködését legjobban intracelluláris Ca 2+ -szint méréssel lehet követni. Az OLDA az EC 50 = 36 nm értékkel vált ki kalcium-beáramlást a transzfektált sejtekbe, ami gyakorlatilag a kapszaicinével egyenértéku, és a legpotensebb endogén VR 1 agonista vegyület rangjára emeli. Ahogy fentebb említettük, a CB 1 receptoron gyenge agonista. Inaktivációjáról keveset tudunk. Mivel az OLDA és a NADA bejutása a sejtbe az intracelluláris VR 1 kötohelyhez segíti az agonistát, ez nem nevezheto inaktivációs lépésnek 59. N-arachidonoil-dopamin A NADA amellett, hogy a CB 1 receptor endogén agonistája, egy másik endogén kapszaicin-szeru vegyület az emlosök idegrendszerében. Legnagyobb koncentrációban a striátumban, a hippokampuszban és a kisagyban található, míg a legalacsonyabb koncentrációt a hátsó szarvi ganglionokban éri el. Képzodése valószínuleg az N-arachidonoil-tirozin enzimatikus konverzióján keresztül zajlik a tirozin-ß-hidroxiláz segítségével, de az arachidonoil-koenzim-a dopaminnal történo konjugációja sem zárható ki 180. A NADA enzimatikus inaktivációjában részt vesz a FAAH és a katekolamin-o-metiltranszferáz 71. A NADA natív és expresszált VR 1 receptorokon egyöntetuen potens, nm-os EC 50 értéket mutat a kapszaicinhez hasonló hatáserosséggel (EC 50 = 30 nm) és hatékonysággal. A NADA potens aktivátora a hátsószarvi ganglionokban és a hippokampuszban található VR 1 receptoroknak, amivel a gerincveloben substance P és CGRP felszabadulást vált ki, a hippokampuszban pedig az ún. paired-pulse-depressiont (errol bovebben a Megbeszélés szekcióban). A NADA és az OLDA intradermális adagolása hiperalgéziát okoz 59,180. Egyéb ligandok Több, kevésbé potens endogén agonistát is ismerünk: az N-arachidonoilhomovanillilamin (3-O-metil-NADA), a 12(S)-hidroperoxieikozatetrénsav, a retinoildopamin és az anandamid a nm-os koncentráció-tartományban aktív. Ugyanakkor létezik néhány VR 1 agonista hatású exogén vegyület is, ami a kannabinoid és vanilloid rendszer közti képzeletbeli tovább határt gyengíti. Ilyen például a NADA 23

24 rokonvegyülete, az arvanil, amelyik potens CB 1 és VR 1 agonista, illetve FAAH gátló, a specifikus ANT gátlónak tartott AM404, vagy a kannabidiolok, amelyek csak a kannabinoid receptorokra sztereoszelektívek 32,373. A VR 1 receptor legáltalánosabb ultrapotens antagonistái a jodoreziniferatoxin és a kísérleteinkben használt kapszazepin. BIZONYÍTÉKOK TOVÁBBI KANNABINOID HATÁSHELYEK MEGLÉTÉRE Hosszú ideig tartotta magát az a nézet, hogy a CB 1 receptor felelos az összes kannabinoid hatás közvetítésében a központi idegrendszerben. Ennek három bizonyítékát adták: 1) a különféle kannabinoid agonisták affinitása a CB 1 receptorhoz, illetve a hatékonyságuk a receptor aktiválásában szorosan korrelál a viselkedésbiológiai kísérletekben kifejtett hatásukkal 67 ; 2) a CB 1 receptor neuroanatómiai lokalizációja teljes átfedést mutat a különféle agyterületeken tapasztalható kannabinoid hatásokkal 38 ; és 3) a kannabinoidok idegrendszeri hatásainak a legtöbbje gátolható a CB 1 receptor antagonista SR141716A alkalmazásával 65. Az abnormális kannabidiol receptor Számos tanulmány azonban arról számolt be, hogy a kísérletekben tapasztalt kannabinoid hatás független volt a kannabinoid és a vanilloid receptoroktól is a periférián. Az anandamid és az CB 1 receptorra nem köto abnormális kannabidiol mezenterikus értágulatot vált ki, amit a szelektív CB 1 antagonista SR141617A, és a marihuana egyik nem-klasszikus hatóanyaga, a kannabidiol is gátol. A receptor meglétét emberben is és CB 1 /CB 2 dupla génkiütött egérben is bizonyították 24,189. Ezzel általánosan elismertté vált az ún. abnormális kannabidiol receptor, amit ugyan még nem klónoztak meg, de létét nem kérdojelezi meg senki, és szelektív ligandokat is szintetizáltak már hozzá a gyógyszergyárak (pl.: O-1602). A receptor cgmp-n és proteinkináz G-n keresztül fokozza a Ca 2+ -aktivált K + -csatorna muködését 24. Úgy tunik, ez az anandamiddal, R-metanandamiddal, eikozanoidokkal és bizonyos klasszikus kannabinoidokkal (de vanilloidokkal nem) aktiválható receptor felelos a marihuana számos akut keringési hatásáért. 24

25 A CB 2 -szeru receptor Calignano és munkatársai felfedezték, hogy a palmitoiletanolamid, bár mint fentebb említettük, nem köt a két kannabinoid receptorra, az egér lábába injektált formalin okozta fájdalmat gátolja 52,178. Mindez azonban kivédhetõ a CB 2 receptor szelektív antagonistájával, az SR cal. Az ún. CB 2 -szerû receptort megtalálták már az egér vas deferensében is 46. Egyelõre korai bármit mondani, mert esetleg a neuronokban indukálható CB 2 receptor, vagy a késõbb tárgyalt feltételezett CB 3 receptor vizsgálati eredményei konvergálhatnak a közeljövõben e receptor kutatásával. Egyéb ismeretlen hatáshelyek Az anandamid képes gerincveloi szinten analgéziát kiváltani, ami eltér a?9-thc vagy a CP55940 hatásától 175,360. Továbbá, néhány centrális hatása nem védheto ki a CB 1 receptor szelektív antagonistájával, az SR147161A-val 5. Néhány különbség az anandamid és a?9-thc hatásai között (például az anandamid sokkal rövidebb életideju hatást vált ki viselkedési tesztekben, és kevésbé potens 321, megmagyarázható az anandamid gyors metabolizmusával. Ugyanakkor ezzel nem magyarázható az, hogy a camp-szint befolyásolása, vagy a?-opioid receptor (ant)agonistái, illetve CB 1 receptor antagonista SR141716A csak a?9-thc analgetikus hatását modulálják 66,360. Sot, az anandamid alacsony koncentrációban gyengíti a?9-thc analgetikus hatását. Emellett minoségi különbséget is kimutattak a?9-thc és az anandamid szomatikus-vegetatív muködésre kifejtett hatásában kutyákban 219. Az áttörést a C57BL/6 egérbol generált, homozigóta CB 1 receptor "knockout" (CB 1 génkiütött) egér hozta 211,371. Kiderült, hogy ezekben az állatokban az anandamid továbbra is elnyomja a spontán aktivitást, illetve katalepsziát és analgéziát okoz, ugyanakkor a?9-thc inaktív volt a CB 1 génkiütött egerekben 84. Ugyanebben a tanulmányban elvégezték a [ 35 S]GTP?S kötés analízisét vad típusú és CB 1 génkiütött egerek agyából preparált membránokban. Az anandamid mindkét esetben pozitív választ váltott ki, míg a?9-thc csak a vad típusú egerek membránjaiban fokozta a [ 35 S]GTP?S kötést. A CB 1 receptor deszenzitizációját vizsgáló kísérletekben (lásd fentebb) feltunt, hogy az agyi membránok homogenizátumában a krónikus kannabinoid kezelés után a receptorszám csökkenése jóval nagyobb, mint a receptor aktivitásának (a kiváltott válasznak) a csökkenése 38,103. Ezt akkoriban a deszenzitizáció hiányával és a jelentos receptorszámmal próbálták magyarázni, de sokkal valószínubb, hogy az azóta nagy erokkel keresett "CB 3 receptor" aktivitása 25

26 téveszthette meg a kutatókat. A CB 3 receptor létére néhány tanulmány komolyabb figyelmet is vetett. Például az anandamid és a WIN egy nagyságrenddel alacsonyabb hatáserosséggel stimulálja a [ 35 S]GTP?S kötést CB 1 génkiütött egér agyi membránjaiban a vad típushoz képest, és nem függesztheto fel a hatás SR141716Aval 41,84. Ezenfelül az SR141716A (> 1 µm) gátolta a [ 35 S]GTP?S kötést önmagában is. A KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ A hippokampusz, és a szomszédos perirhinális, entorhinális és parahippokampális (rágcsálókban posztrhinális) kortikális területek a fo komponensei a mediális temporális lebeny memóriaközpontjának 99,323. Az egyik legjellegzetesebb kannabinoid hatás a tanulási folyamatok és a külso világ információi befogadásának megzavarása, az idoérzékelés és a térbeli tájékozódási képesség elvesztése, a szenzoros információk egymáshoz társításának hiánya, vagy egyes elemei jelentoségének aránytalan felnagyítása, amelyet a fogyasztó az érzékek kifinomulásaként észlelhet. Ezek a hatások mind a különbözo környezeti ingerek asszociációs szintu feldolgozásában mutatnak rendellenességet, amely folyamat nélkülözhetetlen a tartós memórianyomok kialakulásához, és a mai ismereteink szerint alapvetoen a hippokampális formáció területén játszódik le 16,82,157,174. Rágcsálókban megfigyelték, hogy orientációs tesztekben, késleltetett mintaválasztási és mintaelkerülési tesztben és diszkriminációs tesztekben a kannabinoidok csökkentik az állatok tanulási teljesítményét, ami szoros összefüggésben áll a CB 1 receptor nagy suruségével a hippokampusz területén 106,166,168,216,218. Mindezek kivédhetoek az SR141716A-val 218,337. Ráadásul az antagonistával történo kezelés már önmagában jobb eredmény elérésére teszi képessé a kezelt állatokat kontroll társaikhoz képest a fenti tesztekben, ami felveti a lehetoségét, hogy a tanulási folyamatok egy gátló hatású endogén kannabinoid tónus alatt állnak 337. Ezt támaszthatja alá az az új eredmény, hogy a CB 1 receptor génkiütött állatok is valamivel jobban teljesítenek tanulási tesztekben 299. Ha egyenesen magába a hippokampuszba juttatták a kutatók a kannabinoid hatású vegyületet, ugyanúgy csökkent az állatok tanulási tesztekben nyújtott teljesítménye, mint szisztémás adagolás esetén 216,218. A hippokampusz azonban nem csak a tanulás egyik kulcsterülete, hanem az epilepsziáé is. Számos friss eredmény számol be arról, hogy míg a CB 1 receptor antagonista 26

27 SR141716A fokozza, addig az agonisták csökkentik a görcskészséget. Kiderült az is, hogy egy febrilis epileptikus görcs után napokig-hetekig megváltozik, megerosödik a kannabinerg neurotranszmisszió a hippokampuszban, ami részben a megnövekedo CB 1 receptor expressziónak is betudható 56. Mindezek alapján a kannabinoidok neuroprotektív hatása is felmerül 161,355. A CB 1 receptor celluláris és szubcelluláris eloszlásának feltérképezése mellett a receptor aktivációjának következményeit kívántuk megvizsgálni. A néha ellentmondásos irodalom szálait is nekiálltunk kibogozni: vajon csak a CB 1 receptor közvetít-e kannabinoid hatást a hippokampuszban? A KÖZPONTI IDEGRENDSZER NIKOTINOS ACETILKOLIN RECEPTORAINAK FARMAKOLÓGIÁJA A nikotin hatása in vivo A nikotin az egyik legrégebben alkalmazott és emiatt az egyik leginkább ismert hatású exogén élvezeti szer. Alacsony koncentrációban anxiolítikus, magasabb koncentrációban anxiogén 346. Mind egészséges, mind neurodegeneratív betegségekben érintett emberekben javítja a kognitív funkciókat 21,213,376. Emellett összetett folyamatokon keresztül fizikai és pszichés függoséget is kivált 239. A rendszeres nikotinbevitel lassítja a neurodegeneratív betegségek fellépését 21,22,263,300. A nikotinos acetilkolin receptorok A kannabinoidokkal szemben a nikotinos acetilkolin (nach) receptorok gyors, serkento ionáramokkal operálnak, és nem az endogén ligandok, hanem a receptorfajták száma magas. Csak a 80-as évek végétol derült ki, hogy a központi idegrendszer nach receptoraihoz is kötheto funkció. Azonban a funkcionális receptorok szerkezetének megismeréséhez hosszabb út vezetett, hiszen nem csupán egy gént kellett megklónozni, hogy muködoképes receptort kaphassunk 138. Az acetilkolin az elsodleges endogén ligandjuk, emellett szerephez jut a kolinészteráz, az acetilkolin bontóenzime által a receptorok környékén felszabaduló kolin is, ami a legtöbb nach receptoron csupán pozitív allosztérikus modulátor 372, míg az a7 heteropentameren (lásd lejjebb) teljes 27

28 agonista, bár hatáserossége kisebb az acetilkolinénál. Emellett egyre fontosabbnak tunik az Aß 42, az Alzheimer-kórban kulcsszerepet játszó toxikus protein is. Nem kizárt, hogy fiziológiás funkciója van, hiszen 6 nagyságrenddel potensebb endogén agonistája az a7 homopentamernek, sot úgy tunik, más nach receptoroknak is 97, míg a káros hatása a túlzott felszabadulása révén részben a receptorok inaktiválásában érheto tetten. Az acetilkolin minden izomzattal rendelkezo állatban megtalálható a neuromuszkuláris szinapszis kapcsán. Ezen felül neurotranszmittere a vegetatív ganglionoknak és paraszimpatikus végzodéseknek is. A kolinacetiltranszferáz enzim tartalmú neuronokból szabadul fel. A központi idegrendszerben ezek a neuronok nagyrészt lokális interneuronok (például a striátumban 49 ), de az emlosök bazális eloagyában számos acetilkolint termelo mag projektál a kérgi struktúrák felé. A hippokampuszban elsosorban innen származik az acetilkolin. A rostok túlnyomó része a piramissejteken végzodik, és csupán 5-10%-uk kerül kapcsolatba az interneuronokkal. Ezek az axonok diffúz hálózatot képeznek, és csupán 10%-uk alkot szinapszist 115,119,352. Jelenleg a Renshaw-szinapszisok és a hippokampuszban talált nikotinerg szinapszisok nach receptorain túl nehéz a többi, foleg extraszinaptikus nach receptor szerepét értelmezni. Az nach receptorok egy, de általában ketto vagy többféle alegységbol álló homovagy heteropentamerek. Egy olyan szupercsalád tagjai, mely magába foglalja az 5-HT 3, a GABA A, és a glicin receptorait. Az nach receptorok ligandvezérelt ioncsatornák 353, aktiválásukat követoen Na + és Ca 2+ áramlik be a sejtbe, ami után akciós potenciál indulhat el az axonon, vagy ha mindez az idegvégzodésben történik, vezikula dokkolás és neurotranszmitter-felszabadulás lehet az eredménye 23. Emellett számos más, feszültség- és kalciumfüggo folyamat indulhat el. Ilyen például az a7 receptor aktivációja után fellépo kloridkonduktancia, ami miatt bifázisos lesz a receptor aktivációjával mért áram (depolarizáló, majd hiperpolarizáló 314 ). Az eltéro összetételu nach receptorok permeabilitása, ionszelektivitása, áramaik kinetikája, és érzékenységük az endogén és exogén agonistára illetve antagonistákra nagyon változó. Talán ezért van az, hogy a többi ionotróp receptor esetében általában nem szoktunk kitérni az alegységösszetételre. Például szimplán NMDA receptort vagy GABA A receptort mondunk, holott azok alegységeinek kombinációja is több száz lehet. Mégis, nem annyira különbözoek farmakológiailag (például az AP-5 illetve a bikukullin általános antagonistájuk), mint a nach receptorok. Két agonista bekötése esetén nyílik ki az nach receptor ioncsatornája. Küszöb alatti, 28

29 illetve a nagyon magas agonista koncentráció mind deszenzitizálhatja a receptort, azaz az agonisták dózishatásgörbéi gyakran harang alakúak 55,324. Az emlos központi idegrendszerben eddig feltárt nach receptor alegységek száma 11. Ez magában foglal nyolc alfa (a2-7, a9, és a10) illetve három béta (ß2-4) alegységet. Az elobbiek felelosek az agonista kötéséért. A pontos sztöchiometrikus összetételt nehéz megmondani, de mind a 2a/3ß, mind a 3a/2ß elofordul, és természetesen az 5a is alkot funkcionális receptort 353. Az a3-a4-a6/ß2-ß4 receptorok változatos kombinációban alkotják részben a nikotin pszichobiológiai hatásában, a kognitív és fájdalomérzési folyamatokban domináló receptorokat (Dowel2003). A legnagyobb Ca 2+ -beáramlást és a legkisebb affinitást az ACh iránt az a7 homomer nach receptor mutatja 122,314, aktivációjával az NMDA receptorhoz hasonló Ca 2+ - beáramlást produkál. Az a8 a madarakban található meg. Az a7-10 alegysége(ke)t tartalmazó receptorok szerepe és farmakológiai profilja a legérdekesebb. Ok a legkevésbé érzékenyek az ACh-ra. Mivel gyakran extraszinaptikusan helyezkednek el, és az általában varikozitásokból kiáramló acetilkolin szintje nem éri el az aktiválásukhoz, csupán a deszenzitizálásukhoz szükséges koncentrációt, lehet, hogy csökevényes nach receptoroknak kell tekintenünk oket. Az nach receptorok kevéssé tisztázott szerepe mellett ez utóbbi receptorok szokatlan farmakológiai profiljuk és eloszlásuk miatt egyéb, nem csupán a kolinerg neurotranszmisszióban részt vevo receptorok is lehetnek, hanem trofikus funkciókat is elláthatnak, és más neurotranszmitter rendszerek hatásának közvetítoi is lehetnek. Az a7 nach receptor például az egyedfejlodés során szerepet kap a fejlodo idegrendszer neuronjainak természetes szelekciójában 4. A receptor azonnal megjelenik az interneuronon, ahogy a neuron a neuroepitéliumból kialakul, és részt vesz a migráció és az apoptózis szabályozásában. Kezdetben tehát, mikor a neuron megszületik, elsodlegesen nem a kolinerg neurotranszmissziót fogja közvetíteni az a7 nach receptor 4. Ugyanez a receptor került az érdeklodés központjába az Alzheimer-kór, a skizofrénia, a Down-kór, a Tourette-szindróma illetve a juvenilis epilepszia kutatása során is 17,101,187,268,286. A rágcsálók központi idegrendszerében a legnagyobb mennyiségben kimutatható alegység az a7, ami után a ß2, az a4 és az a3 következik. A receptorok expressziós mintázatát radioligandos autoradiográfiával tárták fel nemrégiben. A [ 3 H]nikotin, a [ 3 H]citizin, a [ 3 H]epibatidin és a [ 125 I]a-bungarotoxin kötés, illetve az in situ 29

30 hibridizációs vizsgálatok a rhesus majom agyában azt az érdekes felismerést hozta, hogy komoly eltérések mutatkoznak a rágcsálókhoz képest. Fontos megjegyezni, hogy a rhesus majomban sokkal elterjedtebb és erosebb az [ 125 I]a-bungarotoxin kötéssel jellemezheto a7 receptorok expressziója, ami evolúciós szempontból lehet jelentos 159. Az a7 alegység in situ hibridizációs vizsgálata kimutatta, hogy a legnagyobb mennyiségben a hippokampuszban, a bulbus olfactoriusban, az amigdalában, a hipotalamuszban és az agykéregben található 314. A receptorok farmakológiai profilja Mivel az nach receptorok ligandköto hatásspektruma jelentosen átfed egymással, több agonista és antagonista vizsgálatával állítható fel egy megbízható, de még így sem 100%-os biztonságú alegység összetétel. Ez márcsak azért is így van, mert sokféle, eladdig nem ismert összetételu receptorba belebotolhatunk. Általában azonban ha a kolin és a nikotin is teljes agonistaként viselkedik, csak az a7 homopentamer receptorra gondolunk 11 (I. táblázat). Az acetilkolin értelemszeruen minden receptoron agonista, és általában kevésbé potens a többi exogén vegyületnél. Az a3ß2 és az a4ß2 receptorral is gyakran találkozhatunk, jellemzojük, hogy az epibatidin az egyik legpotensebb agonistájuk, és az 1,1-dimetil-4-fenilpiperazínium (DMPP) a nikotinnál potensebb vagy azzal egyenértéku 55 (I. táblázat). Az epibatidin és a DMPP viszont nem agonistái az a7 receptornak 30. Az antagonisták tekintetében a leggyakrabban alkalmazott vegyületek a nonszelektív mekamilamin, és a nanomoláris koncentrációban ß2-szelektív dihidro-ß-eritroidin (DHßE) (I. táblázat). Az a7 receptorral kapcsolatos kutatások felfutása miatt gyakori választás a metilakonitin (MLA) is, amirol sokáig úgy tudtuk, hogy nanomoláris koncentrációban kizárólag az a7 alegységet tartalmazó (és feltehetoleg homopentamer) nach receptorok antagonistája 11 (I. táblázat). Ez a hippokampuszban valószínu, hogy helytálló, de a SN-ban és a VTA-ban az a4a6a5ß2 összetételu receptorokat 1 nm MLA képes gátolni, míg a striátumban 50 nm MLA részlegesen gátolja az a3a6ß2ß3 összetételu receptorokat 203,260. Emellett néhány más agyterületen krónikus nikotinperfúzió után megno a [ 3 H]MLA kötohelyek száma anélkül, hogy az a6 és az a7 alegység mrns-ének mennyisége megváltozna, ezért nem csak a7-re, hanem részben a3-ra is szelektívnek tartják ezt az antagonistát 50 nm felett 265,346. Az a-btx esetében is 30

31 hasonló volt a képlet az a9, és az a10 alegys égek felfedezéséig 13. Ennek az a magyarázata, hogy a gerincesek központi idegrendszere termel egy Aß 42 -tol eltéro, ismeretlen funkciójú, de rendkívül konzervatív szerkezetu proteint is, ami nagy affinitással köt a homopentamer a7 nach receptorra. Ez a protein a lynx-1 183, és ennek egy módosulata a nyílméregbéka által termelt a-btx. A toxin azonban, már tudjuk, nanomólos koncentrációban gátolja az a9, az a9/5-ht 3, az a10 és az a9a10 nach receptorokat is. Ezek jelenleg obskurus szerepu receptorok. Bár alacsony mikromólos koncentrációjú acetilkolin aktiválja oket, számos nonkolinerg anyag gátolja oket, de ami a legérdekesebb, a nikotin potens antagonistájuk, csakúgy, mint a szerotonin, a tropisetron, az ondansetron, a sztrichnin, a muszkarin, az atropin, a d-tubokurarin, az otoglikozidok, az endomorfin-1, a dynorphin-b, illetve az a-bungarotoxin (a- BTX) 100,304,305,350. Az a9 és az a10 alegységek eloszlásáról régebben úgy gondolták, csak a vesztibuláris és a cochleáris mechanoszenzoros szorsejteken fejezodnek ki 100. Ám például az a9a10 a hátsószarvi ganglionok összes neurontípusában expresszálódik 220. Valószínu, hogy máshol is megtalálják majd oket, ha megindul a komolyabb feltérképezésük. receptor agonisták hatáserosség-sorrendje antagonisták hatáserosség-sorrendje a3ß2 EPI > DMPP > NIC > CIT = ACh D-TUBO = MEK > DHßE a4ß2 EPI > CIT = NIC > DMPP > ACh DHßE = MEK > D-TUBO a7 NIC > ACh > kolin a-btx = MLA > MEK I. táblázat. A hippokampusz legfontosabb nach receptorainak farmakológiai jellemzése. EPI: epibatidin, NIC: nikotin, CIT: citizin, D-TUBO: d-tubokurarin. A NIKOTIN ÉS A HIPPOKAMPUSZ A hippokampusz idegsejtjei rendkívül érzékenyek a nach receptorok agonistáira. Az eddig bizonyított nach típusok, melyek depolarizálhatják a GABA-erg interneuronokat és részt vesznek a szinaptikus plaszticitás szabályozásában az a7, és az a4ß E két receptorról már kimutatták, hogy aktivációjuk fokozza az IPSC-k frekvenciáját és amplitúdóját 11, és az utóbbi aktivációja [ 3 H]GABA felszabadulást is kivált 31

32 szinaptoszómából 224. A glutamáterg sejtek a dús kolinerg beidegzés ellenére ritkán válaszolnak a nikotinra is, ok elsosorban muszkarinikus ACh receptorokkal vannak felszerelkezve. Az eddig bizonyított nach receptor összetétel az a3ß4, melynek aktivációja a glutamát felszabadulását vonja maga után 12. Valószínuleg ez az a3 alegység lehet az oka, hogy MLA-szenzitívnek találták egy vizsgálat során a glutamáterg sejtek válaszát nikotinra 144, ugyanis az esszenciálisan MLA-szenzitív áramot inkább a7- nek konkludáljuk a hippokampuszban. A diszkusszióban pedig tárgyaljuk majd az a7 receptor celluláris és szubcelluláris eloszlásával kapcsolatos ismereteinket, elsosorban azt, hogy ez egy interneuronokra jellemzo receptortípus. 32

33 CÉLKITUZÉSEK Az exogén kannabinoidok fogyasztása szembetuno motoros és kognitív zavarokat okoz. Az is látszik, hogy a hippokampuszt és a striátumot éro akut és krónikus, sejtelhalással járó betegségekben a kannabinoidoknak komoly neuroprotektív, restoratív szerep juthat. Viszont munkáink kezdetén hiányzott egy részletes, minden kétséget eloszlató, komplex morfológiai-funkcionális vizsgálat, ami megismertet bennünket az eddig megklónozott egyetlen centrális kannabinoid receptor expressziójával, szerepével. Célunk volt tehát a leheto legrészletesebb fény- és elektronmikroszkópos tanulmány elkészítése a patkány és az ember hippokampuszában a CB 1 receptor celluláris és szubcelluláris expressziójának feltárása céljából. Emellett közvetlen neurokémiai vizsgálatok segítségével a CB 1 receptor aktivációjának hatására is kiváncsiak voltunk a két fajban. Azon kérdéseket is tisztázni kívántuk, hogy vajon minden centrális kannabinoid hatásért a CB 1 receptor a felelos-e, avagy vannak-e ez alól kivételek is. E célból a striátum vizsgálatát is tervbe vettük, hogy tisztázzuk a szakirodalomban található inkoherens adatokat. A nikotin centrális támadáspontja közül a hippokampusz az egyik legjelentosebb terület. Elégséges mennyiségu, részletes morfológiai adat gyult össze az? 7 és az? 4? 2 receptor eloszlásáról az elmúlt évtizedben, és kimutatták, hogy funkcionálnak, áramot lehet rajtuk kiváltani. Viszont egy olyan integrált rendszerben, mint a hippokampusz szeletben, közvetlenül a GABA kiáramlásának mérésén keresztül nem volt kimutatható az? 7 receptor muködése. Tekintve, hogy az Alzheimer-kórban az nach receptorokat érinto jelenségek már nem csak e betegség kialakulásának és progressziójának okozatai, hanem részben okai is, érdemes lenne látni, vajon milyen szerep hárul rájuk a hippokampusz GABA-erg sejtjeinek szabályozásában. A kannabinoid receptorokkal kapcsolatos kérdések: 1. Célul tuztük ki a CB 1 -es kannabinoid receptor eloszlásának, expressziós mintázatának vizsgálatát a rágcsálók és az ember hippokampuszában, s hogy az eltéro fajokban mennyire homológ a receptor kifejezodése. 33

34 2. Az expresszió függvényében kíváncsiak voltunk arra, hogy milyen hatással bírnak a kannabinoid agonisták azon traszmitter(ek) felszabadulására, amelyeket a CB 1 receptort szintetizáló sejtek szabadítanak fel. Kíváncsiak voltunk arra is, mennyire extrapolálhatóak a patkányban kapott eredmények az emberben tapasztaltakra. 3. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy a kannabinoidok gátolják-e a glutamát felszabadulást, és ha igen, hogyan, ha a receptorok nem detektálhatók a glutamáterg terminálisokon. 4. Tisztázni kívántuk, hogy in vitro milyen irányban modulálják a kannabinoidok a dopamin, a GABA és a glutamát felszabadulását a patkány striátumában. A nikotinos receptorral kapcsolatos kérdések: 5. Tisztázni kívántuk, hogy a hippokampusz szeletben a nikotin hogyan befolyásolja a GABA felszabadulását. 6. A hatásban résztvevo receptor(ok) karakterizálását is célul tuztük ki. 7. Emellett a receptorok aktivációjától a GABA felszabadulásig vezeto mechanizmus feltárását is tervbe vettük. 34

35 MÓDSZEREK ANATÓMIAI KÍSÉRLETEK Anatómiai kísérleteinket patkány, egér és emberi hippokampuszon végezte Prof. Freund Tamás munkacsoportjából Dr. Katona István és kollégái. A patkány és egér hippokampusz metszeteket perfundált állatokból készítették, az emberi hippokampusz metszeteket post mortem, illetve mutét során eltávolított, utólag fixált hippokampuszból készítették. Valamennyi állati és emberi szövetet felhasználó kísérlet megfelelt a Kísérleti Orvostudományi Intézet és a Semmelweis Egyetem kísérleti etikai szabályzatainak. A kísérletekben 14 db hím Wistar patkányt (Charles-River törzs, 2-3 hónaposak), valamint 4 egeret (CD1 törzs, 1 hónaposak) használtunk fel. Az emberi hippokampusz blokkokat négy, idegrendszeri megbetegedésben nem szenvedo emberbol 2 órával a halál beállta után eltávolított, valamint hét, tumorindukálta epilepsziában szenvedo betegbol sebészi úton eltávolított hippokampuszokból készítették. Preembedding immunfestés Az egyszeres immunfestés során a következo antitesteket használtuk: nyúl anti-cb 1 N-terminális régió ellen (1:1000) 343, nyúl anti-cb 1 C-terminális régió ellen (1:5000) 154, nyúl anti-subtance P receptor (SPR; 1:3000) 317 ; nyúl anti-parvalbumin (PV; 1:2000) 20 ; vagy nyúl anti-cholecystokinin (CCK; 1:10000) 150. A primer antitest után intenzív mosás következett, majd szekunder rétegként a nyúl antitestek ellen, kecskében termeltetett biotinhez kötött antiszérummal inkubáltak 2 óráig (1:400, Vector). Ezt követoen, intenzív mosás után avidin-biotinilált peroxidáz komplexszel inkubálták a metszeteket másfél óráig (1:500, Elite ABC, Vector). Az inkubálás után TBS, majd 0,05 M-os TB pufferrel (ph = 7,6) mosás következett. Ezután a metszeteket 3,3'-diaminobenzidin oldatában (0,03% DAB TB-ben), amelyet néha még kombináltak nikkel-szulfáttal (0,5% nikkel-szulfát TB-ben, Ni-DAB), eloinkubálták 20 percig. Az immunperoxidáz reakciót hidrogén-peroxid hozzáadásával indították meg (0,01% végkoncentráció). A reakciót a DAB oldat TB-re cserélésével állították meg. Az immunreakció és mosás után 1%-os 35

36 ozmium-tetroxidos oldattal kezelték (0,1 M-os PB-ben oldva, 45 percig) a metszeteket, majd dehidrálták felszálló alkoholsorban (a sor közepén 1% uranil-acetát volt a 70%-os etanolban, 40 percig) és propilén-oxidban, legvégül Durcupan mugyantába (ACM, Fluka) beágyazva tárgylemezen lefedték. Preembedding kettos immunfestés peroxidáz reakcióval A CB 1 receptor/cck-pozitív sejtek posztszinaptikus elemeinek megállapítására kettos immunfestéseket végeztek peroxidáz reakcióval. Elso antitestként a CB 1 receptor elleni antitesteket vagy a CCK ellen nyúlban készült antitestet használtak és nikkelszulfáttal erosített DAB hívást alkalmaztak. Intenzív mosás után második antitestként nyúl anti-pv (1:2000) immunfestést alkalmaztak és nikkel nélküli DAB-ot használtak kromogénként. A kettos immunfestések során is valamennyi antitest az egyszeres festésnek megfelelo festési mintázatot mutatta. Kombinált immunarany-immunperoxidáz kettos immunfestések Az elso antitest inkubálása után, amely ebben az esetben mindig valamelyik CB 1 receptor elleni antitest volt, alapos mosás után a metszeteket blokkolták 0,8% BSA-t, 0,1% IGSS (ImmunoGold Silver Staining) típusú zselatint (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, England) és 5% normál kecske szérumot TBS-ben tartalmazó oldattal fél óráig. Ezután 1 nm-es arannyal konjugált kecske anti-nyúl második antitesttel (Amersham Life Sciences; 1:50) inkubálták a metszeteket szobahomérsékleten, 6 órán keresztül. Mivel az 1 nm-es kolloidális aranyszemcsék az elektronmikroszkópban még nem felismerhetoek, ezért újabb mosások után a metszeteket 5-10 percig ezüstintenzifikálták Aurion R-Gent intenzifikálóval (Aurion Immuno Gold Reagents & Accessories, Wageningen, Netherlands). A metszetek egy részét ezután második immunfestésnek vetették alá, a már fent leírt módon. Itt a második körben primer antitestként nyúl anti CCK-t, nyúl anti-pv-t, vagy patkány anti-2-es típusú muszkarinikus receptort (m2; 1:300) használtak. 36

37 Kontroll kísérletek Az antitestek specifikusságát az antitesteket készíto laboratóriumok igazolták. Mivel a kísérleteinkben központi szerepet kapott a két CB 1 splice variáns kannabinoid receptor elleni antitest, így néhány tulajdonságukat indokolt megemlíteni. Mindkét antitest készítésénél antigénként a CB 1 receptor egy glutation-s-transzferázzal (GST) kötött adott szakaszát használták. Az N-terminális antitest esetében az antigén a CB 1 receptor extracelluláris N-terminális részén található 1-77 aminosav volt. A C-terminális antitest esetében az antigén a CB 1 receptor intracellulárisan található C-terminális részének legvégén lévo 63 aminosav volt. Mindkét antitest nyúlban készült és affinitáskromatográfiával tisztított. Az antitestek specifikusságát az antitesteket készíto prof. Ken Mackie igazolta Western-blotting módszer használatával, valamint a receptorokkal transzfektált AtT20 sejtvonalak immunfestésével 343. Ezen túlmenoen, hogy a CB 1 receptor elleni antitestek specifikusságáról az agyszövetben is megbizonyosodjanak, összehasonlították a CB 1 receptor génjét nem tartalmazó egerek teljes agymetszetein végzett immunfestést a vad típusú egerek teljes agyának immunfestésével. Egyik antitest sem mutatott semmilyen immunfestést a CB 1 receptor génkiütött állatok metszetein, ezzel ellentétben a teljesen azonos módon immunfestett vad típusú egerekben a patkány agyhoz hasonló, jellegzetes CB 1 receptor-immunfestést kaptak. Tükörkép módszer a neurokémiai markerek kolokalizációjának megállapítására A Kosaka és munkatársai által kidolgozott módszer kiválóan alkalmas arra, hogy egyetlen idegsejtben két különbözo neurokémiai marker meglétét bizonyítsuk 204. A módszer lényege, hogy a metszetek elkészítése során (Vibratome metszés) számos idegsejt sejtteste félbevágódik és így a két sejtfél a szomszédos metszetekbe kerül. Ha e szomszédos metszeteken különbözo anyagok ellen végzünk immunfestést, akkor az egyes sejtek két, késobb párosítható fele eltéro neurokémiai markerekre lesz megfestve és az anyagok együttes elofordulása vagy kizáró viszonya megállapítható. A szomszédos metszetek közül az egyiket mindig CB 1 receptorra, a másikat pedig a két vizsgálni kívánt marker (CCK és PV) valamelyikére festették meg. 37

38 Fluoreszcens kettos immunfestések Az CB 1 receptor esetleges kolokalizációját PV-al vagy CCK-val kettos fluoreszcens immunfestések segítségével is megvizsgálták. Primer rétegként a következo antitestek kevert oldatát helyeztük a metszetekre: nyúl anti-cb 1 C-terminális régió ellen (1:5000) vagy nyúl anti-cb 1 N-terminális régió ellen (1:1000) készült primer antitestet kevertek egér anti-pv (1:1000, Sigma, St. Louis, MO, USA) vagy egér anti-cck (1:3000, Cure Gastroenteric Biology Center, Los Angeles, CA, USA) ellen készült primer antitesttel. Az inkubálást 48 órán keresztül, 4 o C-on végezték. A második réteg minden esetben Cy3-al konjugált szamár anti-nyúl IgG (1:200) és fluorescein izotiocianát (FITC)-al konjugált kecske anti-egér IgG (1:100, mindkét esetben Jackson ImmunoResearch Reagents) kevert oldata volt. A CB 1 receptor szubcelluláris eloszlásának és a neurokémiai markerek kolokalizációjának megállapítására végzett elektronmikroszkópos kiértékelések A legsurubb CB 1 -pozitív axonfestéssel rendelkezo és aktuálisan vizsgálni kívánt rétegeket kiválasztották (a CB 1 eloszlás esetében valamennyi réteg vizsgálatára sor került a gyrus dentatus, CA3 és CA1 régiókban), majd a fedolemez eltávolítása után szikével kivágták a metszetekbol. Ezután ultramikrotómos metszéshez alkalmas Durcupan mugyanta blokkokba ágyazták és 60 nm vastag sorozatmetszeteket készítettek belolük. A metszeteket Formwar hártyás réz mintatartó gridekre vitték fel. A grideken található metszeteket ólom-citráttal kontrasztozták és Hitachi 7100 elektronmikroszkópban vizsgálták. A CB 1 receptor eloszlását és a CCK, valamint a PVtartalmú boutonokat véletlenszeru mintaválasztással vizsgálták. Miután a DAB tartalmú CCK- vagy PV-pozitív boutonok szinapszisait megtalálták, legalább 10 sorozatmetszeten végig követték, hogy megvizsgálják vajon található-e bennük (a C- terminális antitest esetében) vagy rajtuk (az N-terminális antitest esetében) aranyszemcse, amely a CB 1 receptor jelenlétét mutatja. Az N-terminális antitest esetében egy axonvégzodést akkor fogadtak el CB 1 receptor pozitívnak, ha legalább 4 független membrán-kötött aranyszemcsét találtak rajta. Amennyiben 1-3 aranyszemcsét tartalmazott, akkor az "azonosítatlan" kategóriába sorolták, ha viszont nem találtak rajta egyetlen aranyszemcsét sem, akkor negatívnak könyvelték el. 38

39 FARMAKOLÓGIAI KÍSÉRLETEK Agyszeletek preparációja és elokészítése a kísérletekre A [ 3 H]GABA felszabadulásos kísérletekben hím Wistar patkány ( g, Richter- Gedeon, Budapest) hippokampusz és striátum szeleteket és humán hippokampusz mintákat használtunk. A patkányok dekapitációja után az agyat azonnal jéghideg Krebs oldatba helyeztük, amit 95% O 2 + 5% CO 2 gázkeverékkel telítettünk. A Krebs-oldat összetétele a következo volt: NaCl (115 mm), KCl (4,7 mm), KH 2 PO 4 (1,2 mm), CaCl 2 (2,5 mm), MgSO 4 (1,2), NaHCO 3 (25 mm), glükóz (10 mm), az oldat ph-ja pedig 7,4 volt. A hippokampuszokat és a striátumokat (megtisztítva a környezo szövettol) eltávolítottuk, majd 400 µm vastag keresztirányú szeletekre (3-5 mg) vágtuk egy McIlwain típusú szövetszeletelovel. Az emberi mintákat Dr. Czirják Sándor foorvostól kaptuk az Országos Idegsebészeti Intézetbol. Mindegyik minta tumor-indukálta epilepsziában szenvedo betegekbol származott, akiknek a tumor miatt a temporális kéreg egy részével együtt el kellett távolítani a hippokampuszukat. Egyik minta sem mutatott szklerotikus elváltozásokat, és valamennyi esetben anatómiai módszerekkel igazoltuk, hogy a CB 1 kannabinoid receptor eloszlása mind fény, mind elektronmikroszkópos szinten megegyezo a post mortem humán mintákkal. A mutét során eltávolított hippokampuszt azonnal, még a mutoben jéghideg, oxigenált Krebs-oldatba helyeztük, majd a perces szállítást követoen a laboratóriumban µm vastag, 4-9 mm 2 - es alapterületu szeletekre vágtuk. Ezek után a szeleteket egy órán át inkubáltuk 37 ºC-on 1 ml, 5 µci/ml koncentrációjú, 86,0 Ci/mmol aktivitású 4-amino-n-[2,3-3 H]vajsavval ([ 3 H]GABA, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Buckinghamshire, England). Az inkubáló oldat? -alanint (1 mm) is tartalmazott, amivel minimalizáltuk a gliális [ 3 H]GABA felvételt 188. Az inkubáció után egy kécsoben háromszor óvatosan átmostuk a szöveti mintákat, majd egy négycsatornás perfúziós berendezés mindegyik 100 µl térfogatú kamrájába egy patkányból származó 4-4 hippokampusz vagy 2-2 striátum szeletet, míg a humán szeletekbol egyet-egyet tettünk. Ezek után 1 órán keresztül szuperfúziós rendszerben mostuk a szeleteket 0,7 ml/perc perfúziós sebességgel. A [ 3 H]GABÁ-val végzett kísérleteknél a GABA-transzamináz gátló aminooxiecetsav (100 µm) minden oldatban jelen volt. Ezek után került sor a mintavételi periódusra. A dopaminos kísérletekben a striátum szeleteket háromnegyed órán át inkubáltuk 37 39

40 ºC-on 1 ml, 5 µci/ml koncentrációjú, 50 Ci/mmol aktivitású [7,8-3 H]dopaminnal (Amersham). Ezekben a kísérletekben a Krebs oldat 10 mg/l EGTÁ-t és 50 mg/l aszkorbinsavat tartalmazott. Az inkubálás és az átmosás után szeletek a szuperfúziós kamrába kerültek, és a szokott módon 1 órán át szuperfúziós rendszerben mostuk a szeleteket. Ezek után kezdtük a mintavételt. A tríciált transzmitter-felszabadulás mérése A mintavételi periódus kannabinoidos kísérletek 57 perce során 19 darab 3 perces mintát gyujtöttünk. A 3. és a 13. mintavétel elején elektromos ingerlést alkalmaztunk. A szeletek elektromos stimulálása a kamrában elhelyezkedo gyurus platina elektródokon keresztül egy bipoláris négyszögjeleket generáló Grass S88 Stimulátorral történt (Grass Medical Instruments, Quincy, MA, USA). A vegyületeket vagy azok oldószereit vagy az elso (S 1 ) vagy a második elektromos ingerlés (S 2 ) elott 15 perccel adtuk a perfúziós folyadékhoz. Általában ha csak egy vegyületet adtunk S 2 elott, akkor annak a vegyületnek a transzmitter-felszabadulásra kifejtett hatását vizsgáltuk. Ez kétféle módon értékeltük: a vegyület hatása a nyugalmi és a stimulált transzmitter felszabadulásra aránypárokban kifejezve (lásd az eredmények részt). Az antagonistákat általában S 1 elott adtuk 15 perccel (tehát már a mosási periódus 51. percétol), míg az agonistákat S 2 elott. Ezzel kivédtük azt, hogy az antagonista esetleges saját hatása keveredjen az agonista hatásával. Ennek megfeleloen antagonista kontrollokat is mértünk, amikhez statisztikailag viszonyítani lehetett az agonista hatását az antagonista jelenlétében (2. ábra). A nikotinos vizsgálatok során egy elektromos ingerlést választottunk (a mintavétel 36. percétol). Ezekben a kísérletekben 15 mintát gyujtöttünk. A háromperces perfuzátumokból 0,5-0,5 ml-t 2-2 ml szcincillációs folyadékkal elegyítettünk (Packard Ultima Gold), majd a minták trícium tartalmát Packard 1900 Tricarb folyadék szcincillációs spektrométerrel (Canberra, Australia) meghatároztuk. A kísérlet végén a megmaradó szövetek tömegét megmértük, elhomogenizáltuk oket triklórecetsavban, és a trícium tartalmat meghatároztuk. A kísérlet kiértékelése során az egyes perfuzátum minták radioaktivitás-tartalmát fejeztük ki a mintavétel idopontjában kalkulált szöveti tartalom százalékában. Azaz egy lépcsozetes transzmitter felszabadulási görbéhez, ún. fractional release százalék diagramhoz jutottunk (FR%). Bizonyos alkalmakkor (például a szöveti felvétel abszolút értékben történo megadásánál) egy 40

41 gramm szövetre vonatkozó tríciumtartalmat adtunk meg Bq/g formában (2. ábra). 2. ábra. A kísérleti adatok értelmezése. Az ábra olyan kísérleti elrendezést mutat, amiben éppen az agonista hatását R 1 FRS 1 R 2 vizsgáltuk az antagonista FRS 2 jelenlétében. Az S 1 által kiváltott antagonista agonista transzmitter felszabadulást FRS 1 - nek, az S 2 által kiváltottat pedig FRS 2 -nek (FR%) nevezzük. Az FRS értékeket a zölddel jelölt területek kiszámolásával kaptuk meg. A bekarikázott pontok a nyugalmi transzmitter felszabadulás értékelése során figyelembe vett pontok ( R mint resting). Az ezekbol képzett aránypárok (FRS 2 /FRS 1 illetve R 2 /R 1 ) szolgáltatnak adatokat a különféle vegyületek hatásairól. Szinaptoszóma preparálása és elokészítése a kísérletre A patkány és egér szinaptoszóma preparálása során egy korábbi módszert alkalmaztunk 73. Egy ml tisztított P 2 szinaptoszóma frakció eloállításához 4 hím Wistar patkány ( g) hippokampuszait és striátumait, illetve 8 CD-1 egér (20-23 g) hippokampuszait használtuk. A CD-1 egérbol generált CB 1 receptor génkiütött egeret Prof. Catherine Ledent biztosította számunkra 211. Az egér genotípusát konvencionális PCR technikával rendszeresen ellenoriztük. A hippokampuszokat 0,32 M szacharóz oldatban (+1 mm EDTA, +1 mg/ml bovine serum albumin, és 5 mm HEPES, ph 7,4) 4?C-on elhomogenizáltuk dugattyús homogenizátorral, és 5000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót rpm-en 12 percig centrifugáltuk. A pelletet jéghideg, 45%-os (v/v) Percoll/Krebs oldatban vettük fel (ph 7,4), és rpm-en 2 percig centrifugáltuk. Ennek a lépésnek az volt a célja, hogy a szabad mitokondriumoktól megtisztítsuk a szinaptoszómát. A felülúszót rpm-en Krebsben kétszer mostuk 2 percig 4?C-on. A minta összetételét elektronmikroszkópos szinten Dr. Kittel Ágnes vizsgálta. A szinaptoszómát 1 ml-re hígítottuk Krebsben, és 5 percig 37?C-on 95% O 2 és 5% CO 2 keverékével elkezdtük telíteni. Ezután 5 µci, 49 µci/mmol aktivitású [ 3 H]glutamátot (Amersham) injektáltunk a preparátumba, és további öt percen át töltöttük a szinaptoszómát. 90 µl preparátumot adagoltunk egy-gy perfúziós kamrába, 41

42 amit alul-felül egy-egy Whatman GF/C üvegszálas szurovel határoltunk belül a szinaptoszóma kimosódását elkerülendo. Ezután megindítottuk a 95% O 2 és 5% CO 2 keverékkel telített Krebs oldat 0,7 ml/perc sebességu perfúzióját. Terrian és munkatársai hasonló kísérleti elrendezésben vizsgálták, hogy hogyan lehet emelni a káliummal depolarizált szinaptoszómából kiáramló [ 3 H]glutamát kalcium-függoségét 338. Az o eredményeik alapján az eloperfúzió 9. percétol 5 perces D-aszpartát (50 µm) kezelés alkalmaztunk, ami elméletileg a nem vezikuláris glutamátot minimalizálja a szinaptoszómában, s ez nagy mértékben kalcium-függové tette a trícium kiáramlását (lásd Eredmények). A 33 perces kimosási periódus után, azaz a mintavételi periódus 42 perce során 14 darab 3 perces mintát gyujtöttünk. A 3. és a 11. mintavétel elején 25 mmos K + tartalmú Krebs oldattal depolarizáltuk a szinaptoszómát két percig (a Na + izomoláris szubsztitúciója K + -mal). A kísérlet további részletei egyeznek a szeletkísérletben kivitelezettektel. Meg kell említenünk, hogy ebben a kísérletsorozatban a WIN t sósavban oldottuk, ugyanis azt vettük észre, hogy az RBI oldószere, a 2-hidroxipropil-ß-ciklodextrin a 10 µm-os koncentrációjú agonistához tartozó mennyiségben már szignifikánsan gátolja a glutamát felszabadulását. Az elozo kísérleteinkben ez nem jelentett problémát, hiszen ott a WIN legmagasabb használt koncentrációja 3 µm volt. Az összes többi nem vízoldékony vegyületet sikerült etanolban oldanunk. A kísérletek során (beleértve a továbbiakban bemutatottakat is) elért legmagasabb oldószer koncentrációk (0,43% etanol 60 µm R-metanandamid és 60 µm ACEA, illetve 5 µm SR141716A; és 0,04% HCl 40 µm WIN ) nem okoztak szignifikáns változást a [ 3 H]glutamát felszabadulásában (IV. táblázat). Statisztika Az ingerléssel kiváltott többlet transzmitter felszabadulást a görbe alatti területek számolásával határoztuk meg, így jutottunk az FRS 1 és FRS 2 százalékos értékekhez (2. ábra). Az adatok n? 4 identikus megfigyelés átlag ± szórás adatait tartalmazzák. Az EC 50 adatokat Prism 3.01 (Graph Pad, San Diego, CA) program segítségével kalkuláltuk. A statisztikai kiértékelést Student t-teszttel vagy ANOVÁ-val végeztük, ez utóbbi mellé a Bonferroni poszt-tesztet alkalmaztunk szelektált csoportokra. A p < 0,05 értéket fogadtuk el szignifikánsnak. 42

43 Elemzési módszer aminosavak elválasztására A [ 3 H]GABA és a [ 3 H]glutamát szöveti analízisét a munkacsoportunk által leírt, kombinált HPLC-s és fluorometriás eljárás szerint 269 Baranyi Mária kollégánk végezte. A lecentrifugált szöveti homogenizátum 400 µl-ét meghígítottuk 50 µl 10 µmol/l a- amino adipinsav tartalmú 1 mol/l borát puffer oldattal. 50 µl Reagens oldattal 2 perc reakció idovel eloállítottuk az izo-indol aminosav származékot és a reakció leállítására 25 µl 1,5 mol/l foszforsav oldatot használtunk. Az 500 µl minta injektálása ezután történt. A fenti muveletet a szoftver által vezérelt automatikus mintaadagoló végezte. A reagens oldatot naponta frissen készítettük az alábbiak szerint: 10 mg o-ftáldialdehidet 250 µl metanolban feloldottuk és hozzáadtuk 4,75 ml borát pufferoldathoz (1 M, ph = 10,5), amely 50 µl 2-merkaptoetanolt tartalmazott. A reagenst naponta frissen készítettük. Gilson-915 szoftverrel vezérelt kromatográfiás rendszert használtuk az aminosavak elválasztásához. Kétkomponensu gradiens szeparációhoz két nagy nyomású pumpát alkalmaztunk. A programozható autoinjektor az oszlop elotti származékképzést és az iso-indol aminosav származék adagolását és dúsítását végezte. Fluoreszcens detektor érzékelte az effluens 350 nm hullámhossz gerjesztése során 455 nm hullámhosszon kibocsátott fény intenzitását. Az aminosavak szeparálására Discovery C-18 5 µm szemcseméretû 150 x 4,6 mm méretû analítikai oszlopot használtunk. Az oszlop elotti dúsításra az "extra loop"-ként bekötött 20 x 4,6 mm méretu, az elemzo oszlophoz hasonló töltetu és szemcseméretû kolonnát használtunk. A detektor jelet szoftveres adatgyujtéssel dolgoztuk fel Az elemzési program 10 perces, 70%-os metanolos öblítéssel, majd 60 perces oszlop equilibrációval indult. Az oszlopegyensúlyt az "A" eluenssel hoztuk létre, amely 22,5 % metanol-acetonitril (3,5:1 v/v) tartalmú, 10 mm-os, 7,2 ph-jú kálium-foszfát puffer oldat volt. A "B" oldat 22,5% (V/V) acatonitril tartalmú metanol. A gradiens profil ("B" oldatra) a következo: 6,5%, 12,8%, 15,5%, 27,0%, 39,0%, 41,0% és 59,5% a vonatkozó idok: 5,5; 6,0; 13,0; 13,5; 14,0; 19,5 és 22,5 perc; az 59,5 %-os "B" oldat összetételt még egy percig fenntartva tér vissza az "A" oldatos összetételi értékre. Tíz perces reequilibrium után indítható a következo ciklus. Az elemzést 1,15 ml/min térfogatsebesség értékkel valósítottuk meg. A tríciált aktivitást az effluens egyperces frakcióiból szcintillációs méréssel határoztuk meg. A hippokampusz szeletben négy 43

44 kísérlet végén mért szöveti trícium-tartalom 94,5%-ban [ 3 H]GABÁ-nak bizonyult, a maradék pedig fõleg [ 3 H]aszpartát volt (4 kísérlet átlaga) 2,74. Ezért a továbbiakban a trícium-tartalomra [ 3 H]GABA-tartalomként utalok. A szinaptoszómában tríciumot több, mint 90%-ban glutamát és aszpartát hordozta a szinaptoszómában a kísérlet végén (n = 4), a maradék [ 3 H]glutamin, a-[ 3 H]alanin és [ 3 H]GABA volt. Mivel a töltési periódus alatt a [ 3 H]glutamátot a glutamáterg neuronok axonvégzodései veszik fel elsosorban (és esetleg a szennyezésként ott maradt mitokondriumok), ezért a kísérlet során felszabadult trícium túlnyomó része is ezekbol az axonvégzodésekbol jöhetett, miután az eloperfúzió kezdetétol a trícium visszavételétol eltekinthetünk 298. Mindezek figyelembe vétele mellett az egyszeruség kedvéért a felszabadult tríciumot [ 3 H]glutamátként aposztrofáljuk. INTRACELLULÁRIS KALCIUM MÉRÉS A kísérleteket osztályunkról Dr. Zelles Tibor végezte. Altatott állapotban (xilazin+ketamin) dekapitált hím Wistar patkányok (16-20 naposak) agyából jéghideg Krebs folyadékban (126 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 26 mm NaHCO 3, 0,5 mm CaCl 2, 5 mm MgCl 2, 1,25 mm NaH 2 PO 4, 10 mm glükóz, ph 7.4 oxigenálva 95% O 2 és 5% CO 2 keverékével) 250? M vastag koronális metszeteket vágtunk vibratommal (Vibratome 1000; TPI, St. Louis, MO), s ezeket két félre választottuk, majd háló aljzatú kamrába tettük oket. A kamrában mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF, NaCl: 126 mm, KCl: 2.5 mm, NaHCO 3 : 26 mm, CaCl 2 : 2 mm, MgCl 2 : 2mM, NaH 2 PO 4 : 1.25 mm és glükóz: 10 mm) inkubálódtak 35,5 o C fokon percig, majd szobahon percre olyan ACSF-be helyeztük oket, mely 5? M fura-2 acetoximetil-észtert (fura- 2/AM, Molecular Probes, Eugene, OR) és 0.025% (w/v) Pluronic F-127 detergenst (Molecular Probes) tartalmazott. Ezután 1 órán át a szeletek szimpla ACSF-ben álltak, míg megtörtént a festék de-észterifikálódása. A szeletek ezek után egy Gibraltar BX1 platformra (Burleigh, Fishers, NY) erosített kísérleti kamrába kerültek, és 40? vízimmerziós objektívvel (Olympus BX50WI, Olympus, Hamburg, Germany) vizsgáltuk oket. Az elektromos ingerlés (10 Hz, 3 ms, 50 pulzus) platinaelektródon keresztül zajlott. A CA1 stratum radiatum és lacunosum moleculare interneuronjait alternálva világítottuk meg 340 ± 5 és 380 ± 5 nm-en egy TILL Polychrome II monokromátor (Planegg, Germany) segítségével. Egy állítható áteresztoképességu 44

45 diafragmával szabályoztuk az UV intenzitását. A kibocsájtott fényt (510 ± 20 nm) hutött charged-coupled kamerával detektáltuk (Photometrics Quantix; Photometrics, Tucson, AZ) és Axon Imaging Workbench 2.2 software-rel szabályoztuk a rendszert. A sejttestben mért [Ca 2+ ] i adatokat Grynkiewicz és kollégái közleményében bemutatott egyenletekkel számoltuk

46 EREDMÉNYEK A KANNABINOIDOK ÉS A HIPPOKAMPUSZ A HÁROMFÉLE MEGKÖZELÍTÉSI MÓDSZERROL ELÖLJÁRÓBAN Prof. Freund Tamás munkacsoportjának anatómiai eredményeit egészítettük ki funkcionális neurokémiai vizsgálatokkal mind a patkány, mind a humán hippokampuszt illetoleg. Ezekbol a munkákból két közös közlemény született. Az o eredményeik szervesen illeszkednek a mi munkáinkba, azoktól elválaszthatatlan egységet alkotnak. A morfológia és funkció egységét és szépségét a kollégáinkkal történo rendszeres közös gondolkodás, párbeszéd fejlesztette tovább, és ez azóta intézetünknek számos publikációt jelentett a kannabinoidok területérol. Ennek megfeleloen az érintettek engedélyével az o idevágó eredményeik szukebb kivonatát is beillesztettem a téziseimbe. A CB 1 RECEPTOR EXPRESSZIÓS MINTÁZATA A RÁGCSÁLÓK HIPPOKAMPUSZÁBAN A CB 1 receptor expressziós mintázata fénymikroszkópos szinten. A CB 1 receptor lokalizációját vizsgáló autoradiográfiás 166,168, in situ hibridizációs 233,234,245 és immuncitokémiai tanulmányokban 343 a hippokampusz bizonyult az egyik legintenzívebben jelölodo agyterületnek. Azonban ezen munkák egyike sem vállalkozott arra, hogy részleteiben is feltárja a receptor pontos celluláris és szubcelluláris lokalizációját, illetve annak funkcióját. Ezt tuztük ki célul tehát. Az N- terminális régióban különbözo splice variáns CB 1A receptor esetleges létezése felvetette a lehetoségét, hogy az ncb 1 antitestünk nem ismeri fel a splice variánst. Ezért egy olyan antitest festési mintázatát is megvizsgáltuk, amely a mindkét receptor szekvenciájában egyforma C-terminális régiót ismeri fel. A ccb 1 antitesttel végzett immunfestések a sejttestek szempontjából hasonló mintázatot mutattak mind patkányban (3. ábra), mind egérben (5. A ábra). A ccb 1 antitesttel festett hippokampuszban talált CB 1 -pozitív sejtek mind mennyiségükben, mind eloszlási mintázatukban megegyeztek a ncb 1 antitesttel jelölt hippokampusz metszetekkel. Tükörkép módszerrel megvizsgáltuk, vajon a kétféle 46

47 CB 1 receptor elleni antitest valóban ugyanazt a sejtpopulációt jelöli-e meg. A két állatban mindkét antitest irányából megvizsgált összesen 33 félbevágott CB 1 -pozitív sejttest minden esetben CB 1 -pozitívnak bizonyult a szomszédos metszetben is, megerosítve, hogy a két CB 1 -receptor elleni antitest ugyanazt az interneuron populációt jelöli. Ugyanakkor a ccb 1 antitest mind patkányban, mind egérben érzékenyebbnek bizonyult. A principális sejtrétegek innerválása volt a legkarakterisztikusabb, ezen túlmenoen, a gyrus dentatusban az egész molekuláris réteg tele volt CB 1 -pozitív axonokkal, míg a CA3 és CA1 régióban a stratum radiatum és a stratum oriens is számtalan axont tartalmazott, bár nem olyan suruségben mint a stratum pyramidale. A stratum lacunosum-moleculare volt az egyetlen réteg, ahol jóval kevesebb CB 1 -pozitív axon volt megfigyelheto a többi réteghez képest. Habár az in situ hibridizációs kísérletek szintén megemlítenek egy, a háttér szintjéhez közeli minimális CB 1 receptor mrns jelenlétet a principális sejtekben 233,234,245, specifikus immunfestési mintázatot kizárólag az interneuronokban találtunk. Ez az igen suru axonfestés és jellegzetes eloszlási mintázat tökéletesen megegyezett a korábbi autoradiografiás munkákban leírt kannabinoid kötodési mintázattal. A fent ismertetett receptor eloszlási mintázat azt sugallta, hogy a hippokampuszban található kétféle kosársejt típus közül legalább az egyik tartalmazza a CB 1 receptort. Az egyik kosársejt típus, amelynek sejttestje foleg a stratum pyramidaleban található, parvalbumint (PV) tartalmaz 198. Ezzel szemben a másik kosársejt típus, amelynek sejttestje bármelyik rétegben elofordulhat, kolecisztokinint (CCK) tartalmaz 277. Mivel a CB 1 receptor-immunreaktív sejtek eloszlása inkább az utóbbi festésre hasonlított, ezért eloször megvizsgáltuk tükörkép technikával, hogy vajon ugyanaz a sejtpopuláció termeli-e a két markert. Kiderült, hogy szinte valamennyi (96,7%, n = 97) CCK-pozitív sejt tartalmazza a CB 1 receptort. Ezen túlmenoen, a CB 1 receptor-immunreaktív sejteknek szintén a többsége (85,6%, n = 97) pozitív volt CCK-ra is. Tehát a neurokémiai marker és a CB 1 receptor elleni immunfestés lényegében ugyanazt az interneuron populációt jelenítette meg. Ezek után már nem volt meglepo, hogy parvalbuminnal szinte egyáltalán nem kolokalizált a CB 1 receptor (ncb 1 antitesttel). A tükörkép technikával megvizsgált 130 PV-pozitív sejtbol mindössze 6 bizonyult CB 1 -immunreaktívnak. A kettos immunfestés fluoreszcens technikával és a ccb 1 antitesttel ugyanezt az eredményt erosítette meg (0%, n = 42). 47

48 3. ábra A, B) A dorzális hippokampusz CB 1 immunfestése kis felbontású fénymikroszkópos képen. A nyílhegyek jelölik a CB 1 immunpozitív sávokat a stratum moleculeculare belso harmadában, és a stratum radiatum stratum pyramidale határán a CA1 területen. A legtöbb CB 1 -immunoreaktív sejttest interneuronra hasonlít, amelyek a CA1 régió összes alrégiójában jelen vannak. C) A CA3 régióban a stratum lucidum nem hordozta a jelölést, viszont a megfestodött kosárszeru axonok suru fonata látszik az immunonegatív piramissejtek körül a stratum pyramidaléban (nyílhegyek), csakúgy, mint a CA1 régióban. A legtöbb immunpozitív sejttest a stratum radiatumban jelentkezik. Az sejttestek azért immunpozitívak, mert a frissen szintetizált CB 1 receptort felismerte az antitest az intracelluláris kompartmentumaikban, de mivel ez nem tartozik szorosan az munkánkhoz, ezért nem tértünk ki rá a szövegben. D) A gyrus dentatusban a hílus és a stratum granulosum határán találhatóak az immunpozitív sejttestek (nyilak). A nyílhegyek egy suru, pontszeru immunfestodésre mutatnak a stratum moleculare belso harmadában. DG, gyrus dentatus; h, hílus; sg, stratum granulosum; smi, a stratum moleculare belso harmada; sm, stratum moleculare; slm, stratum lacunosum-moleculare; sr, stratum radiatum; sp, stratum pyramidale; so, stratum oriens; sl, stratum lucidum. Léptékek: A, 200 µm; B, C, 60 µm; D, 100 µm. 48

49 A CB 1 kannabinoid receptor szubcelluláris lokalizációja, elektronmikroszkópos vizsgálat A dendritfestés hiánya és az axonfestés erossége azt sugallta, hogy a CB 1 kannabinoid receptor funkcionális lokalizációs helye inkább preszinaptikus, mint posztszinaptikus. Valóban, az elektronmikroszkópos vizsgálataink során a CB 1 receptor lokalizációját jelzo aranyszemcsék a boutonokon fordultak elo. Az ncb 1 antitest esetében az aranyszemcsék mindig az axonvégzodés membránjának külso oldalán lokalizálódtak, és mindig a szinaptikus résen kívül. A ccb 1 antitest esetében pedig az aranyszemcsék mindig a membrán belso oldalához kapcsolódtak, a jelölés pedig rendkívül suru volt (lásd 4 A,B. ábra), de a szinaptikus aktív zónát ebben az esetben is elkerülték az aranyszemcsék (4. ábra). A sorozatmetszeteken végig követett boutonokban található aranyszemcsék száma becsléseink alapján legalább volt boutononként a ccb 1 és darab az ncb 1 antitest esetében. A CB 1 -pozitív axonok minden esetben szimmetrikus szinapszist formáltak posztszinaptikus partnereikkel, aszimmetrikus szinapszist egyetlen esetben sem lehetett megfigyelni, célzott kereséseink ellenére sem. Ez arra utal, hogy a CB 1 receptor a GABA-erg interneuronok axonterminálisain fejezodik ki. A 102 megvizsgált CCK-pozitív axonterminális szinte valamennyi esetben hordozta a CB 1 receptort a felszínükön. Ezzel ellentétben a másik periszomatikus gátlósejt típus, a PV-pozitív sejtek axon végzodései CB 1 -negatívnak bizonyultak, alátámasztva a már a sejttestek szintjén is megfigyelt expressziós szelektívitást (4 A,B. ábra). Az esetek nagy részében a PV-pozitív/CB 1 -negatív és a CB 1 -pozitív/pv-negatív axonvégzodések egymás közvetlen közelében képeztek szimmetrikus szinapszist, gyakran ugyanannak a posztszinaptikus sejtnek a sejttestén, kizárva ezzel annak a lehetoségét, hogy az adott PV-pozitív bouton CB 1 -negativitásának hátterében penetrációs probléma áll. Összességében tehát megállapítható, hogy a patkány hippokampuszában a CB 1 kannabinoid receptort a CCK-pozitív interneuronok szintetizálják. A CB 1 immunoreaktivitás specifikussága Mivel a CB 1 receptor génkiütött egerekben a kannabinoidok kötodése teljesen megszunik, ezért mi is megvizsgáltuk, vajon az egyezo lokalizációs mintázat a CB 1 receptor elleni antitesteink specifikusságának köszönheto-e? Dr. Catherine Ledent, a 49

50 4. ábra. A-D) Az intracelluláris COOH-terminális epitóp elleni antitesttel festett CB 1 receptor szubcelluláris eloszlása. Az ezüsttel intenzifikált aranyszemcsék jelölik az immunpozitív helyeket (kis nyilak). A jelölés a tipikus GABAerg szimmetrikus szinapszist (nagy nyilak) adó axonterminálisok (b) belso membránfelületén látjuk. Az aszimmetrikus szinapszist (üres nyíl) adó terminálisok (csillag az A képen) mindig immunonegatívak voltak. A,B) A stratum radiatumban dendritággal szinaptizáló bouton és C,D) sejttesten szinaptizáló bouton sorozatmetszetei. E,F) A CB 1 receptor (NH 2 -vég elleni antitest, extracelluláris ezüst-arany jelölodés) és a diffúz, homogén elektrodenz DAB végtermékkel jelölt CCK kolokalizációja. A nagy nyíl szimmetrikus szinapszist jelöl. G) A parvalbuminnal (csillag, DAB-termék) nem kollokalizál az ezüst-arany jelölésu CB 1 receptor. Mindkét terminális szimmetrikus szinapszist formál egy piramissejt ugyanazon proximális dendritjén. brüsszeli egyetem kutatója ehhez CB 1 receptor génkiütött (-/-) és vad típusú (+/+) egereket bocsátott a rendelkezésünkre 211. A vad típusú egerekben a patkányban látott festodési mintázatot figyelhettünk meg, viszont a CB 1 receptort nem tartalmazó egerek esetében egyik antitest sem mutatott semmilyen immunfestést. Ezzel szemben a CB 1 génkiütött egerek más interneuronális neurokémiai markerekre, mint például a kolecisztokinin (CCK) és a parvalbumin (PV), ugyanolyan immunfestési mintázatot mutattak, mint vad típusú társaik. 50