A humorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780)-fertőzöttség esetén

Átírás

1 Parasit. Hunç A humorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780)-fertőzöttség esetén IV. A specifikus ellenanyagok izolálása Dr. NÉMETH István A Magyar Tudományos Akadémia Állategészségügyi Kutató Intézete, Budapest A Taenia pisiformis /Bloch, 1780/ Gmelin 1, 1790 /Cestoda: Taeniidae/ oncosphaeráival fertőzött nyulak vérsavójában a k i f e j l e t t galandférgek vagy lárvaformák antigénkomponensei ellen ható ellenanyagok jelennek meg. Ezek az ellenanyagok gyürüs-precipitációs próbával /14, 77/, mesterségesen keltetett aktiv oncosphaerák felhasználásával végzett in vitro lárvaprecipitációs próbával /70, 71/, agargéldiffuziós-precipitációs próbával /51, 53,54/, komplementumkötési próbával /77/,valamint indirekt hemagglutinációs próbával /51,77/ kimutathatók. Korábbi' vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a T T pisi formi s-on cosphae rákkal történő kisérleti fertőzés hatására a nyulakban kialakuló humorális ellenanyagválasz heterogén. E parazita támadásával szemben ugyanis elsősorban IgG immunglobulinosztályba tartozó ellenanyagok termelődnek, a reinfekció után azonban a vérsavókban, amelyek magasabb titerben tartalmaztak ellenanyagokat, IgM tipusu ellenanyagokat is sikerült kimutatni /55, 56/. Ezeket az ellenanyagokat eddig még nem izolálták. Ez a dolgozat azokat a vizsgálatokat foglalja össze, amelyek során megkíséreltük az ellenanyagokat immunkémiailag tiszta formában kinyerni T. pisiformis-petékkel mesterségesen fertőzött állatok vérsavójából specifikus immunadszorbens segítségével.

2 Anyagok és módszerek An t i gé ne k Az immunadszorbens preparálásához és az agargéldiffuziós-precipitációs próbában antigénként a nyers állapotban homogenizált fertőzőképes cysticercusokból készitett teljes kivonat savban oldódó frakcióját használtuk /53,54/. Az indirekt hemagglutinációs próbában használt antigén LANCE- FIELD /41/ eljárása szerint T. pisiformisból készült a korábban l e i r t módosítással /51/. An tise rumok A nyul-serumfehérjéket precipitálo polispecifikus kecskeimmunserum, az anti-nyul IgG és IgM juhimmunserum, továbbá a monospecifikus anti-nyul IgG juhserum, és az anti-nyul IgM juhserum előállitása a korábban l e i r t módon történt /55, 56/. Taenia pisiformis-petékkel mesterségesen fertőzött nyulak vérsavója Húsz 5-6 hetes korú, g sulyu, fehér uj-zélandi nyúlnak állatonként 500 petét adtunk be fecskendőre szerelt szondán át közvetlenül a gyomorba. A petéket mesterségesen fertőzött kutyákból spontán ürülő gravid izekből a korábban l e i r t módon i - zoláltuk /52/. A fertőzést követő 40. napon a nyulak felét az a. carotison keresztül elvéreztettük, a másik felét pedig a 60. napon petével ismét fertőztük, és az ezt követő 40. napon véreztettük e l. Az agargéldiffuziós-precipitációs próbában precipitálo vérsavókat kiválogattuk, majd az indirekt hemagglutinációs próbában /IHA/ közel azonos titerben reagálókat összekevertük. Ilyen módon az ellenanyagok izolálásához négyféle serumkeveréket állítottunk elő: az I. és I I. keverék, amelyek

3 HA-titere 1:640, illetve 1:160 volt, az első fertőzést követő 40. napon vett vérsavókból, a I I I. és IV, keverék /HA-titer 1:1536, illetve 1:4096/ pedig a második feotőzés után a 40, napon vett vérsavókból készült, A vérsavókat konzervélószer nélkül -20 C-on megfagyasztva tároltuk felhasználásukig. Az immunadszorbens előállítása Az immunadszorbenst az antigénoldatban lévő fehérjéknek AVRA- MEAS és TERNYNCK /3/ eljárása szerint glutáraldehiddel végzett polimerizálásával állitottuk elő. Száz mg fehérjét tartalmazó antigénoldathoz vivőfehérjeként 200 mg bovin serumalbumint + adtunk, és a keveréket többször váltott acetát-pufférrel /0,2 M ph 5,0/ szemben 6 órán át dializáltuk folyamatos mágneses keverés mellett. Ezután a ph-t ellenőriztük, és ha szükséges volt, M acetát-pufferrel /ph 5,0/ pontosan beállítottuk, majd minden 100 mg fehérjéhez állandó keverés mellett 15 mg glutáraldehidet + + adtunk 2,5 %-os vizes oldatban, és a keveréket másnapig szobahőn hagytuk állni. A keverékben a fehérjék végső koncentrációja a glutáraldehid hozzáadása után 20 mg/ml körül volt. A képződött gél további kezelése mindenben azonos volt AVRAMEAS és TERNYNCK /3/ által leírtakkal. Az ellenanyagok adszorbeálása és eluálása Az ellenanyagok izolálása a fertőzött nyulak vérsavójából AVRA MEAS és TERNYNCK /3/ által l e i r t "batchwise procedure" szerint történt. Az előzetesen zsirtalanitott vérsavókhoz megfelelő mennyiségű immunadszorbenst adtunk centrifugacsövekben, és a szuszpenziót 30 percig lassan kevergettük szobahőn, majd 3000 fordulattal 15 percig centrifugáltuk +4 C-on. Ha a szupernatánsban IHA-próbával ellenanyagokat lehetett kimutatni, a müveletet ujabb adag adszorbenssel megismételtük. Az immunadszor- + Phylaxia Oltóanyag- és Tápszertermelő Vállalat, Budapest + + Reanal, Budapest

4 bens-ellenanyag komplexet ezután 100 ml izotóniás konyhasóoldatban szuszpenzálva mostuk, majd 3000 fordulattal 15 percig centrifugáltuk. A centrifugálással egybekötött mosást addig folytattuk, amig a felüluszó fényadszorbciója 280 myu/-nál kb. 0,02 l e t t. A mosófolyadékot összegyűjtöttük, ultraszüréssel bekoncentráltuk, és IHA-próbával ellenanyagok jelenlétére megvizsgáltuk. Az adszorbeált fehérjék eluálását 0,1 M glikokoll-hcl-pufférrel /ph 2,8/, illetve 0,05 M Tris-HCl-pufferben /ph 7,5/ oldott 2,5 M és 5,0 MgCl 2 -oldattal végeztük. Az előbbi esetben a mosott immunadszorbenst 4 ml eluensben szuszpendálva 10 percig kevertük szobahőn,majd 15 percig fordulattal centrifugáltuk +4 C-on, és az egész müveletet kétszer megismételtük. Az utóbbi esetben az eluálás kétszer ml 2,5 M MgCl,.,- és egyszer 20 ml 5,0 M MgCl 2 -oldattal történt az előbbiekkel azonos módon. A centrifugálás után az eluátumokat összekevertük, azbesztlapon szűrtük, sürün váltott izotóniás konyhasóoldattal dializáltuk, ultraszüréssel koncentráltuk, és végül 0,01 % mertiolátot tartalmazó PBS-oldat /0,04 M ph 7,3/ elleni dializálás után +4 Con tároltuk. Az ellenanyagok kimutatása A vérsavókban és az ellenanyag-preparátumokban az antitesteket IHA-próbával és agargéldiffuziós-precipitációs próbával mutattuk ki a korábban leirtak szerint /51,53,54,56/, Az ellenanyag-tartalom meghatározása A különböző nyulvérsavók ellenanyag-tartalmát kvantitativ precipitációs módszerrel állapítottuk meg, amit a szokásos módon

5 1. táblázat Table 1. Az ellenanyag-kinyerés a fertőzött nyulak vérsavójából az ellenanyagoknak az immunadszorbensre történt adszorbeálása és eluálása után Yield of antibodies eluted after absorption of different sera from infected rabbits on the immunoadsorbent Az < adszorbeál Lt vérsavó < ellen j e l zése anyag- fehér j e A g /ml HAtiter térfogata (ml) Az immunadszorbensről eluált anyag glikokoll-hcl-puffer 2,5 és 5,0 M MgCl 2 0,05M 0,1 M ph 2,8 Tris-HCl-pufferben ph Összes eluált fehérje (mg) HAtiter 3 0 * 7,5 Összes eluált fehérje (mg) HAt i t er ï 3 f I. I I. I I I. IV :640 1:160 1:1536 1: ,0 (83,3%)* 4,4 (88,0%) 15,8 (96,3%) 17,2 (90,6%) 1:512 1:128 1: :3072 6,2 (64,6%) 3,2 (64,0%) 9,0 (54,9%) 11,0 (61,1%) 1:384 1:96 1:768 1:2048 A zárójelben feltüntetett számok az ellenanyag-kinyerést tüntetik fel, az immunadszorbensről eluált fehérjék mennyiségét a t e l j e s vérsavó ellenanyagfehérje-tartalmának %-ában k i fej ezve. (Numbers in brackets express the yield in antibody}calculated from antibody protein content of whole serum versus eluted protein) ^Az eluált anyag még teljes hemagglutinációt eredményező legnagyobb higitása, ha az eluátumok 20 ml-re voltak koncentrálva. (The highest dilution of the eluted material s t i l l giving f u l l haemagglutionatlon when the eluates were concentrated to 20 ml)

6 hajtottunk végre /24/, a Folin-Ciocalteu reakciót alkalmazva az immunprecipitátum fehérjetartalmának mérésére. A meghatározásokat 2 ml vérsavóból 3 paralellel végeztük. Az IgG- és IgM-globulinok kvantitatív meghatározása Az eluatumok az IgG és az IgM mennyiségét monospecifikus antinyul IgG juhvérsavó, illetve anti-nyul IgM juhvérsavó segítségével FAHEY és McKELVEY / 26/ módszere szerint közvetlen radiál i s immundiffúzióval határoztuk meg. Az immunelektroforetikus analíziseket, az ultraszürést és a vérsavók zsirtalanitását a már l e i r t módon végeztük /55,56/. Eredmények Az inszolubilizált antigénnel történt adszorbeálás után a vérsavókban ellenanyagokat sem az IHA, sem az agargéldiffuziósprecipitációs próbával nem lehetett kimutatni. Az immunadszorbens-ellenanyag komplex mosófolyadékában sem voltak ellenanyagok. Az immunadszorbenshez kapcsolódott fehérjéknek a kétféle szolvenssel végzett eluciójára vonatkozóan kapott eredményeket az 1. táblázat tünteti f e l. Az egyes preparálások alkalmával az immunadszorbensről visszanyert fehérjék összmennyisége a 0,1 M ph 2,8 glikokoll-hcl-pufférrel végzett eluálás esetén %- át, a MgCl 2 -oldattal történt eluálás esetén pedig %-át tette ki a vérsavók ellenanyagfehérje-tartalmának. A bekoncentrált eluatumok /1-4 mg fehérje/ml/ géldiffuziós analizise monospecifikus anti-nyul IgG-, illetve anti-nyul IgM, valamint polispecifikus anti-nyul immunvérsavóval különbségeket mutatott ki az immunadszorbensről a kétféle eluenssel nyert a- nyag fehérjeösszetételében, noha az ellenanyagok adszorbeálása a vérsavókból mindig ugyanabból a tételből vett friss immunad-

7 szorbenssel történt. Amig ugyanis az immunadszorbensről MgC^oldattal eluált anyag valamennyi vérsavókeverék esetében csak IgG-t tartalmazott, addig a ráfertőzés után a 40. napon vett vérsavók / I I I. és IV. keverék/ esetében a 0,1 M ph 2,8 glikokoll-sósav-pufférrel nyert eluátumokban az IgG-globulinon kivül IgM-t is ki lehetett mutatni. Az egyszer fertőzött állatok vérsavójából /I. és I I. serumkeverék/ ez utóbbi módon nyert anyag azonban szintén csak IgG-t tartalmazott. Az IgG-től és az IgMtől eltérő tipusu serumfehérjéket a polispecifikus anti-nyul kecske immunsavóval nem lehetett egyetlen ellenanyag-preparátumban sem kimutatni. Az eluatumok immunelektroforétikus vizsgálata a géldiffuziós a- nalizissel kapottakkal megegyező eredményekre vezetett. Egyik ilyen vizsgálat eredményét reprezentálja az 1. ábra. Az IgG-nek megfelelő precipitációs iv valamennyi ellenanyag-preparátum e- setében kialakult, az IgM-nek megfelelő ivet pedig csak a I I I. és IV. vérsavókeverék esetében az adszorbensről 0,1 M ph 2,8 glikokoll-sósav-pufférrel eluált anyagok vizsgálatakor lehetett megfigyelni. Más tipusu se rumfehérjéket az alkalmazott polispecifikus anti-nyul kecskevérsavó nem mutatott ki egyetlen preparátumban sem, noha ez az immunserum a normál nyulvérsavó immunelekt roforézises analizise folyamán legalább különböző antigenitásu serumkomponenssel reagált. A különböző vérsavókeverékekből nyert immunglobulinok összmenynyiségét a 2. táblázat tünteti f e l. A közvetlen radiális immundiffuzióval meghatározott IgG és IgM összmennyisége megközelítően azonos volt a Folin-Ciocalteu-fenol-reagenssel megállapított összfehérje-mennyiségével.az IgM-globulin mennyisége mindössze 8,1-9,4 %-át tette ki az eluatumok összimmunglobulin-tartalmának Az immunadszorbensről eluált fehérjék ellenanyag-aktivitását géldiffuziós-precipitációs és IHA-próbával mutattuk ki.az agargéldif fuziós-precipitációs próbában valamennyi vérsavó precipitációt hozott létre az antigénoldattal. A legerősebb precipitációs sáv a serumtartály közelében helyeződött. Ezen a vonalon

8 2. táblázat Table 2. Az intmunadszorbensről eluált IgG- és qsszmennyiség e IgM-immunglobulinok Total quantities of IgG and IgM immunglobulins eluted from the immunoadsorbent Az adszorbeált vérsavók Glikokoll-HCl-puffer 0,1 M Ph 2,8 2,5 és 5, 0 M MgCl 2 0,5 M ph 7,5 Tris-HCl -pufferben j elzése térfogata (ml) IgG mg IgM mg IgG mg IgM mg I. 20 8,4 0 6,4 :. 0, I I. 20 4,8 0 3,6 0 I I I ,8 1,3 9,2 0 IV ,8 1,64 11,2 0

9 kivül, amely minden vérsavó esetében megtalálható volt, az I. vérsavókeverék még egy, a I I I. és IV, vérsavókeverék pedig két gyengébb, az előbbitől az antigéntartály felé helyeződő precipitációs csikót is kialakitott. Az ellenanyag-preparátumok szintén precipitálták az antigént, és a kialakult precipitációs vonalak teljes azonossági reakciót adtak az eredeti vérsavók által létesitett precipitációs vonalakkal /2. ábra/. Meg kell jegyezni, hogy a különböző vérsavók és az ellenanyag-preparátumok esetében az egyes precipitációs sávok más és más antigénkoncentrációnál alakultak ki optimálisan, ezért valamennyi precipitációs vonalat nehéz egyetlen lemezen demonstrálni. Az IHA-próbával ugyanazon a napon azonos vörösvérsejt-adaggal végzett vizsgálatok eredményeit feltüntető 1. táblázatból látható, hogy.az ellenanyag-preparátumok által adott reakció t i t e - re, ha az eluatumok a preparáláshoz felhasznált vérsavó volumenével azonos térfogatra /20 ml/ voltak koncentrálva, a 0,1 M ph 2,8 glikokoll-hcl-pufférrel történt eluáláskor %-a, az MgCl 2 ~oldatot alkalmazva eluensként pedig %-a volt a vérsavók eredeti hemagglutinációs titerének. Amikor azonban az e- luátumok ugy voltak koncentrálva, hogy fehérjetartalmuk megközelítően azonos volt az eredeti vérsavók ellenanyagfehérje-tartalmával, az ellenanyag-preparátumok és a teljes vérsavók közel azonos titerben adtak reakciót, A különböző preparátumokban a minimális ellenanyagfehérje-mennyiség, amely még teljes hemagglutinációt eredményezett, 0,27 és 1,72 yag/ml között ingadozott, és ugyanabba a nagyságrendbe tartozott, mint az eredeti vérsavók esetében még teljes reakciót adó legkisebb ellenanyagfehérje-mennyiség /0,17-1,56 uo,/ml/. Megbeszélés AVRAMEAS és TERNYNCK /3/ i r t a le, hogy ha fehérjeoldatokhoz glutáraldehidet adunk, az oldott állapotban lévő fehérjékből oldhatatlan származékok keletkeznek azáltal, hogy a glutáraldehid az egyes fehérjemolekulák között szabad aminocsoportjaikon keresztül kovalens keresztkötéseket létesit. Különféle protein-

10 1. ábra Az immunadszorbensről eluált fehérjék immunelektroforézises analizise. 1 és 3. Az I., illetve a I I. serumkeverékből izolált anyag /eluálás 0,1 M ph 2,8 glikokoll-hcl-pufférrel/; 2. Normál nyulvérsavó; 4 és 5. A I I I. serumkeverékből izolált anyag, eluálás M MgCl 2 -oldattal, illetve 0,1 M ph 2,8 glikokoll-hcl-pufferrel; A. Nyul-serumfehérjéket precipitálo kecskeimmunsavó; B. Anti-nyul IgG és IgM juhvérsavó; C. Anti-nyul IgM juhvérsavó. Fig. 1. Immunelectrophoretic analysis of proteins eluted from the immunadso rbent. 1 and 3. Material isolated from serum pool I. and I I., respectively /eluted with 0,1 M ph 2,8 glycine-hcl-buffer/; 2. Normal rabbit serum; 4 and 5. Material isolated from serum pool IV./eluted with MgCl 2 solution and 0,1 M ph 2,8 glycine-hcl buffer, respectively/; A. Goat anti-whole rabbit serum; B. Sheep anti-rabbit IgG and IgM immune serum ; C. Sheep anti-rabbit IgM immune serum. 2. ábra A fertőzött nyulak teljes vérsavójában és az immunadszorbensről eluált anyagban lévő precipitálo ellenanyagok vizsgálata agargéldiffuziós-precipitációs próbában. A rezervoárok a következő reagenseket tartalmazták: 1. I. serumkeverék ; 2. Az I. serumkeverékből izolált anyag /két különböző preparálás/; 3. I I. serumkeverék; 4. A I I. serumkeverékből izolált anyag /három különböző preparálás/; 5. A III.seru-mkeverékből izolált anyag; 6. I I I. serumkeverék; 7. Normál nyulvérsavó; 8. A IV. serumkeverékből izolált anyag; 9. IV. serumkeverék; 10. PBS /0,01 M ph 7, 1/; 11, 12, 13, 14 és 15. Antigénoldat 4, 8, 12, 6 illetve 3 mg fehérje/ml. Fig. 2. Gel diffusion analysis of precipitating antibodies in whole serum of infected rabbits and in material eluted from immunadsorbent. Wells were f i l l e d as follows: 1. Serum pool I c ; 2. Isolated material from serum pool I. ; /Two different preparations/; 3. Serum pool I I. ; 4. Material isolated from serum pool I I. /Three different preparations/; 5. Material isolated from serum pool, I I I. ; 6. Serum pool I I I. ; 7. Normal rabbit serum; 8. Material isolated from serum pool IV. ; 9. Serum pool IV.; 10. PBS /0,01 M ph 7,1/; 11, 12, 13, 14 and 15. Antigen solutions containing 4, 8, 12, 6 and 3 mg/ml protein, respectively.

11 antigén - anti-protein ellenanyag rendszerekkel végzett vizsgálataikban megállapították, hogy az ilyen módon inszolubilizált fehérjeantigének specifikus és stabil immunadszorbensként használhatók, és segítségükkel a humorális ellenanyagok immunkémiailag tisztán kinyerhetők a vérsavókból. A féregantigének hatására képződött antitestek izolálására ezt a módszert először ESANDI /25/ alkalmazta, aki inszolubilizált juh-echinococcushólyag-folyadékot használva immunadszorbensként, tiszta formában tudta előállitani az echinococcus-ellenanyagokat a fertőzött, illetve echinococcosis ellen immunizált egyének vérsavójából. A Taenia pisiformis-petékkel történő fertőzések nyomán a nyulakban kialakuló humorális ellenanyagválasz tanulmányozása érdekében korábban végzett kisérletek kiderítették, hogy a cysticercosis lefolyása során a parazitaantigének túlnyomó részben IgG, kis részben pedig IgM tipusu antitestek termelődését indukálják /55,56/. Ezt a megállapítást erősitik meg ebben a dolgozatban közölt vizsgálatok i s, amelyekben a glutáraldehid-immunadszorbens segítségével sikerült tiszta formában nyerni ezeket az ellenanyagokat a fertőzött nyulak vérsavójából. Az ellenanyag-preparátumok ugyanis az esetek többségében kizárólag IgGglobulinból álltak, IgM tipusu ellenanyag-fehérjéket csak a kétszer fertőzött állatok vérsavójából - amelyeknek ellenanyagtitere magasabb volt - előállitott preparátumok tartalmaztak, de ezek is csupán alacsony koncentrációban. Mennyiségük mindössze 9-10 %-a volt az IgG-ellenanyagok mennyiségének. Az első fertőzés után vett vérsavókból IgM tipusu ellenanyagokat feltehetően azért nem sikerült kinyerni, mert ilyeneket vagy egyáltalán nem, vagy pedig csak olyan alacsony koncentrációban tartalmaztak, ami alatta maradt a kimutatásukra alkalmazott módszerek érzékenységének. Minden egyes preparátum immunkémiailag tisztán tartalmazta az ellenanyagokat, mivel az IgG- és IgM-globulinoktói eltérő serum fehé r j éket egyáltalán nem lehetett bennük - legalábbis az

12 alkalmazott polivalens anti-nyul immunsavó segitségével - az immunelektroforézises és géldiffuziós analízisek során kimutatni. A tisztán kinyert ellenanyag-fehérjék mennyisége az eredeti vérsavók ellenanyagfehérje-tartalmának %-a között ingadozott, ami megfelel más antigén-ellenanyag rendszerek esetében kapott ellenanyag-kinyerésnek /3,25/. Ha az immunadszorbensről a megkötött ellenanyagok 0,1 M ph 2,8 glikokoll-sósav-pufferrel voltak eluálva, lényegesen több ellenanyagot lehetett visszanyerni, mint amikor az eluálás 2,5 és 5,0 M MgCl 2 -oldattal történt. Ezt, a kétféle szolvens hatásmechanizmusában fellelhető különbségeken tul /3/, két körülmény magyarázza. Az inszolubilizált antigén egyfelől nagyon nehezen ülepedett a koncentrált MgCl 2 ~oldatokban, s ezért minden centrifugálás alkalmával az immunadszorbens egy része és vele együtt a még nem eluálódott ellenanyagok is elvesztek. Másfelől az eluált fehérjéket tartalmazó oldatból a MgCl 2 ~t kidializáiva, az oldat térfogata e- rősen megnövekedett, az ezt követő koncentrálás során pedig mindig keletkezett több-kevesebb oldhatatlan csapadék. Mivel közismerten a makroglobulinok hajlamosak elsősorban az aggregálódásra, ez a csapadékképződés lehetett az oka annak i s, hogy az MgCl 2 ~oldatokkal végzett eluálással egyáltalán nem lehetett IgM-ellenanyagokat visszanyerni, noha az alkalmazott inszolubilizált antigén ezeket is kétségtelenül adszorbeálta, amit a másik szolvenssel történt eluáláskor kapott eredmények bizonyítanak. Az inszolubilizált antigének segitségével kinyert ellenanyagfehérjék megőrizték az antigénhez való specifikus kötődési képességüket, amit az indirekt hemagglutinációs és az agargéldiffuziós-precipitációs próbával kapott eredmények bizonyítanak. Az ellenanyag-preparátumok az eredeti vérsavókhoz viszonyitva rendszerint alacsonyabb titerben adtak reakciót az IHA-próbában. Ez a titercsökkenés azonban nem az ellenanyagok kötődési készségének csökkenésére, hanem a procedura alatt bekövetkezett tényleges ellenanyagfehérje-veszteségre vezethető vissza. Ha u- gyanis az ellenanyag-preparátumban a fehérjék koncentrációja

13 kb. azonos volt az eredeti vérsavó ellenanyagfehérje-tartalmával, akkor a HA-titerek is közel egyformák voltak. Másfelől a HA-próbában még teljes hemagglutinációt eredményező legkisebb ellenanyagfehérje-mennyiség az eredeti vérsavók és az ellenanyag-készitmények esetében egyaránt azonos nagyságrendbe tartozót t Az ellenanyagok izolálásához felhasznált savban oldódó frakció komplex antigenitásu: a géldiffuziós analizis szerint legalább három eltérő antigénkomponensből áll. Mivel az agargéldiffuziós-precipitációs próbában az ellenanyag-preparátumok ugyanazokat a precipitációs vonalakat alakították k i, mint a teljes vérsavók, ez arra utal, hogy a tisztán előállított ellenanyagok megtartották reagálóképességüket mindazokkal az antigénkomponensekkel, amelyekkel az eredeti vérsavók ellenanyagai reagáltak. Számos irodalmi adat utal arra, hogy a Taenia pisiformis-oncosphaerák támadásának kitett nyulakban protektiv hatású ellenanyagok termelődnek /4,14,38,43,44,72/. Ezek az ellenanyagok a fertőzött nyulak vérsavójával passzive átvihetők, és ha a vérsavót kellő adagban szimultán alkalmazzuk a fertőzéssel, kifejezett passziv védelmet képesek kialakítani fogékony állatokban e parazita inváziójával szemben. Ezt erősítették meg saját korábbi vizsgálatok is /52/. A protektiv tulajdonságú humorális ellenanyagok termelődését indukáló antigéneket azonban ma még nem ismerjük, és természetükre vonatkozóan csak inkább feltevésekre, mintsem bizonyítékokra támaszkodhatunk. Mivel e dolgozatban közölt vizsgálatok szerint a fertőzött állatok vérsavójából az ellenanyagok viszonylag egyszerű módszerrel immunkémiailag tisztán és akár nagyobb mennyiségben is izolálhatóak 1, ez jó lehetőséget nyújt arra, hogy az ellenanyagok védő hatását passziv immunizálási kísérletekben más serumfaktoroktól függetlenül vizsgálhassuk, s igy talán közelebb juthatunk majd a protektiv ellenanyagok termelődéséért végső soron felelős féregantigének megismeréséhez i s.

14 össze foglalás Taenia i pisiformis-petékkel mesterségesen fertőzött nyulak vérsavójából sikerült immunkémiailag tiszta formában előállitani az indirekt hemagglutinációs és géldiffuziós-precipitációs próbával kimutatható ellenanyagokat olyan immunadszorbens segitségével, amely a fertőzőképes cysticercusok nyers kivonatának savban oldódó frakciójában lévő antigéneknek glutáraldehiddel végzett inszolubilizálásával készült. Az ellenanyagok zöme IgG-globulin. Az ujrafertőzött állatok vérsavójából előállitott ellenanyag-preparátumok azonban emell e t t IgM-globulint is tartalmaztak. Más serumkomponenseket polivalens anti-nyul immunsavó segitségével sem az immunelektroforézises, sem az immundiffuziós analizisek során nem lehetett kimutatni. A különböző preparálások során az ellenanyag-kinyerés az eredet i vérsavók ellenanyagfehérje-tartalmának %-a között ingadozott. Az agargéldiffuziós-precipitációs és az indirekt hemagglutinációs próbával végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a vérsavókból tisztán kinyert ellenanyagok megtartották az antigénekhez való specifikus kötődési képességüket. NÉMETH, I.: Studies on Humoral Antibodies in Experimental Infections of Rabbits with Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780) IV. Isolation of Specific Antibodies Antibodies detectable by indirect hemagglutination and gel diffusion precipitation test were isolated from the serum of rabbits experimentally infected with Taenia pisiformis eggs using a specific immunoadsorbent prepared by polymerization of the acid soluble fraction of Cysticercus crude extract with glutaraldehyde. Most isolated antibodies belonged to the IgG class, but antibody preparations from sera of reinfected rabbits contained also

15 IgM antibodies. No other serum components were detected in the various antibody preparations by immunoelectrophoretic and immunodiffusion analysis in agar gel using a polyvalent antirabbit immune serum. The antibody yield of the different preparations varied between 54 and 96 % of the antibody content of the original serum sample. The isolated antibodies retained their antigen combining activity as shown by agar gel diffusion precipitation and indirect hemagglutination tests. Köszönetnyilvá ni tá s. A szerző hálás köszönetét fejezi ki HALASI Ilona laboratóriumi asszisztensnek a vizsgálatok során nyújtott értékes technikai segítségéért. Irodalom 1. ALTEMEIER, W.A. - ROBBINS, 3.B. - SMITH, R.T.: Quantitative studies of the immunoglobulin sequence in the response of the rabbit to a somatic antigen Exp.Med., ARMSTRONG, A.S. - SWORRD, O.P.: Antibody responses in experimental infections with Listeria monocytogenes Immunol., AVRAMEAS, S. - TERNYNCK, T.: The cross-linking of proteins with glutaraldehyde and i t s use for the preparation of immunoadsorbents. - Immunochemist ry, 6_ BACHMANN, P.A.: Versuche zur Immunisierung von Kaninchen gegen Cysticercus pisiformis. - Thesis. Berlin, BACKHAUSZ, R.: Immunodiffusion und Immunoelektrophorese. - Akad. Kiadó, Budapest, BAISDEN, L.A. - TROMBA, F.G.: Separation of swine kidney worm /Stephanurus dentatus/ antigens by zone and by barrier electrophoresis. - 3.Parasit., 53_

16 7. BAUER, D.C. - STAVITSKY, A.B.: On the different molecular forms of antibody synthesized by rabbits during the early response to a single injection of protein and cellular antigens. - Proc, Nat. Acad.Sei., 4J , BAUER, D.C. - MATHIES, M.3. - STAVITSKY, A.B.: Sequence of synthesis of gamma-1 macroglobulin and gamma-2 globul i n antibodies during primary and secondary responses to proteins, salmonella antigens and phage. - 3, Exp. Med., BENEDICT, A.A.: Sensitivity of passive haemagglutination for assay of 7S and 19S antibodies in primary rabbitanti-bovine serum albumin sera. - Nature, BENEDICT, A.A. - BROWN, R.3. - AYENGAR, R.: Physical properties of antibody to bovine serum albumin as demonstrated by haemagglutination Exp. Med., BIGUET, 3. - TRAN VAN KY, P. - MOSCHETTO, Y. - GNAMEY-KOF- FY, D, : Contribution a l'étude de la structure antigenique des larves de Trichinella spiralis et des preeipitines expérimentales du lapin. - Wiad.Parazyt BOREL, Y. - FAUCONNET, M. - MIESCHER, P. A.: 7S versus 19S anamnestic response in rabbits. - Proc.Soc. Exp.Biol. Med., CAMPBELL, D. H.: The immunological specificity of a polysaccharide fraction from some common parasitic helminths. - 3, Parasit., CAMPBELL, D, H.: The specific absorbability of protective antibodies against Cysticercus crassicollis in rat and C. pisiformis in rabbits from infected and a r t i f i c i a l l y immunized animals. - J. Immunol., 35_ CARTER, B.G. - HARRIS, T.N.: Non-precipitating rabbit antibody to hapten: Purification and properties. - Immunology,

17 16. CEBRA, ROBBINS, 3. B.: Gamma A-immunoglobulin from rabbit colostrum Immunol., , 17. CHASE, M.W. - WILLIAMS, C.A.: Protein analysis. In: Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol. I I, Ed, C.A. Williams and M. W. Chase, Acad. Press, New York/London, COHEN, S. - PORTER, R.R.: Structure and biological activity of immunoglobulins. - Adv. Immunol., 4, COHEN, S. - MILSTEIN, C.: Structure and biological properties of immunoglobulins. - Adv. Immunol., CRAIG, L. C.: Dialysis and u l t r a f i l t r a t i o n. In: Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol. I I., Ed. C. A. Williams and M.W. Chase, Acad. Press, New York/London CRANDALL, R.B. - CEBRA, CRANDALL, C.A.: The relative proportions of IgG-, IgA- and IgM-containing cells in rabbit tissues during experimental trichinosis. - Immunology, _ CRANDALL, R.B. - MOORE, L.L.A.,3r.: The macroglobulin antibody response in experimental trichinosis Inf. Dis DEUTSCH, H. F. - MORTON, 3. I. : Dissociation of human serum macroglobulins. - Science, DÉVÉNYI, T. - GERGELY, 3.: Aminosavak, peptidek, fehérjék. - Medicina, Budapest ESANDI, M.V.P.: Isolation and characterization of antibodies from sera of humans infected with Echinococcus granulosus Parasit., 56_ FAHEY, 3.L. - McKELVEY, E.M.: Quantitative determination of serum Immunglobulins in antibody-agar plates Immunol., FREEMAN, M.3. - STAVITSKY, A.B.: Radio-immunoelectrophoretic study of rabbit anti-protein antibodies during the primary response Immunol., 95_. 981, 1965, 28. GEYER, E,: Pathologie und Immunität bei der Strongyloidiasis des Kaninchens, - Z. Parasitenkde, 25_, 240, 1965, 29. GREENBURY, C.L. - MOORE, D.H. - NUNN, L.A.C.: Reaction of 7S and 19S components of immune rabbit antisera with

18 human Group A and AB* red cells. - Immunology, GREY, H.M.: Studies on changes in the quality of rabbit bovine serum albumin antibody following immunization. - Immunology, GUNDLACH, 3.L.: A study of the phenomena of immunity in the course of experimental fasciolosis in rabbits. - Acta Parasit. Pol., HILLYER, G.V. - FRICK, L.P.: Immunoprecipitins in Schistosoma mansoni infections. I. Mouse infections. - Exp. Parasit., HILLYER, G.V. - HITCHIE, L.b.: Immunoprecipitins in Schistosoma mansoni infections. I I. Cercopithecus sabaeus and Macaca mulatta monkeys. - Exp. Parasit., HILLYER, G.V. - FRICK, L.P.: Immunoprecipitins in Schistosoma mansoni infections. I I I. Cercopithecus sabaeus and Macaca mulatta monkeys exposed to irradiated cercariae and subsequently challenged. - Exp. Parasit., HILLYER, G.V.: Immunoprecipitins in Schistosoma mansoni infections. IV, Human infections. - Exp. Parasit., HOCKER, N.D. - BAUER, D.C.: The nature of antibodies synthesized during the immune response to Leptospira biflexa Immunol., KERR, K, B.: Immunity in rabbits against one of i t s Cestode parasite, Cysticercus pisiformis. - 3, Parasit., 20, , /Suppl./ 38. KERR, K. B.: Immunity against a cestode parasite, Cysticercus pisiformis, - Am. 3. Hyg., 22, KÜHN, 0.: Methode der Titerberechnung mit Hilfe duadischer Logaritmen. - Z. Immunf, Exp. Ther., KWAN, C. K.: Trichinella spiralis: IgM and IgG and i n f e c t i - vity for mice. - Exp. Parasit., LANCEFIELD, R. C.: The antigenic complex of Streptococcus haemolyticus. I. A-l-type-specific substance in ex-

19 tract of Streptococcus haemolyticus - 3.Exp.Med., LE3KINA, E.Sz. - BALLAD, N.E.: Izucsenije dinamiki nakoplenija i tipov antitel u t e l j a t, iszkusztvenno zarazsennüh ciszticerkami Cysticercus bovis. - Med. Paraz i t. Parazit. Bol., LEONARD, A.B.: The accelerated tissue response to Cysticercus pisiformis in passively immunized rabbits. - Am. 3. Hyg., LEONARD, A.B. - LEONARD, A.E.: The intestinal phase of the resistance of rabbits to the larvae of Taenia pisiformis Parasit., LIEBMANN, H. - BOCH, 3.: Untersuchungen an Cysticercus pisi formis-befallenen Kaninchen. - Berl. Münch. Tieràrztl. Wschr., LINDQVTST, K. - BAUER, D. C.: Precipitin activity of rabbit macroglobulin antibody. - Immunochemistry, , LUPASCO, G. - HACIG, A. - SOLOMON, P. - IANCO, L.: Recherches sur la constitution et la spécificité des antigènes de Trichinella spiralis. - Arch. Roumain. Path. Exp. Microbiol., MAUSS, E.A.: The serum fraction with which anti-trichinella /Trichinella spiralis/ antibody is associated, - /Am. 3. Hyg. f MULHOLLAND, 3.H. - WOLF, S.M. - 3ACKS0N, A.L. - LANDY, M.: Quantitative studies of febrile tolerance and levels of specific antibody evoked by bacterial endotoxins Clin. Invest., MUNT3AN, N.A.: Antigennüj szosztav gidatidoznoj zsidkoszti, eksztraktov iz szkolekszov i germinativnüh obolocsek larvocisztü ehinokokka. - Med. Parazit. Parazit. Bol NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis. I. The suitability of agar gel diffusion precipitation and indirect haemagglutination tests. - Z. Immun. Allergieforsch.,

20 52. NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis.il. Transfer of immunity to Cysticercus pisiformis/bloch, 1780/ with parenterally administered immune serum or lymphoid cells. - Acta Vet. Acad. Sei.Hung., NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis. III.The precipitin response to experimental infection with Cysticercus pisiformis /Bloch, 1780/. - Acta Vet. Acad. Sei. Hung., NÉMETH, I. : A humorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis /Bloch, l780/-fertőzöttség esetén. I. A precipitinválasz általános jellemzése. - Parasit. Hung., NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis IV. - Acta Vet. Acad. Sei. Hung., /közlés alatt/ 56. NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis. V. - Acta Vet. Acad. Sei. Hung, /közlés alatt/ 57. ONOUE, K. - YAGI, Y - PRESSMAN, D.: Multiplicity of antibody proteins in rabbit anti-p-azobenzenearsenate sera Immunol., ONOUE, K, - TANIGAKI, N. - YAGI, Y. - PRESSMAN, D.: IgM and IgG anti-hapten antibody: Hemolitic, hemagglutinating and precipitating activity. - Proc.Soc.Exp.Biol.Med., ONOUE, K. - YAGI, Y. - PRESSMAN, D.: Isolation of rabbit IgA anti-protein antibody and demonstration of skinsensitizing activity in homologous skin. - 3.Exp.Med OSLER, A. G. - MULLIGAN, r. - RODRIQUEZ, E.: Weight estimates of rabbit antihuman serum albumin based on antigen-binding and precipitin analysis: Specific hemagglutinating activities of 7S and 19S components Immunol., 96_ PIKE.R.M.: Antibody heterogenety and serological reactions. - Bact. Rev., PIKE, R.M. - SCHULZE, M.L. - CHANDLER, CH.: Agglutinating

21 and precipitating capacity of rabbit anti-salmonella typhosa gamma-g and gamma-m antibodies during prolonged immunization Bact., 92! ROBBINS, 3. B. - KENNY, K. - SUTER, E. : The isolation and biological activities of rabbit gamma-m and gamma-ganti-salmonella typhimurium antibodies. - 3.Exp,Med., SADUN, E.H. - DUXBURY, R.E. - GORE, R.W. - STECHSCHULTE, D. 3.: Homologous passive cutaneous anaphylactic and fluorescent antibody reactions in rabbits infected with Dirofilaria uniformis Inf. Dis., SADUN, E.H. - MOTA, I. - GORE, R.W.: Demonstration of homocytotropic reaginlike antibodies in mice and rabbits infected with Trichinella spiralis. - O.Parasit., SAMLOFF, I. M. - BARNETT, E.V.; Heterogenecity and sequence of appearance of rabbit antibodies to hog intrinsic factor Immunol., 9_ , 67. SANDBERG, A. L. - STOLLAR, B. D,: A 19S anamnestic response to DNA-methylated bovine serum albumin complexes, - Immunology, 11^, SCHONBERG, M. D. - STAVITSKY, A.B. - MOORE, R.D. - FREEMAN, M, 3.: Cellular sites of synthesis of rabbit immunoglobulins during primary response to diphtheria toxoid-freund's adjuvant Exp.Med., SHULMAN, S. - HUBLER, L. - WITEBSKY, E.: Antibody response to immunization by different routes. - Science, SILVERMAN, P. H.: A technique for studying the in vitro effect of serum on activated taeniid hexacanth embryos. - Nature, SILVERMAN, P. H.: Specific and non-specific in vitro serum reactions to active taeniid hexacanth embryos. - Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., SIMA, I. : A Taenia és Cysticercus pisiformis elleni immunitás. - Áo. Lapok,

22 73. SINCLAIR, I. 3.: The relationship between circulating antibodies and immunity to helminthic infections. - Adv. Parasit., STANWORTH, D. R, - PARDOE, D. I. : Structural and biological characteristics of the immunoglobulins. In; Handbook of Experimental Immunology /Ed. D.M. Weir/, Blackwell Sei. Publ., Oxford/Edinburgh, STELOS, P.: Comparative study of rabbit hemolysins to various antigens. I. Hemolysins to beef red cells Inf. Dis., STELOS, P.; Salt fractionation. In: Handbook of Experimental Immunology /Ed. D^M. Weir/, Blackwell Sei. Publ., Oxford/Edinburgh, SUL'C, R. Sz. - ISZMAGILOVA, R. G.: Izucsenyije immunologicseszkih reakcij na ekszperimental'noj modeli krolikciszticerk piziformnüj. In: Parazitü i parazitozü cseloveka i zsivotniih, Kiev. 1965, 78. SVEHAG, S.E. - MANDEL, B # : The production and properties of poliovirus neutralizing antibody of rabbit origin. - Virology, 18_ SVEHAG, S.E. - MANDEL, B.: The formation and properties of poliovirus neutralizing antibody. I. 19S and 7S antibody formation: Differences in kinetics and antigen dose requirement for induction. - 3.Exp.Med., SVEHAG, S.E. - MANDEL, B.: The formation and properties of poliovirus neutralizing antibody.ii. 19S and 7S antibody formation: Differences in antigen dose requirement for sustained synthesis,anamnesis and sensitivity to X-irradiation Exp. Med., SVEHAG, S. E,: The formation and properties of poliovirus neutralizing antibody: I I I. Sequencial changes in e- lectrophoretic mobility of 19S and 7S antibodies synthesized by rabbits after a single virus infection Exp. Med., TADA, T. - ISHIZAKA, K.: Arthus type inflammation with rabbit gamma-m antibody Immunol., 96_. 112, 1966,

23 83. TALIAFERRO, W.H. - i nu'imijfc, D.W.: Absence of amino acid incorporation into antibody during the induction period Inf. Dis., TRAWINSKI, A,: Über Anwendung der Präcipitinreaktion zum Nachweis der Schweinzysticerkose. - Zbl. Bakt., UHR, 3.W. - FINKELSTEIN, M.S.: Antibody formation. IV. Formation of rapidly and slowly sedimenting antibodies and immunological memory to bacteriophage 0X Exp. Med., WEI, M.M. - STAVITSKY, A.B.: Molecular forms of rabbit antibody synthesized during the primary response to human albumin. - Immunology, 12, WEIDANZ, W.P. - 3ACKS0N, A.L. - LANDY, M.: Some aspects of the antibody response of rabbits to immunization with enterobacterial somatic antigens. - Proc.Soc. Exp. Biol. Med., WILLIAMS, 3. C: Ancylostome caninum: Analysis of antigens of the canine hookworm. - Exp.Parasit., WILLIAMS, 3.F. - SOULSBY, E.3.L.: Antigenic analysis of developmental stages of Ascaris suum. I. Comparison of eggs, larvae and adults. - Exp. Parasit., WRIGHT, G.G. - OLIVER-GONZALEZ, 3.: Electrophoretic studies on antibodies to Trichinella spiralis in the rabbit Inf. Dis., ZVAIFLER, N SADUN, E. H. - BECKER, E.L. - SCHOENBECH- LER, M.3.: Demonstration of a homologous anaphylactic antibody in rabbits infected with Schistosoma mansoni. - Exp. Parasit., Érkezett: I I. 10. Dr. NÉMETH István MTA Állategészségügyi Kutató Intézete Budapest, XIV. Hungária krt.2l.