!HU0000076T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 6 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 79689 (22) A bejelentés napja: 0. 09. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0079689 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1794306 A2 06. 03. 30. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1794306 B1 09. 12. 16. (1) Int. Cl.: C12N /82 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06032469 PCT/EP 0/0168 (30) Elsõbbségi adatok: 04077624 04. 09. 24. EP 628826 P 04. 11. 17. US (72) Feltalálók: DE BLOCK, Marc, B-98 Merelbeke (BE); METZLAFF, Michael, B-3080 Tervuren (BE); GOSSELE, Véronique, B-9000 Gent (BE) (73) Jogosult: Bayer BioScience N. V., 902 Gent (BE) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Stresszrezisztens növények HU 007 6 T2 A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 007 6 T2 2 A találmány tárgyát képezik eljárások növények és növényi sejtek stresszrezisztenciájának növelésére, amelyek során növényekben a NAD-mentõszintézis-útvonalban és/vagy a de novo NAD-szintézis útvonalban részt vevõ enzimeket expresszáltatunk. Gabonák esetében a kedvezõtlen növekedési feltételekkel, ezen belül a vízhiánnyal, erõs fénnyel, magas hõmérséklettel, tápanyagkorlátokkal, sós növekedési körülményekkel és hasonlókkal szembeni tûrõképesség igen kívánatos tulajdonság, tekintettel arra, hogy soha véget nem érõ az erõfeszítés az ilyen növények tényleges hozamának további növelésére. Sokféle módot leírtak annak a célnak az elérésére, amivel javíthatjuk azt a tulajdonságot, amit stresszrezisztenciának vagy stressztûrõ képességnek neveznek. Mivel a különféle abiotikus stresszkörülmények eredményeként gyakran keletkeznek káros reaktív oxigénszármazékok ( reactive oxigen species ROS ), így például szuperoxidok vagy hidrogén-peroxidok, a növények stresszrezisztenciájának javítására tett korai próbálkozások a ROS-képzõdés megelõzésére vagy a ROS¹ok eltávolítására helyezték a hangsúlyt. Ilyen megközelítés például a ROS-befogó enzimek, így például katalázok, peroxidázok, szuperoxid-diszmutázok stb. túlexpresszáltatása, vagy akár a ROS-befogó molekulák, így például aszkorbinsav, glutation stb. mennyiségének növelése. E megközelítésekrõl és stressztûrõ növények konstruálását célzó más próbálkozásokról összefoglaló található például Wang és munkatársai [Planta 218, 1 14 (03)] cikkében. Növényi sejtekben és növényekben úgy is kialakítható stressztûrés, hogy csökkentjük az endogén poli- ADP-ribóz polimerázok (ParP) vagy poli-(adp-ribóz) glikohidrolázok (ParG) aktivitását vagy koncentrációját, ahogy azt a WO00/04173 és a WO04/090140 számú iratok ismertetik. Feltételezik, hogy ilyen módon a stresszel terhelt növényi sejtekben elkerülhetõ vagy kellõképpen késleltethetõ a NAD és az ATP traumatikus sejthalálhoz vezetõ kiürülése ahhoz, hogy a stressz alatt álló sejtek túléljenek és akklimatizálódjanak a stresszkörülményekhez. Uchimiya és munkatársai (02) az YK1 megjelölésû rizsgén izolálását ismertetik, valamint kiméra YK1 gén alkalmazását ilyen gént hordozó transzgén rizsnövények tûrõképességének növelésére rizskárokkal és sokféle abiotikus stresszel, így például NaCl-dal, UV¹C-vel, víz alá kerüléssel és hidrogén-peroxiddal szemben. [Uchimiya és munkatársai, Molecular Breeding 9, 31 (02)]. Uchimiya és munkatársai emellett egy poszterabsztraktot is közzétettek, amely szerint a NAD-függõ reduktáz génje (YK1) a NAD-szintetáz aktivitásának fokozó szabályozása révén rizssejtekben a NAD(P)(H) szintjét is növelte, és arra a következtetésre jutottak, hogy ez a módosítás a ROS-stresszel szembeni rezisztenciához szükséges redoxanyagokat generált [Uchimiya és munkatársai, Keystone symposium on plant biology: Functions and control of cell death ( Növénybiológiai Keystone-szimpózium: A sejthalál funkciói és szabályozása ), Snowbird Utah, 03. április.]. 30 3 40 4 0 60 Az élesztõbõl származó NAD-szintetáz jól jellemzett enzim, amely a de novo NAD-szintézis útvonalban és a NAD-mentõszintézis-útvonalban is az utolsó enzim (lásd 1. ábra). A de novo útvonalon a NAD-szintézis prekurzora a kinolát, amely a tripofán bomlástermékeként keletkezik. A mentõútvonalon a nikotinamid (amely a NAD bomlásterméke, és különféle enzimek, így például a PARP, a NAD-függõ deacetilázok és más NAD-glikohidrolázok aktivitása révén keletkezik) a prekurzormolekula. Elsõ lépésben a nikotinamidot a nikozinamidáz nikotinsavvá dezaminálja. A nikotinsavat a nikotinát-foszforobozil-transzferáz ¹foszforibozil-1-pirofoszfátra viszi át, aminek eredményeként nikotinsavmononukleotid keletkezik. Ezen a vegyületen a de novo útvonalon és a mentõútvonal is osztozik. A vegyület NAD+-pirofoszforiláz és NAD-szintetáz általi további átalakítása ezért ugyanúgy történik, mint a de novo útvonalon. Élesztõben a (nikotinamidázt kódoló) PNC1 túlexpresszióját összefüggésbe hozták az élettartam kalóriakorlátozás és kis intenzitású stressz általi meghosszabbításával [Anderson és munkatársai, Nature 423, 181 18. oldal (03); Gallo és munkatársai, Molecular and Cellular Biology 24, 1301 1312 (04)]. Keveset tudunk az egyes NAD bioszintézis útvonalaknak megfelelõ enzimekrõl növényekben. Hunt és munkatársai [New Phytologist 163(1), 3144 (04)] Arabidopsis-ból rendelkezésre álló genominformációk enzimek növényi homológjainak azonosítására történõ alkalmazását ismertetik. A beazonosított DNS-szekvenciák hozzáférési számai a következõk: nikotinamidáz: Atg232, Atg23230 és At3g16190; nikotinátfoszforibozil-transzferáz: At4g36940 és At2g234; nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz: Atg8, NAD-szintetáz: At1g090. Még mindig szükség van alternatív eljárásokra a növények stressztûrõ képességének növelésére és az igénypontokat is ideértve a találmány továbbiakban ismertetett megvalósítási módjai ilyen eljárásokat és eszközöket ismertetnek. A találmány összefoglalása A találmány egyik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezi eljárás fokozott stresszrezisztenciájú növények elõállítására, amelynek során egy növény sejtjeibe bejuttatunk egy kiméragént, amely kiméragén az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNSfragmenseket tartalmazza: i. növényekben expresszáltatható promoter; ii. a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzimét kódoló, élesztõbõl vagy gombákból származó DNSrégió, amely enzim az alábbiak közül kerül kiválasztásra: nikotinaminidáz, nikotinát-foszforiboziltranszferáz, nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotidszintetáz; iii. a transzkripció terminálásában és a poliadenilezésben részt vevõ 3 ¹végi régió, majd transzgenikus növénypopuláció elõállítása céljából regeneráljuk a 2
1 HU 007 6 T2 2 transzgenikus sejteket; és kiválasztunk a transzgenikus növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat vagy kiválasztunk egy olyan növényt, amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva alacsonyabb a reaktív oxigénszármazékok szintje vagy magas marad a NADH-szint stresszkörülmények között. Az DNS-régió olyan enzimet kódolhat, amely SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.: szerinti aminosavszekvenciának megfelelõ aminosavszekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezik a leírásban ismertetett kiméragének, az ilyen kiméragéneket tartalmazó növényi sejtek, és lényegében ilyen kiméragéneket tartalmazó növényi sejtekbõl álló növények, valamint ilyen növények magjai. Az ilyen növények és növényi sejtek azzal jellemezhetõk, hogy stresszkörülmények között alacsonyabb bennük a reaktív oxigénszármazékok szintje, mint a kiméragént nem tartalmazó hasonló növényben. A találmány egy másik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezi az ismertetett kiméragének alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére vagy stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére. A találmány tárgyát képezi továbbá a nikotinamidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz így például a SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 és SEQ ID No.: szerinti aminosavszekvenciák közül választott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló DNSszekvenciák közül kiválasztott, a nikotinamid-adenindinukleotid mentõszintézis-útvonal növényben mûködõképes enzimét kódoló DNS-szekvencia alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére vagy stresszkörülmények között lévõ növényekben vagy növényi sejtekben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére vagy a NADH szintjének fenntartására. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a sütõélesztõbõl (Saccharomyces cerevisiae) ismert NAD-mentõútvonal és de novo NAD-szintézis útvonal vázlatos bemutatása. A 2 11. ábrák a NAD-mentõútvonalból vagy a de novo NAD-szintézis útvonalból származó különféle enzimeket kódoló DNS-régiókat tartalmazó, és növényekben expresszáltatható szabályozóelemek szabályozása alatt álló T¹DNS vektorok vázlatos bemutatásai. Az alkalmazott rövidítések a következõk: RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia; 3 3S: transzkripcióterminációs és poliadenilezési a CaMV 3S átiratából; Cab22L: a Cab22L átirat nem transzlálódó vezetõszekvenciája; P3S2: CaMV 3S 30 3 40 4 0 60 promoter; 3 g7: transzkripcióterminációs és poliadenilezési Agrobacterium tumefaciens 7. T¹DNS génjébõl; vonalkód, foszfinotricin-acetil-transzferázt kódoló régió; az Arabidopsis Rubisco-kisalegység átiratának pssuara promotere; LB: bal oldali t¹dns határolószekvencia; Sm/Sp: szpektinomicin- és sztreptomicinrezisztencia-gén; pvs1ori: Agrobacterium-ban replikációra alkalmazható VS1, ColE1: replikációs ; NLS: nukleáris lokalizációs ; PNC1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-régió; npt1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz; nma1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferáz; nma2: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz; qns1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1). A találmány részletes ismertetése A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az élesztõbõl származó NAD-mentõútvonal növényekben funkcióképes enzimeit kódoló DNS-szekvenciák felhasználhatók olyan transzgenikus növények elõállítására, amelyek stresszre, különösen abiotikus stresszre rezisztensebbek, mint az ilyen DNS-szekvenciákat nem tartalmazó növények. A kontrollnövényekkel összehasonlítva a transzgenikus növényekben emellett szignifikánsan csökkent a reaktív oxigénfajták ( ROS ¹ok) szintje és magas maradt a NADH szintje, amikor stresszkörülmények közé helyezték õket. A találmány egyik megvalósítási módjában tehát a találmány tárgyát képezi eljárás fokozott stresszrezisztenciájú növény elõállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a leírásban ismertetett egyik stresszrezisztens kiméragént egy növény sejtjeibe juttatjuk, hogy ezáltal a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó sejteket állítsunk elõ; regeneráljuk a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó sejteket, hogy ezáltal a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó növénypopulációt állítsunk elõ; kiválasztunk a növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat és/vagy amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva alacsonyabb a ROS¹ok szintje stresszkörülmények között és/vagy magas marad a NADH-szint. A stresszrezisztens kiméragén ezáltal tartalmaz egy növényekben expresszáltatható promotert, amelyhez mûködõképesen hozzá van kapcsolva a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzimét kódoló DNS-régió, amely enzim az alábbiak közül kerül kiválasztásra: nikotin-aminidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, niko- 3
1 HU 007 6 T2 2 tinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz, valamint egy transzkripcióterminálásban és poliadenilezésben részt vevõ 3 ¹vég. A leírás szerinti értelemben a nikotinamid-adenindinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzime olyan enzim, amely, ha mûködõképesen megfelelõ szabályozóelemekhez, például növényekben expresszáltatható promoterhez és termináló régióhoz van kapcsolva, akkor növényekbe juttatva átírható és transzlálható, amelynek eredményeként a NAD-mentõszintézis-útvonal egy növényekben funkcióképes enzimét kapjuk. A találmány tárgyát képezik a NAD-mentõszintézisbõl származó enzimek (és az õket kódoló gének), amelyeket növényi forrásból nyerünk, de a találmány tárgyát képezik az élesztõbõl (Saccharomyces cerevisiae), más élesztõfélékbõl vagy gombákból nyert enzimek is. Ez utóbbi fehérjék feltehetõleg még jobban alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokhoz, mivel kevésbé valószínû, hogy olyan enzimatikus visszacsatolásos szabályozás stb. alatt állnak, amely alatt hasonló növényi eredetû enzimek állhatnak. A NAD-mentõszintézisben részt vevõ enzimek között vannak az alábbiak: nikotinamidáz (EC 3..1.19), amely a nikotinamid amidcsoportjának hidrolízisét katalizálja, ami által nikotinát és NH 3 keletkezik. Az enzim nikotinamid-dezamináz, nikotinamid-amidáz, YNDáz vagy nikotinamid-amidohidroláz néven is ismert, nikotinát-foszforibozil-transzferáz (EC 2.4.2.11), más néven niacin-ribonukleotidáz, nikotinsavmononukleotid-glikohidroláz; nikotinsav-mononukleotid-pirofoszforiláz; nikotinsav-foszforibozil-transzferáz, amely az alábbi reakciót katalizálja: nikotinát-d-ribonukleotid+difoszfát= nikotinát++foszfo- -D-ribóz-1-difoszfát nikotinát-nukleotid-adenil-transzferáz (EC 2.7.7.18), más néven dezamido-nad+-pirofoszforiláz; nikotinát-mononukleotid-adenil-transzferáz; dezaminonikotinamid-adenin-dinukleotid-pirofoszforiláz; NaMT-ATáz; nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz, amely az alábbi reakciót katalizálja: ATP+nikotinát-ribonukleotid= difoszfát+dezamido-nad + NAD-szintáz (EC 6.3.1.), más néven NAD-szintetáz; NAD+-szintáz; nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz; difoszfopiridin-nukleotid-szintetáz, amely az alábbi reakciót katalizálja Dezamido-NAD + +ATP+NH 3 =AMP+difoszfát+NAD + A találmány egyik megvalósítási módjában a NADmentõútvonal különféle enzimeit kódoló régiók olyan nukleotidszekvenciát tartalmaznak, amely SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.: szerinti aminosavszekvenciájú fehérjéket kódolnak, így például ID No.:1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.:, SEQ ID No.:7 vagy SEQ ID No.:9 szerinti nukleotidszekvenciát. 30 3 40 4 0 60 Nyilvánvaló azonban, hogy e nukleotidszekvenciák változatai, ezen belül inszerciókat, deléciókat és szubsztitúciókat tartalmazó változatai is alkalmazhatók ugyanerre a célra. Ugyanígy alkalmazhatók az említett nukleotidszekvenciák Saccharomyces cerevisiae-tõl eltérõ fajokból származó homológjai is. Az ismertetett nukleotidszekvenciák változatai szekvenciaazonosságot mutatnak, amely elõnyösen legalább körülbelül 80%¹os, vagy 90%¹os vagy 9%¹os azokkal az azonosított nukleotidszekvenciákkal, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódolnak, így például a szekvencialistában azonosítottakkal. A változatok elõnyösen a NAD-mentõútvonalból származó enzimekkel azonos aktivitású, funkcióképes fehérjéket kódolnak. A leírás szerinti értelemben két rokon nukleotid- vagy aminosavszekvencia százalékban kifejezett szekvenciaazonossága azoknak a pozícióknak a számát jelenti két optimálisan illesztett szekvenciában, amelyekben azonos nukleotid vagy aminosav van ( 0), osztva az összehasonlított pozíciók számával. A réseket, azaz az illesztés olyan pozícióit, ahol az egyik szekvenciában jelen van egy aminosav vagy nukleotid, a másikban viszont nincs, nem azonos aminosavaknak vagy nukleotidoknak tekintjük. A két szekvencia illesztését Needleman és Wunsch algoritmusa (Needleman és Wunsch, 1970) szerint végeztük. A fenti számítógéppel segített szekvenciaillesztés kényelmesen elvégezhetõ standard szoftverek, például a Wisconsin Package Version.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) részét képezõ GAP programmal, az alapbeállítás szerinti pontszámozó mátrix, 0¹es résképzési büntetõpont ( gap creation penalty ) és 3¹as réstágítási büntetõpont ( gap extension penalty ) alkalmazásával. A NAD-mentõútvonal élesztõbõl származó egyik enzimét vagy egy, az élesztõtõl eltérõ szervezetbõl származó homológ enzimet kódoló nukleotidszekvenciákkal homológ nukleotidszekvenciák a genomadatok in silico elemzésével beazonosíthatók, ahogyan azt Hunt és munkatársai (lásd fent) ismertetik. Homológ nukleotidszekvenciák úgy is azonosíthatók és izolálhatók, hogy sztringens körülmények között hibridizáltatást végzünk próbaként a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódoló, azonosított nukleotidszekvenciákat, így például a szekvencialistában azonosítottakat alkalmazva. A leírás szerinti értelemben a sztringens hibridizációs körülmények azt jelenti, hogy a hibridizáció általában akkor történik meg, ha a próba és a célszekvencia között legalább 9%, elõnyösen legalább 97% a szekvenciaazonosság. A sztringens hibridizációs körülményekre példa a következõ: 0% formamidot, SSC¹t (0 mm NaCl, mm trinátrium-citrát), 0 mm nátrium-foszfátot (ph=7,6), Denhardt-féle oldatot, % dextrán-szulfátot és g/ml denaturált, nyírással kezelt vivõ DNS¹t, így például lazacspermából nyert DNS¹t tartalmazó oldatban éjszakán át történõ inkubálás, majd a hibridizáltató hordozó mosása körülbelül 6 C¹on, 0,1 SSC-ben, elõnyösen kétszer körülbelül percig. Az egyéb hibridizációs és mosási körülmé- 4
1 HU 007 6 T2 2 nyek jól ismertek, példák az alábbi publikációban és különösen annak 11. fejezetében találhatók: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, New York (1989). Ilyen szekvenciaváltozatok DNS-amplifikálással is elõállíthatók, láncindítóként olyan oligonukleotidokat alkalmazva, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódoló génekre specifikusak, így például többek között a SEQ ID No.:1, a SEQ ID No.:3, a SEQ ID No.:, a SEQ ID No.:7, a SEQ ID No.:9, a SEQ ID No.:11, a SEQ ID No.:13, a SEQ ID No.:, a SEQ ID No.:17, a SEQ ID No.:19, a SEQ ID No.:21, a SEQ ID No.:23 szerinti nukleotidszekvenciák vagy komplementereik közül választott, körülbelül 0 egymást követõ nukleotidot tartalmazó oligonukleotidokat alkalmazva. A találmány szerinti eljárások felhasználhatók különféle stresszindukáló körülményeket, különösen abiotikus stresszkörülményeket, ezen belül víz alá kerülést, erõs fényt, erõs UV sugárzási szinteket, megemelkedett hidrogén-peroxid szinteket, vízhiányt, magas vagy alacsony hõmérsékletet vagy megemelkedett sótartalmat tûrõ növények elõállítására. A találmány szerinti eljárások felhasználhatók emellett kedvezõtlen körülmények, különösen abiotikus stresszkörülmények között, ezen belül víz alatt, erõs fényben, erõs UV sugárzási szintek mellett, megemelkedett hidrogén-peroxid-szintek mellett, vízhiány mellett, magas vagy alacsony hõmérsékleten, megemelkedett sótartalom mellett stb. növõ növények sejtjeiben a ROS¹ok szintjének csökkentésére is. A ROS¹ok szintje vagy a NADH-szint technikában ismert eljárások, ezen belül a 3. példában ismertetettek segítségével határozható meg. A leírásban ismertetett eljárások alkalmazásával olyan növények állíthatók elõ, amelyekben a ROS¹ok szintje egyenlõ a stresszel nem terhelt körülmények között így például többek között gyenge fényen lévõ kontrollnövényekével vagy alacsonyabb azokénál. Ezekben a növényekben, stresszel nem terhelt körülmények között a ROS¹ok szintje a gyenge fényen lévõ kontrollnövények szintjének 0 0%¹a lehet, közelebbrõl körülbelül 60 8%¹a. Ezekben a növényekben a ROS¹ok szintje stresszkörülmények között körülbelül 0 80%¹a a stresszkörülmények között lévõ kontrollnövényekének, ami a stresszel nem terhelt körülmények között lévõ kontrollnövényekben mért ROS-szint körülbelül 60 80%-ának felel meg. A NADH szintje ezekben a növényekben hasonló módon egyenlõ a stresszel nem terhelt körülmények között így például többek között gyenge fényen lévõ kontrollnövényekével, vagy magasabb azokénál. Ezekben a növényekben stresszel nem terhelt körülmények között a NADH szintje a gyenge fényen lévõ kontrollnövények NADHszintjének 0 160%¹a lehet, közelebbrõl körülbelül 1 140%¹a. Ezekben a növényekben a NADH szintje stresszkörülmények között körülbelül 0 300%¹a a stresszkörülmények között lévõ kontrollnövények NADH-szintjének, ami a stresszel nem terhelt körülmények között lévõ kontrollnövényekben mért ROS-szint körülbelül 0 160%-ának felel meg. 30 3 40 4 0 60 A transzgenikus növények elõállítására szolgáló eljárásokat nem tekintjük kritikusnak a találmány szempontjából és bármilyen transzformálási eljárás és adott növényhez megfelelõ regenerálás alkalmazható. Az ilyen eljárások a technikában jól ismertek, és a következõk lehetnek: Agrobacterium-közvetített transzformálás, részecskeágyús bejuttatás, mikroinjekciózás, ép sejtek elektroporézise, polietilénglikolközvetített protoplaszttranszformálás, protoplasztok elektroporézise, liposzómaközvetített transzformálás, szilíciumérintkezõk által közvetített transzformálás stb. Az így elõállított transzformált sejteket ezután érett, termõképes növényekké lehet regenerálni. A kapott transzformált növényeket felhasználhatjuk hagyományos nemesítési sémában, hogy azonos tulajdonságokkal rendelkezõ további transzformált növényeket állítsunk elõ, vagy hogy a találmány szerint a kiméragént azonos faj eltérõ fajtáiba vagy rokon növényfajokba, vagy hibridnövényekbe juttassuk be. A transzformált növények magjai stabilan a genomba inszertálódott formában tartalmazzák a találmány szerinti kiméragént, és ugyancsak a találmány tárgyát képezik. Nyilvánvaló, hogy a leírásban ismertetett különféle stresszrezisztens kiméragének, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó különféle enzimeket kódoló DNS-régiókat tartalmaznak, össze is kombinálhatók egy növényben vagy növényi sejtben, hogy ezáltal még tovább növeljük a kiméragéneket tartalmazó növények stressztûrõ képességét. A találmány egyik megvalósítási módjában tehát a találmány tárgyát képezik olyan növényi sejtek és növények, amelyek legalább két, eltérõ kódolórégiókat tartalmazó, stresszrezisztens kiméragént tartalmaznak. A találmány szerinti transzgenikus növényi sejtek és növényvonalak tartalmazhatnak emellett olyan kiméragéneket is, amelyek csökkentik a WO00/04173 és a WO04/090140 számú iratokban ismertetett az endogén PARP és/vagy PARG gén expresszióját. E további kiméragének bejuttathatók például úgy, hogy a találmány szerinti transzgenikus növényvonalakat a PARP és/vagy PARG gén expresszióját csökkentõ kiméragént tartalmazó transzgenikus növényekkel keresztezzük. Transzgenikus növények vagy növényvonalak úgy is elõállíthatók, hogy a találmány szerinti kiméragéneket olyan transzgenikus növényi sejtekbe juttatjuk be vagy transzformáljuk, amelyek tartalmazzák a PARP és/vagy a PARG gén expresszióját csökkentõ kiméragéneket, és vice versa. A leírás szerinti értelemben a promoter növényben expresszálható promotert jelent. A leírás szerinti értelemben a növényben expresszálható promoter olyan DNS¹t jelent, amely képes egy növényi sejtben a transzkripciót irányítani (elindítani). Ide tartozik minden olyan növényi eredetû promoter, de minden olyan nem növényi eredetû promoter is, amely képes növényi sejtekben a transzkripciót irányítani, azaz egyes vírusos vagy bakteriális eredetû promoterek, így például a CaMV3S [Harpster és munkatársai, Mol. Gen. Genet. 212, 182 190 (1988)], a föld alatti lóherevírus ( subterranean clover virus ) 4. vagy 7. számú promotere
1 HU 007 6 T2 2 (WO9606932), vagy a T¹DNS gén promoterek, de emellett a szövetspecifikus vagy szervspecifikus promoterek is, ezen belül többek között a magspecifikus promoterek (például WO89/03887), a szervkezdeményekre specifikus promoterek [An és munkatársai, The Plant Cell 8, 30 (1996)], szárspecifikus promoterek (Keller és munkatársai, EMBO J. 7, 36 3633 (1988)], levélspecifikus promoterek [Hudspeth és munkatársai, Plant Mol Biol 12, 79 89 (1989)], mezofilspecifikus promoterek (így például a fényindukálható Rubisco-promoterek), gyökérspecifikus promoterek [Keller és munkatársai, Genes Devel. 3, 1639 1646 (1989)], gumóspecifikus promoterek [Keil és munkatársai, EMBO J. 8, 1323 1330 (1989)], edényszövetre specifikus promoterek [Peleman és munkatársai, Gene 84, 39 369 (1989)], porzószálra szelektív promoterek (WO 89/396, WO 92/1396), felhasadási zónára specifikus promoterek (WO 97/1386) és hasonlók. A találmány szerinti kiméragének elláthatók egy növényekben funkcióképes nukleáris lokalizációs lal ( NLS ) például az SV40 NLS-sel is, amely mûködõképesen van hozzákapcsolva a NAD-mentõútvonal egy enzimét kódoló DNS-régióhoz. A leírás elolvasása után technikában jártas szakember számára azonnal nyilvánvalóvá válik, hogy a fokozott stresszrezisztencia vonatkozásában hasonló hatások érhetõk el minden alkalommal, ha a növény olyan természetes változatait állítjuk elõ, amelyekben a NAD-mentõútvonal enzimeit kódoló endogén gének aktívabbak vagy nagyobb mennyiségben expresszálódnak. Az ilyen növényváltozatok úgy állíthatók elõ, hogy egy növénypopulációt mutagenezisnek vetünk alá, így például többek között EMS-mutagenezisnek, majd ezt követõen a NAD-mentõútvonal bármely enzimének vagy ezek bármely kombinációjának fokozott aktivitására szûrjük. Az is azonnal nyilvánvalóvá válik, hogy az eltérõ fajták vagy változatok egy populációja szûrhetõ általánosságban a fent említett stresszkörülményekkel, vagy konkrétan abiotikus stresszekkel szembeni fokozott tûrõképességre, majd a stresszkörülményekkel szembeni fokozott tûrõképesség korreláltatható a NAD-mentõútvonal egyik enzimét kódoló bármely endogén gének egy adott alléljének jelenlétével. Ezt követõen keresztezéssel bejuttathatjuk ezeket az alléleket egy érdeklõdésre számot tartó növénybe, feltéve, hogy a fajok szexuálisan kompatibilisek vagy a leírásban is ismertetett hagyományos módszerekkel (ezen belül hibridizáltatással vagy PCR-amplifikálással is) beazonosíthatók és rekombináns DNS-technológiák alkalmazásával bejuttathatók. A különösen kívánatos allélek nemesítési módszerek alkalmazásával történõ bejuttatása is követhetõ az érdeklõdésre számot tartó allélekre specifikus molekuláris markerek alkalmazásával. A leírásban ismertetett eljárások és eszközök vélhetõleg minden növényi sejtben és növényben alkalmazhatók, kétszikû és egyszikû növényi sejtekben és növényekben egyaránt, ezen belül többek között gyapotban, káposztafélékben, olajrepcében, búzában, kukoricában vagy kukoricában, árpában, napraforgóban, 30 3 40 4 0 60 rizsben, zabban, cukornádban, szójababban, zöldségekben (ezen belül cikóriában, salátában, paradicsomban), dohányban, burgonyában, cukorrépában, papayában, ananászban, mangóban vagy Arabidopsis thaliana-ban, de emellett a kertészeti, virágtermesztési vagy erdészeti növényekben is. A leírás szerinti értelemben a tartalmaz úgy értendõ, hogy az adott jellemzõk, egész számok, lépések vagy komponensek jelen vannak, de nem zárja ki egy vagy több egyéb jellemzõ, egész szám, lépés vagy komponens vagy ezek csoportjainak jelenlétét vagy hozzáadását. A nukleotid- vagy aminosavszekvenciákat tartalmazó nukleinsavak vagy fehérjék tehát tartalmazhatnak például a ténylegesen idézetteknél több nukleotidot vagy aminosavat is, azaz egy nagyobb nukleinsavba vagy fehérjébe lehetnek beágyazva. Valamely funkcionálisan vagy szerkezetileg definiált DNS-régiót tartalmazó kiméragén további DNS-régiókat stb. is tartalmazhat. Az oltalmi kört nem korlátozó alábbi példák növényi sejtek és növények stresszrezisztenciájának növelésre alkalmas kiméragének összeszerelését, valamint a gének alkalmazását ismertetik. Egyirányú jelzés hiányában a példákban az összes rekombináns DNS-módszert standard protokollok szerint végezzük, ahogy azt például az alábbiak ismertetik: Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) és Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Egyesült Államok (1994). A növényi molekuláris munka standard anyagait és eljárásait R. D. D. Croy ismerteti Plant Molecular Biology Labfax (1993) címû munkájában, amely a BIOS Scientific Publications Ltd (Egyesült Királyság) és a Blackwell Scientific Publications (Egyesült Királyság) közös kiadásában jelent meg. A standard molekuláris biológiai módszerekhez további hivatkozások a következõk: Sambrook és Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (01); Brown, Molecular Biology LabFax, 2. kiadás, Academic Press, Egyesült Királyság (1998) I. és II. kötete. A polimeráz-láncreakcióhoz standard anyagok és eljárások a következõ publikációkban találhatók: Dieffenbach és Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (199), és McPherson és munkatársai, PCR Basics: From Background to Bench, 1. kiadás, Springer Verlag, Németország (00). A leírásban és a példákban az alábbi szekvenciákra hivatkozunk: SEQ ID No. 1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidáz (PNC1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 2: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidáz (PNC1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 3: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz (NPT1) nukleotidszekvenciája (komplementer). SEQ ID No. 4: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz (NPT1) aminosavszekvenciája. 6
1 HU 007 6 T2 2 SEQ ID No. : Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 6: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 7: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA2) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 8: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA2) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 9: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. : Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 11: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 12: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 13: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája SEQ ID No. 14: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. : Arabidopsis thaliana-ból (3. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája SEQ ID No. 16: Arabidopsis thaliana-ból (3. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 17: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 18: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 19: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. : Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 21: Arabidopsis thaliana-ból származó nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 22: Arabidopsis thaliana-ból származó nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 23: Arabidopsis thaliana-ból származó NAD-szintetáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 24: Arabidopsis thaliana-ból származó NAD-szintetáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. : a ptve 467 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 26: a ptve 468 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 27: a ptve 469 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 28: a ptve 470 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 29: a ptve 496 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. 30 3 40 4 0 60 SEQ ID No. 30: a ptve 497 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 31: a ptve 00 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 32: a ptve 01 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 33: a ptve 02 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 34: a ptve 03 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. Példák 1. példa: Stresszrezisztens kiméragének összeszerelése és növényi sejtekbe juttatása, ptve467 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-fragmens (SEQ ID No.: 1); fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve467¹et (SEQ ID No.:). A ptve467 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 2. ábrán mutatjuk be. A ptve467 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1181 34,(C) PNC1-kódolórégió 1191,(C) cab22 vezetõszekvencia 1781 11,(C) P3S2 promoter 2293 82,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 2866 23,(C) vonalkód -régió 492 2867,(C) PSSuAra promoter 4760 4784 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 7
1 HU 007 6 T2 2 Táblázat (folytatás) 632 32,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 687 64 pvs1 replikációs 646 11709 ColE1 replikációs ptve468 Összeállítottunk egy, a ptve467-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a nikotinamidázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs lal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; körülbelül nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs t (NLS) tartalmazó peptidet kódol; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-fragmens (SEQ ID No.:1); amelyben az NLS- fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve468¹at (SEQ ID No.:26). A ptve468 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 3. ábrán mutatjuk be. A ptve468 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1169 34,(C) PNC1-kódolórégió 1187 1167,(C) nukleáris lokalizációs 1268 19,(C) cab22 vezetõszekvencia 1799 1269,(C) P3S2 promoter 2311,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 2884 2333,(C) vonalkód -régió 30 3 40 4 0 60 46 288,(C) PSSuAra promoter 4778 4802 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 6370 370,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 6893 663 pvs1 replikációs 664 11727 ColE1 replikációs ptve469 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NPT1; SEQ ID No.:3); fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve469¹et (SEQ ID No.:27). A ptve469 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 4. ábrán mutatjuk be. A ptve469 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 176 34,(C) NPT1-kódolórégió 1832 1773,(C) cab22 vezetõszekvencia 2363 1833,(C) P3S2 promoter 287 2664,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3448 2897,(C) vonalkód -régió 17 3449,(C) PSSuAra promoter 342 366 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 6934 934,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 8
1 HU 007 6 T2 2 747 11227 pvs1 replikációs 11228 12291 ColE1 replikációs ptve470 Összeállítottunk egy, a ptve469-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs lal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; körülbelül nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs t (NLS) tartalmazó peptidet kódol; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NPT1; SEQ ID No.:3); amelyben az NLS fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve470¹et (SEQ ID No.:28). A ptve470 jelû T¹DNS vektort vázlatosan az. ábrán mutatjuk be. A ptve470 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Táblázat (folytatás) 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1787 34,(C) NPT1-kódolórégió 177 17,(C) SV40 nukleáris lokalizációs 183 1794,(C) cab22 vezetõszekvencia 2384 184,(C) P3S2 promoter 2896 268,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3469 2918,(C) vonalkód -régió 19 3470,(C) PSSuAra promoter 30 3 40 4 0 60 363 387 Bal oldali T¹DNS határolószekvencia 69 9,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 7478 11248 pvs1 replikációs 11249 12312 ColE1 replikációs ptve496 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA1; SEQ ID No.:); fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve496¹ot (SEQ ID No.:29). A ptve496 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 6. ábrán mutatjuk be. A ptve496 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1739 34,(C) NMA1-kódolórégió 180 1746,(C) cab22 vezetõszekvencia 2336 1806,(C) P3S2 promoter 2848 2637,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3421 2870,(C) vonalkód -régió 147 3422,(C) PSSuAra promoter 3 339 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 6907 907,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 9
1 HU 007 6 T2 2 Táblázat (folytatás) 7430 110 pvs1 replikációs 111 12264 ColE1 replikációs ptve497 Összeállítottunk egy, a ptve496-ban lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs lal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; körülbelül nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs t (NLS) tartalmazó peptidet kódol; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA1; SEQ ID No.:); amelyben az NLS- fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve497¹et (SEQ ID No.:30). A ptve497 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 7. ábrán mutatjuk be. A ptve497 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 177 34,(C) NMA1-kódolórégió 1748 1731,(C) SV40 nukleáris lokalizációs 1823 1764,(C) cab22 vezetõszekvencia 234 1824,(C) P3S2 promoter 2866 26,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3439 2888,(C) vonalkód -régió 30 3 40 4 0 60 16 3440,(C) PSSuAra promoter 333 37 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 69 9,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 7448 11218 pvs1 replikációs 11219 12282 ColE1 replikációs ptve00 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében konvencionális módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA2; SEQ ID No.:7); fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve00¹at (SEQ ID No.:31). A ptve00 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 8. ábrán mutatjuk be. A ptve00 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1721 34,(C) NMA2-kódolórégió 1787 1728,(C) cab22 vezetõszekvencia 2318 1788,(C) P3S2 promoter 2830 2619,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3403 282,(C) vonalkód -régió 129 3404,(C) PSSuAra promoter 297 321 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 6889 889,(C) Sm/Sp rezisztenciagén
1 HU 007 6 T2 2 Táblázat (folytatás) 7412 11182 pvs1 replikációs 11183 12246 ColE1 replikációs ptve01 Összeállítottunk egy, a ptve00-ban lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs lal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; körülbelül nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs t (NLS) tartalmazó peptidet kódol; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA2; SEQ ID No.:7); amelyben az NLS- fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve02¹t (SEQ ID No.:32). A ptve01 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 9. ábrán mutatjuk be. A ptve01 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 1739 34,(C) NMA2-kódolórégió 1733 1713,(C) SV40 nukleáris lokalizációs 180 1746,(C) cab22 vezetõszekvencia 2336 1806,(C) P3S2 promoter 2848 2637,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 3421 2870,(C) vonalkód -régió 30 3 40 4 0 60 16 3440,(C) PSSuAra promoter 3 339 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 6907 907,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 7430 110 pvs1 replikációs 111 12264 ColE1 replikációs ptve02 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében konvencionális módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NADszintázt kódoló DNS-fragmens (QNS1; SEQ ID No.:9); fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve02¹t (SEQ ID No.:33). A ptve02 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a. ábrán mutatjuk be. A ptve02 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 2678 34,(C) QNS1-kódolórégió 2744 268,(C) cab22 vezetõszekvencia 327 274,(C) P3S2 promoter 3787 376,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 4360 3809,(C) vonalkód -régió 6086 4361,(C) PSSuAra promoter 64 6278 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 7846 6846,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 11
1 HU 007 6 T2 2 8369 12139 pvs1 replikációs 12140 133 ColE1 replikációs ptve03 Összeállítottunk egy, a ptve02-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs lal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNSfragmenseket tartalmazza: promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 3S); körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; körülbelül nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs t (NLS) tartalmazó peptidet kódol; Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NADszintázt kódoló DNS-fragmens (QNS1; SEQ ID No.:9); amelyben az NLS- fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; fragmens a CaMV 3S átiratának nem transzlálódó 3 ¹végébõl (3 3S). A ptve03 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Táblázat (folytatás) 198 222 RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia 21 300,(C) 3 3S: transzkripcióterminációs 2699 34,(C) QNS1-kódolórégió 2690 2670,(C) SV40 nukleáris lokalizációs 276 2706,(C) cab22 vezetõszekvencia 3296 2766,(C) P3S2 promoter 3808 397,(C) 3 g7 transzkripcióterminációs 4381 3830,(C) vonalkód -régió 67 4382,(C) PSSuAra promoter 627 6299 bal oldali T¹DNS határolószekvencia 7867 6867,(C) Sm/Sp rezisztenciagén 30 3 40 4 0 60 8390 126 pvs1 replikációs 12161 13224 ColE1 replikációs A T¹DNS vektorokat hagyományos eljárások alkalmazásával segítõ Ti¹plazmidot tartalmazó Agrobacterium-törzsekbe juttattuk be. A kiméragéneket a technikában ismert Agrobacterium-közvetített transzformációval Arabidopsis-növényekbe juttattuk be. Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a ptve03¹at (SEQ ID No.:34). A ptve03 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 11. ábrán mutatjuk be. 2. példa. Az 1. példában ismertetett kiméragéneket tartalmazó transzgenikus Arabidopsis-vonalak elemzése A NAD-mentõútvonal élesztõbõl származó génjét expresszáló, az 1. példában ismertetettek szerint elõállított transzgenikus Arabidopsis-vonalak (T1 generáció) magjait mg/l foszfinotricint (PPT) tartalmazó táptalajon csíráztattuk és neveltük. Kontrollként Arabidopsis thaliana cv Col-0¹t alkalmaztunk. Minden növényt erõs fénystressznek tettünk ki. 30 Einstein m 2 s 1 fényen két hétig nevelt növényeket 6 órára 0 Einstein m 2 s 1 fényre (erõs fény) tettünk, majd 8 órára sötétbe és azután újra 8 órára erõs fényre. A kezelést követõen minden vonalban meghatároztuk a NADH-tartalmat és szuperoxidgyök-tartalmat, és összehasonlítottuk a gyenge fényen nevelt transzgenikus és kontrollvonalakban mért értékekkel. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. A transzgenikus növények erõs fény mellett nagyobb NADH-tartalmat mutattak, mint a kontrollnövények és kevesebb reaktív oxigénszármazékot termeltek erõs fény mellett, mint a kontrollnövények. Nem figyeltünk meg különbséget a konstrukciók között aszerint, hogy a NAD-mentõútvonal kódolt enzime el volt látva nukleáris lokalizációs lal vagy sem. A transzgenikus növényvonalak fenotípusát is pontoztuk az erõs fénystresszel szembeni tûrõképesség szerint. E célra a növényeket két hétig in vitro gyenge fényen (30 Einstein m 2 s 1 ) neveltük, majd 3 napra erõs fényre (0 Einstein m 2 s 1 ; 16 óra világos, 8 óra sötét) tettük õket. Az erõs fénnyel történõ kezelést követõen a növényeket visszatettük gyenge fényre, és a fenotípus pontozása elõtt további három napig neveltük. A kontrollnövények kicsik voltak és virágozni kezdtek (stresszindukált virágzás), az 1. példában ismertetett kiméragéneket tartalmazó transzgenikus vonalakhoz tartozó növények nagyobbak voltak, mint a kontrollnövények és csak felmagozni kezdtek. 12
1 HU 007 6 T2 2 1. táblázat Az 1. példában ismertetett kiméra élesztõgéneket túlexpresszáló transzgenikus Arabidopsis-vonalak erõs fénnyel szembeni tûrõképessége Kiméragének Szegregáció a PPT-tûrõképességre A NADH %¹os mennyisége a gyenge fényen tartott kontrollal összehasonlítva A szuperoxidok %¹os mennyisége a gyenge fényen tartott kontrollal összehasonlítva gyenge fény erõs fény gyenge fény erõs fény Kontroll 0 68 0 14 1. PNC1 (NLS) vonal 3:1 8 128 80 73 2. PNC1 (NLS) vonal 3:1 139 128 82 76 1. NPT1-vonal 6:1 128 147 66 70 2. NPT1-vonal 6:1 122 13 82 76 NPT1 (NLS) 12:1 6 0 61 80 Négyzetes középhiba <% 3. példa: Protokollok a NDH-tartalom- és szuperoxidtartalom-mérésekhez Intracelluláris NAD(P)H kvantitatív meghatározása vízben oldható tetrazóliumsó alkalmazásával Hivatkozás Jun Nakamura, Shoji Asakura, Susan D. Hester, Gilbert de Murcia, Keith W. Caldecott and James A. Swenberg: Quantitation of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strand break repair in base excision repair deficient cells in real time. ( Az intracelluláris NAD(P)H kvantitatív meghatározásával valós idõben nyomon követhetõ az egy szálát érintõ DNS-törések javításában bekövetkezõ egyensúlyvesztés báziskivágás-javításra deficiens sejtekben. ) Nucleic Acids Research 31(17), e4 (03). Növényi anyagok A legtöbb növényi anyag alkalmazható: In vitro nevelt, 14 18 napos, NEM virágzó Arabidopsis-hajtások Olajrepce hipokotilexplantátumok Cell Counting Kit¹8 (CCK¹8) sejtszámláló készlet Sopachem n. v./belgium 72A, Avenue du Laarbeeklaan 90 Brussels Belgium Tartalma: mmol/l WST-8¹at (tetrazóliumsó). 0,2 mmol/l 1¹metoxi-PMS¹t és 0 mmol/l NaCl¹ot tartalmazó ml¹es flaskák Reakcióelegy: ml mm kálium-foszfát-puffer, ph=7,4 0, ml CCK¹8 0,1 mm 1¹metoxi--metolfenazinium-metil-szulfát (=1-metoxifenazin-metoszulfát): 1 l/ml 0 mm¹os törzsoldat (molekulatömeg=336,4; 0 mg 2,973 ml vízben) 1 csepp Tween-/ ml 30 3 40 4 0 60 Eljárás Learatjuk a növényi anyagot és mm káliumfoszfát-pufferbe (ph=7,4) tesszük például: 0 olajrepce hipokotilexplantátum 1 gramm Arabidopsis-hajtás (gyökerek nélkül) A puffert a reakcióelegyre cseréljük 1 gramm Arabidopsis-hajtáshoz ml 0 olajrepce hipokotilexplantátumhoz ml Sötétben, körülbelül fél óráig (a reakciót követve) 26 C¹on inkubáljuk 40 nm¹en megmérjük a reakcióelegy abszorbanciáját Szuperoxid-termelés mérése az XTT redukciójának kvantitatív meghatározásával Hiv.: De Block, M., De Brouwer, D., A simple and robust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids. ( Egyszerû és robusztus vizsgálati in vitro eljárás olajrepcevonalak és hibridek termõképességének kvantitatív meghatározásához. ) Plant Physiol. Biochem. 40, 84 82 (02). A. BRASSICA NAPUS Táptalajok és reakciópufferek Vetéshez használt táptalaj (1¹es táptalaj): Félig koncentrált Murashige- és Skoog-féle sók 2% szacharóz ph=,8 0,6%¹os agar (Difco Bacto Agar) 0 mg/l triacillin A2S3 kalluszindukáló táptalaj: MS táptalaj, 0, g/l Mes (ph=,8), 3% szacharóz, 40 mg/l adenin-so 4, 0,% agaróz, 1 mg/l 2,4¹D, 0, mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 0 mg/l triacillin Reakciópuffer: mm kálium-foszfát-puffer, ph=8 1 mm nátrium, 3 ¹{1¹[fenil-amino-karbonil]-3,4-tetrazólium}-bisz(4¹metoxi-6-nitro)=XTT (BioVectra, Kanada) (MW 674.3) 13
1 HU 007 6 T2 2 Az oldat óvatos hevítésével (+37 C) feloldjuk az XTT¹t (felhasználás elõtt szobahõmérsékletre hûtjük). 1 csepp Tween¹ ml pufferhez A magok sterilizálása a magok elõcsíráztatása a csíranövények nevelése A magokat 2 percre 70%¹os etanolba áztatjuk, majd percig 0,1% Tween-¹at tartalmazó nátriumhipoklorit-oldatban sterilizáljuk a felületüket, végül 1 liter steril csapvízzel leöblítjük õket. A magokat legalább egy óráig steril csapvízzel inkubáljuk (hogy kidiffundálhassanak belõlük az olyan komponensek, amelyek gátolhatják a csíráztatást). A magokat 0 ml steril csapvizet (+0 mg/l triacillint) tartalmazó 0 ml¹es Erlenmeyer-lombikokba tesszük. Körülbelül óráig rázatjuk. Körülbelül 1 ml, vetéshez használt táptalajt tartalmazó, Duchefa gyártmányú Vitro Vent edényekbe tesszük azokat a magokat, amelyekbõl kidudorodott a gyököcske ( magot edényenként, nem túl sokat, hogy csökkentsük a szennyezés miatti magveszteséget). A magokat ±24 C¹on és 30 Einstein s 1 m 2 mellett csíráztatjuk, 16 órás naphosszúságot alkalmazva. U. i.: Az elvetendõ magok mennyiségének kiszámításához: hipokotilszegmens/csíranövény A hipokotilexplantátumok elõkultúrázása és stresszindukció Az elvetés után 12 14 nappal a hipokotilokat körülbelül 7 mm¹es szegmensekre vágjuk. A hipokotilexplantátumokat ( hipokotil/optilux Petri-csésze, Falcon S0, Dánia) napig, C¹on, A2S3 táptalajon ( 30 Einstein s 1 m 2 mellett) kultúrázzuk. U. i.: Minden körülményhez 0 hipokotilexplantátumot alkalmazunk. Stresszindukció: A hipokotilexplantátumokat 0, vagy 0 mg/l acetil-szalicilsavat tartalmazó A2S3 táptalajra ültetjük át. A magokat C¹on és 30 Einstein s 1 m 2 mellett 24 óráig inkubáljuk, 16 órás naphosszat alkalmazva. XTT vizsgálati eljárás Egy 0 ml¹es Falcon-csõbe 0 hipokotilexplantátumot teszünk. Mossuk (XTT¹t nem tartalmazó) reakciópufferrel. Hozzáadunk ml, XTT¹t tartalmazó reakciópuffert. (az explantátumokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével átitatni) Sötétben, 26 C¹on inkubáljuk. A reakciót a reakcióközeg abszorbanciájának 470 nm¹nél történõ mérésével követjük. B. ARABIDOPSIS THALIANA Táptalajok és reakciópufferek 30 3 40 4 0 60 A növények táptalaja: Félig koncentrált Murashige- és Skoog-féle sók B-vitaminok 1 % szacharóz ph=,8 0,7%¹os Difco-agar Inkubálóközeg: Félig koncentrált MS¹sók 1% szacharóz 0, g/l MES, ph=,8 1 csepp Tween¹ ml közeghez Reakciópuffer: mm kálium-foszfát-puffer, ph=8 1 mm nátrium,3 -{1¹[fenil-amino-karbonil]-3,4-tetrazólium}-bisz(4¹metoxi-6-nitro)=XTT (BioVectra, Kanada) (MW 674.3) Az oldat óvatos hevítésével (+37 C) feloldjuk az XTT¹t (felhasználás elõtt szobahõmérsékletre hûtjük) 1 csepp Tween¹ ml pufferhez Arabidopsis-növények Arabidopsis-vonalak: vizsgálandó kontrollvonalak (az az anyavonal, amelybõl a vizsgált vonalak származnak) Az Arabidopsis-magok sterilizálása: 2 percig 70%¹os etanol percig fehérítõ (6% aktív klór)+ ml¹enként 1 csepp Tween¹ az oldathoz, mosás steril csapvízzel U. i.: a sterilizálást 2 ml¹es Eppendorf-csövekben végezzük, az Arabidopsis-növények a csõ aljára süllyednek, amivel lehetõvé teszik a folyadék 1 ml¹es automata pipettával történõ eltávolítását A magok elõcsíráztatása: 12 ml steril csapvizet tartalmazó 9 cm¹es Optilux Petri-csészében (Falcon). Gyenge fény egy éjszakától 24 óráig terjedõ ideig Az Arabidopsis-növények nevelése: A magokat 1 ml növényi táptalajt tartalmazó Intergrid szövettenyésztõ lemezeken (Falcon; nr. 30) vetjük el, rácsonként 1 mag sûrûségben. A növényeket 24 C¹on, 30 Einstein s 1 m 2 mellett, 16 óráig fényen, 8 óráig sötétben tartva neveljük körülbelül 18 napig (a felmagzás elõtt). U. i.: A vizsgálati eljárás elvégzéséhez körülményenként és vonalanként 1¹1 g növényi anyagra (gyökér nélküli hajtásra) van szükség. 1 g hajtás 40 60 növénynek felel meg. Stresszindukció Paraquat Learatjuk az Arabidopsis-hajtásokat (gyökerek nélkül) 1 g hajtást 0, vagy M paraquatot tartalmazó inkubálóközegbe teszünk (a hajtásokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével átitatni) Inkubálóközeg: 0 ml Intergrid szövettenyésztõ lemezeken (Falcon; nr. 30) 24 C¹on, sötétben, 24 óráig inkubáljuk, 16 órás naphosszat alkalmazva. 14
1 HU 007 6 T2 2 Erõs fény A lemezek felét erõs fényre tesszük (0 Einstein s 1 m 2 ) és 4 óráig inkubáljuk XTT vizsgálati eljárás Az agarlemezekrõl (erõs fény miatti stressz) vagy a folyékony inkubálóközegbõl (paraquatstressz) learatjuk a hajtásokat (gyökerek nélkül) és (XTT nélküli) reakciópuffert tartalmazó 0 ml¹es Falcon-csövekbe tesszük. A reakciópuffert (ml-enként gramm) XTT¹t tartalmazó reakciópufferre cseréljük. A hajtásokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével átitatni Sötétben, 26 C¹on inkubáljuk A reakciót a reakcióközeg abszorbanciájának 470 nm¹nél történõ mérésével követjük (körülbelül egy óráig). 4. példa: Az élesztõbõl származó nikotinamidáz (Pnc1) génjét túlexpresszáló Arabidopsis thaliana növények fokozott ózontûrõ képessége Az A. thaliana Columbia ökotípusának transzformálásához a ptve467 kiméravektort (1. példa) alkalmaztuk. A primer transzformánsokat Southern DNS-blot és Northern RNS-blot elemzés segítségével vizsgáltuk. Egy olyan transzgenikus vonalat azonosítottunk, amely egyetlen példányban hordozta a Pnc1-transzgén konstrukciót és állandóan magas volt benne a teljes hosszúságú transzgenikus Pnc1-mRNS szintje ( pg/ g teljes RNS). A csírázás után 6 héttel az egykópiás transzgenikus vonal 0 növényegyedét és kontrollként a vad típusú Columbia 0 növényegyedét gõzölõkamrákban ózonnal kezeltük. Két egymást követõ napon a növényeket napi órán át 0, 30 vagy 00 ppb koncentrációjú ózonnal kezeltük. A kezelés után az összes növényt vizuálisan szûrtük a nekrotikus léziók formájában manifesztálódó ózonkárosodásra. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. 00 ppb koncentrációjú ózon alkalmazása esetén minden növény nekrotikus léziókat mutatott, a 2 alacsonyabb ózonkoncentrációnál azonban a transzgenikus növények szignifikánsan kisebb százaléka károsodott. Emellett a transzgenikus vonal és a vad típusú vonal minden növényében meghatároztuk a vitalitási teljesítményindex (PI) alakulását növekvõ ózonkoncentráció mellett. A Pl az alábbi képlet segítségével számolható: PI=(ABS/CS) (TR/CS) (ET/CS). (ABS=az antennapigmentek által elnyelt fotonáram Chi*; CS=keresztmetszet; TR=a reakciócentrum által becsapdázott és redoxienergiává átalakított energia; ET=a reakcióúton késõbbi elektronáram, amely CO 2 -fixációhoz vezet). A transzgenikus vonalban az ózonkoncentráció növekedésével szignifikánsan nõtt a vitalitási teljesítményindex (Pl), míg a növekvõ koncentrációjú ózonnal kezelt vad típusú növényekben konstans marad az index. Ez úgy magyarázható, hogy az ózon okozta károsodás ellenhatásaként a transzgenikus vonalban egy fiziológiás kompenzációs válasz jelentkezett. 30 3 40 4 0 60 2. táblázat Az élesztõbõl származó nikotinamidáz (Pnc1) génjét túlexpresszáló Arabidopsis thaliana növények fokozott ózontûrõ képessége 0 ppb O 3 30 ppb O 3 00 ppb O 3 Vad típusú 4%* 0% 0% Pnc1 % % 0% * nekrotikus léziókat mutató növények százalékos aránya Ezenkívül kontrollnövényeket, kiméra Pnc1-gént tartalmazó homozigóta transzgenikus növénypopulációkat, valamint egy heterozigóta transzgenikus populációt is kezeltünk ózongõzöléssel és a nem kezelt növényekkel összehasonlítva pontszámoztuk a károsodásokat és a különféle fiziológiás válaszokat. A vizsgálat során mértük a nem modulált fluoreszcenciát, a modulált fluoreszcenciát, a klorofilltartalmat és a friss tömeget. A látható károsodások és fiziológiás válaszok alapján minden populációra felállítottunk egy olyan rangsort, amely jelzi az ózonbehatás mértékét. Minél negatívabb az értékelés, annál érzékenyebb a populáció válasza az ózonra. Míg a nem transzgenikus kontrollpopuláció és a heterozigóta transzgenikus populáció összesített pontszáma 13 volt, a két homozigóta transzgenikus populáció pontszáma 6 és 2 volt. Egyértelmû tehát, hogy a homozigóta transzgenikus populáció statisztikailag szignifikánsan jobban teljesített, mint a kontrollnövények. A szekvencialistában található 223¹as kódok: <223> ptve467 <223> ptve468 <223> ptve469 <223> ptve470 <223> ptve496 <223> ptve497 <223> ptve00 <223> ptve01 <223> ptve02 <223> ptve03 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás fokozott stressztûrõ képességû növény elõállítására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) transzgenikus sejtek elõállítása céljából növényi sejtekbe kiméragént juttatunk, amely kiméragén az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: i. növényekben expresszáltatható promoter; ii. a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik enzimét kódoló, élesztõbõl vagy gombákból származó DNS-régió, amely enzim a következõk közül választott: nikotinamidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz;
1 HU 007 6 T2 2 iii. a transzkripció terminálásában és a poliadenilezésben részt vevõ 3 ¹végi régió; b) transzgenikus növénypopuláció elõállítása céljából regeneráljuk a transzgenikus sejteket; és c) kiválasztunk a transzgenikus növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat vagy kiválasztunk egy olyan növényt, amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva, stresszkörülmények között, alacsonyabb a reaktív oxigénszármazékok szintje vagy magas marad a NADH-szint. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a DNS-régió a következõk közül választott aminosavszekvenciát tartalmazó enzimet kódol: SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.: szerinti aminosavszekvencia. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a DNS-régió SEQ ID No.:1, SEQ ID No.:, SEQ ID No.:7, SEQ ID No.:9 vagy SEQ ID No.:3 szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben további lépésként a növényt egy másik növénnyel keresztezzük.. Az 1 3. igénypontok bármelyikében ismertetett kiméragén. 6. Növényi sejt, amely. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 7. Növény, amely. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti növény, amely az alábbiak közül kerül kiválasztásra: gyapot, Brassica növényfajok, olajrepce, búza, gabona vagy kukorica, árpa, napraforgó, rizs, zab, cukornád, szójabab, zöldségek, cikória, saláta, paradicsom, dohány, burgonya, cukorrépa, papaya, ananász, mangó vagy Arabidopsis thaliana. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növény, amely továbbá azzal jellemezhetõ, hogy stresszkörülmények között alacsonyabb benne a reaktív oxigénszármazékok szintje, mint ilyen kiméragént nem tartalmazó, hasonló növényben.. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növény magja, amely az. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 11. Az. igénypont szerinti kiméragén alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére. 12. Az. igénypont szerinti növény alkalmazása stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére, vagy stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a NAD-szint fenntartására. 16
HU 007 6 T2 Int. Cl.: C12N /82 17
HU 007 6 T2 Int. Cl.: C12N /82 18
HU 007 6 T2 Int. Cl.: C12N /82 19
HU 007 6 T2 Int. Cl.: C12N /82