Kálcium transzportfolyamatok vizsgálata vérlemezkékben genetikailag módosított egérmodellek felhasználásával. A "store operated calcium entry" (SOCE) szabályozása és szerepe Doktori tézisek Dr. Varga-Szabó Dávid Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskolája Témavezető: Dr. Enyedi Ágnes, Ph.D. Opponensek: Dr. Várnai Péter, Ph.D. Dr. Zádor Ernő, Ph.D. Bizottsági tagok: Elnök: Prof. Dr. Enyedi Péter, az MTA doktora Tagok: Dr. Horváth Béla, Ph.D. Dr. Jemnitz Katalin, Ph.D. Budapest 2009
Bevezetés Az érsérülés esetén fellépő vérlemezke aktiváció és aggregáció nélkülözhetetlen a vérzés megállításához, másrészt viszont beteg erekben mint például atherosclerosis esetén ugyanez a folyamat a patológiás thrombus képződésben is szerepet játszik. Ezért a vérlemezke aktiváció szigorúan szabályozott folyamat, hogy egyfelől elégséges legyen az érsérülés elzárásához, másrészt viszont ne vezessen nemkívánatos érelzáródáshoz. Az extracelluláris mátrixfehérjék széles skálája főként kollagének és a von Willebrand faktor valamint különböző a vérlemezkékből felszabaduló vagy a felszínükön termelt oldékony agonisták válthatnak ki thrombocyta aktivációt, ezáltal elősegítve azok stabil kitapadását az érfalhoz illetve a növekvő thrombushoz. Ezek az agonisták különböző jelátviteli utakat aktiválnak, melyek legtöbbjének közös végső lépése az intracelluláris kalcium koncentráció ([Ca 2+ ] i ) megemelkedése. A kalcium szinte minden sejtben nélkülözhetetlen másodlagos hírvivő molekula, mely olyan alapvető sejtműködési folyamatokat szabályoz, mint a sejtdifferenciálódás, sejtosztódás vagy a géntranszkripció. A [Ca 2+ ] i megemelkedése
a thrombocyták aktiválódásában is alapvető, hiszen gátlása különböző intra- és extracelluláris kalcium chelátorok segítségével a folyamat sérülését eredményezi. Annak ellenére, hogy a kalcium ilyen fontos szerepet tölt be a vérlemezke-funkcióban, a thrombocyták kalcium homeostasisának szabályozása alig ismert. A sejten belüli kalciumszint emelkedésének két fő forrása van: a sejtben tárolt kalcium felszabadulása és a kalcium beáramlás a sejten kívüli térből. Az intracelluláris kalcium felszabadulása egy viszonylag jól ismert folyamat eredménye. A vérlemezkék sejtfelszíni receptorainak aktiválódása különböző foszfolipáz C (PLC) izoformákat aktivál, melyek a foszfoinozitid-4,5-biszfoszfátot (PIP 2 ) inozitol-1,4,5-trifoszfáttá (IP 3 ) és diacil-glicerollá (DAG) bontják. Az IP 3 aztán felszabadítja a kalciumot az intracelluláris raktárakból, míg a DAG a kalcium beáramlásának szabályozásában vesz részt. Szemben a kalcium felszabadulással, kevésbé jól ismert a kalcium beáramlás folyamata a sejtmembránon keresztül. Nonexcitabilis sejtekben, amilyenek a vérlemezkék is, a kalcium beáramlás fő útja az úgynevezett store-operated calcium entry (SOCE). Ez nem más, mint a raktárakból történő kalcium felszabadulása következtében zajló kalcium beáramlás az
extracelluláris térből. Az intenzív kutatás ellenére a SOCE-ban szerepet játszó molekulák azonosítása és a folyamat vérlemezke funkcióban betöltött jelentőségének meghatározása várat magára. Egészen mostanáig az úgynevezett de novo konformációs kapcsolás modell próbálta leírni a thrombocyta SOCE molekuláris mechanizmusát. Ez az elmélet egy hat transzmembrán doménnel rendelkező fehérjét a kanonikus transient receptor potential channel 1 (TRPC1)-et tekintette a fő SOC csatornának a vérlemezkék felszínén. A csatorna nyitásának hátterében pedig a TRPC1 fehérjének az endoplazmatikus retikulum (ER) 2-es típusú IP 3 -receptorával való de novo kapcsolódását hangsúlyozta, mint központi mechanizmust. Az irodalom ugyanakkor igencsak ellentmondásos ezt az elméletet illetően. Már a TRPC1 fehérje subcelluláris lokalizációjáról is eltérő közlemények léteznek. Ahhoz, hogy TRPC1 a fő SOC csatorna szerepét betölthesse, a fehérjének a sejtmembránban kell expresszálódnia, ugyanakkor több publikáció is arról számol be, hogy TRPC1 főként intracelluláris membránokban található meg. Továbbá a de novo konformációs kapcsolás modell elsősorban olyan in vitro kísérleteken alapul, melyek során egy TRPC1 ellenes antitest a
SOCE csökkenését eredményezte vérlemezkékben, bár ugyanez az antitest mások munkája során még a TRPC1 fehérje felismerésére sem volt képes. Végül léteznek közlemények, melyekben az anti-trpc1 kezelés semmilyen hatással nem volt a vérlemezke SOCE-ra. 2005-ben illetve 2006-ban a stromal interaction molecule 1 (STIM1) és az Orai1 fehérjét azonosították, mint a SOCE folyamatának konzervált komponensei Drosophila S2 sejtekben és T sejtvonalakban. A STIM1 egy I típusú transzmembrán fehérje, melyről kimutatták, hogy az ER membránjában ülő Ca 2+ érzékelő szerepét tölti be. A raktárak kiürülése esetén sejtmembrán közeli pontokba rendeződik, úgy szabályozza a SOCE-t. Az Orai1 fehérjét pedig olyan csatornaként azonosították, mely a SOC csatornák minden tulajdonságával rendelkezik. Célkitűzés Mint korábban említettem, általános hit, hogy a Ca 2+ beáramlás központi szerepet tölt be a vérlemezke aktivációban, bár ennek pontosan körülírt bizonyítéka hiányzik. A de novo konformációs kapcsolás modell és a TRPC1 fehérje vérlemezkékben betöltött szerepének előzőekben részletezett
ellentmondásos volta, valamint a Ca 2+ beáramlás folyamatában újonnan felfedezett molekulák leírása ösztönzött a vérlemezke SOCE részletes vizsgálatára. PhD munkám során célul tűztem ki a STIM1, TRPC1 és Orai1 fehérje thrombocyta Ca 2+ homeostasisban betöltött lehetséges szerepének felderítését. További célom volt ezeknek a fehérjéknek és magának a SOCE folyamatának in vitro vérlemezke funkcióban és in vivo thrombus képződésben betöltött szerepének vizsgálata. Módszerek Fenti célkitűzéseim megvalósításához laborunkban genetikailag módosított knock-out egereket, és ahol szükség volt rá csontvelő kimérákat, készítettünk, majd in vitro és in vivo kísérletekkel vizsgáltam ezen egerek vérlemezke funkcióját. In vitro kísérletek: Áramlási cytometriás és aggregometriás mérésekkel elsőként a vérlemezkék morfológiáját, sejtfelszíni receptormegoszlását, valamint a knock-out thrombocyták alakváltoztatásra,
integrin aktivációra, granulumaik exocytósisára és stabil aggregációra való képességét vizsgáltam. A sejten belüli Ca 2+ raktárak töltöttségének és a Ca 2+ beáramlásának megítélésre intracelluláris Ca 2+ méréseket végeztem. Végül a knock-out thrombocyták magas nyíróerőket generáló áramlási viszonyok közötti thrombusformáló képességét áramlási kamrában tanulmányoztam. In vivo kísérletek: Két különböző artériás trombózis modellt egy a kis mesenteriális artériák kémiai sérülését előidéző és egy az abdominális aortát mechanikusan károsító és egy kollagén/epinephrin indukálta pulmonaris embólia modellt használtam annak megítélésére, hogy a STIM1, TRPC1 illetve Orai1 fehérje hogyan és milyen mértékben befolyásolja thrombusok képződését in vivo. Továbbá a Würzburgi Egyetem Neurológiai Klinikájával közös kollaborációban vizsgáltuk a vérlemezke SOCE ischemiás stroke kialakulására kifejtett hatását egy tranziens arteria cerebria media elzáródás modellen. Eredmények
PhD munkám során kimutattam, hogy 1. bár a STIM1 és Orai1 hiányos egerek súlyosan betegek, a megakaryopoiesis és vérlemezke termelés érintetlen ezekben az egerekben. 2. a STIM1 illetve Orai1 fehérje hiánya a SOCE és a különböző vérlemezke agonisták által kiváltott Ca 2+ válasz drámai csökkenését eredményezi. 3. továbbá a STIM1 fehérje hiánya nem csak a vérlemezke SOCE amplitúdóját csökkenti, hanem a sejten belüli Ca 2+ raktárak töltöttségét is. 4. a Stim1 -/- és Orai1 -/- vérlemezkék PLCγ2 keresztül történő aktivációja szelektíven károsodott, míg a G-fehérje kapcsolt receptor (GPCR) / PLCß jelátviteli út érintetlen maradt. 5. a STIM1 és az Orai1 fehérje hiánya alig befolyásolja a vérlemezkék aggregációs képességét áramlási körülmények hiányában, míg az áramlási viszonyok közötti thrombus képződés súlyosan károsodott. 6. az in vivo stabil thrombus képződés mind STIM1, mind Orai1 hiányos vérlemezkék esetén defektív, ám ez a defektus kifejezettebb STIM1 hiánya esetén. 7. a Stim1 -/- és Orai1 -/- csontvelő kimérák védettek az ischemiás stroke kialakulása ellen egy tranziens arteria cerebri
media elzáródás modellben, anélkül, hogy a vérzési idő komolyan megnyúlt volna ezekben az állatokban. 8. TRPC1 nem játszik szignifikáns szerepet a vérlemezke SOCE-ben. Következtetések A store-operated calcium entry létezése vérlemezkékben több mint egy évtizeden át jól ismert volt, de a háttérben meghúzódó fehérjék és mechanizmusok, valamint a folyamat vérlemezke funkcióban betöltött szerepe kérdéses maradt. Fenti eredmények alapján megállapítható, hogy mind STIM1, mind Orai1 nélkülözhetetlen komponensei a SOCE-nek vérlemezkékben. STIM1 az ER Ca 2+ szenzor szerepét tölti be, és szabályozza Orai1, a sejtmembrán fő SOC csatornájának működését. A minden fontos vérlemezke aktiváló agonista esetében súlyosan csökkent Ca 2+ válasz egyértelműen mutatja, hogy a vérlemzkék aktivációja során észlelt Ca 2+ szintemelkedés fő komponense a SOCE. Míg a folyamat nélkülözhetőnek tűnik a megakaryocyta érés és vérlemezke termelés szempontjából, a SOCE nélkülözhetetlen a PLCγ2 útján történő teljes thrombocyta aktivációhoz. Az ok, amiért funkcionális SOCE
jelenléte elengedhetetlen a PLCγ2 jelátviteli út működéséhez és nem az a vérlemezkék PLCß útján történő aktivációjához, jelenleg nem ismert. A PLCγ2 aktiváció PLCß aktivációhoz képest lassabb kinetikája szerepelhet a lehetséges okok között, ám ennek további vizsgálata szükséges. A PhD munkámban mutatom, hogy a közel teljesen normális in vitro thrombocyta aktiváció ellenére a vérlemezke SOCE különösen fontos az aggregációhoz és thrombus képződéshez áramlási körülmények között, amilyeneket in vivo is találunk. A stabil thrombus képződés súlyosabban károsodott STIM1 hiánya esetén, mint Orai1 hiányában valószínűleg azért, mert a Stim1 -/- vérlemezkékben nem csak a SOCE csökkent, hanem a sejten belüli Ca 2+ raktárak töltöttsége is. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy STIM1 nem csak a Ca 2+ beáramlását irányítja, hanem az intracelluláris Ca 2+ raktárak töltését is méghozzá a SOCE-től függetlenül. Végezetül az ischemiás stroke vizsgálatára végzett kísérleteink arra utalnak, hogy a vérlemezke SOCE egy klinikailag igen fontos betegségben is komoly jelentősséggel bír. A tény pedig, hogy mind a STIM1-, mind pedig az Orai1-hiányos csontvelő kimérák védettek ischemiás cerebrovasculáris történésekkel szemben komoly vérzési kockázat nélkül, arra enged következtetni, hogy ezek a fehérjék illetve a vérlemezke
SOCE folyamata ígéretes terápiás és prevenciós lehetőséget jelenthetnek az ischemiás cardio- és cerebrovasculáris megbetegedésekben. Saját publikációk jegyzéke A disszertációhoz kapcsolódó közlemények: Braun A, Varga-Szabo D (joint first), Kleinschnitz C, Pleines I, Bender M, Austinat M, Bosl M, Stoll G, Nieswandt B. Orai1 (CRACM1) is the platelet SOC channel and essential for pathological thrombus formation. Blood Prepublished online Oct 2, 2008; DOI:10.1182/blood-2008-07-171611 Varga-Szabo D, Braun A, Kleinschnitz C, Bender M, Pleines I, Pham M, Renné T, Stoll G, Nieswandt B. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 2008 Jul 7;205(7):1583-91. Varga-Szabo D, Authi K, Braun A, Bender M, Ambily A, Gudermann T, Dietrich A, Nieswandt B. Store-operated Ca2+ entry in platelets occurs independently of transient receptor
potential (TRP) C1. Pflugers Arch - Eur J Physiol. [Epub ahead of print] DOI:10.1007/s00424-008-0531-4 Grosse J, Braun A, Varga-Szabo D, Beyersdorf N, Schneider B, Zeitlmann L, Hanke P, Schropp P, Mühlstedt S, Zorn C, Huber M, Schmittwolf C, Jagla W, Yu P, Kerkau T, Schulze H, Nehls M, Nieswandt B. An EF hand mutation in Stim1 causes premature platelet activation and bleeding in mice. J Clin Invest. 2007 Nov;117(11):3540-50. Egyéb közlemények: Braun A, Gessner JE, Varga-Szabo D, Syed SN, Konrad S, Stegner D, Vogtle T, Schmidt RE, Nieswandt B. STIM1 is essential for Fc{gamma} receptor activation and autoimmune inflammation. Blood Prepublished online Oct 2, 2008; DOI: 10.1182/blood-2008-05-158477 Pleines I, Elvers M, Strehl A, Pozgajova M, Varga-Szabo D, May F, Chrostek-Grashoff A, Brakebusch C, Nieswandt B. Rac1 is essential for phospholipase C-gamma2 activation in platelets. Pflugers Arch - Eur J Physiol. [Epub ahead of print] DOI: 10.1007/s00424-008-0573-7
Varga-Szabo D, Pleines I, Nieswandt B. Cell Adhesion Mechanisms in Platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Mar;28(3):403-12. Nieswandt B, Moser M, Pleines I, Varga-Szabo D, Monkley S, Critchley D, Fässler R. Loss of talin1 in platelets abrogates integrin activation, platelet aggregation, and thrombus formation in vitro and in vivo. J Exp Med. 2007 Dec 24;204(13):3113-8. Rabie T, Varga-Szabo D, Bender M, Pozgaj R, Lanza F, Saito T, Watson SP, Nieswandt B. Diverging signaling events control the pathway of GPVI down-regulation in vivo. Blood. 2007 Jul 15;110(2):529-35. Epub 2007 Mar 20. Schulte V, Reusch HP, Pozgajová M, Varga-Szabo D, Gachet C, Nieswandt B. Two-phase antithrombotic protection after anti-glycoprotein VI treatment in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 Jul;26(7):1640-7. Molnar BA, Varga-Szabo D, Kaliszky P. Failure of diagnosing pancreatic tumors in the course of laparoscopic
cholecystectomy: surgical lessons. Orv Hetil. 2005 Dec 11;146(50):2541-5. [Hungarian]