Szegedi Tudományegyetem ÁOK Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint Sebészeti Műtéttani Intézet 2017. december 06-december 15. Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015 Function specific modules B 11/2 Állatkísérletek helyettesítése 2: Sejt és szövettenyésztés; Ex vivo vizsgálatok (Langendorff szív). Dr. Csont Tamás és Dr. Csonka Csaba SZTE ÁOK Biokémiai Intézet 2017-2018-I. szemeszter
Meghatározások Ex vivo: Izolált szervperfúzió a testen kívül Perfúzió: A kiválasztott szerv érrendszerén keresztüli folyadék áramoltatás (ú.m. szív, máj, tüdő, vese, bél, nagyerek, stb.) 2
Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 1. izolált béka szív 1866, Elias Cyon, Carl Ludwig készülék: Béka szív: hőmérséklet kontrollált nyúl szérummal perfundált recirculating szivacsszerű állomány koronária erek hiánya egy kamra 3
Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 2. 1880: Sydney Ringer Ringer oldat, Na +, K +, Ca 2+ 1895: Otto Frnak Frank Starling békán 1915: Ernest Starling Frank Starling kutyán 1921 Otto Loewi 2 béka szív, egyik neuro intakt paraszimp lassul, chemical neurotransmission (1936 w Henry Dale) 4
Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 3. Langendorff perfúzió Retrográd perfúzió Oskar Langendorff: Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Archiv für die gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere, Bonn, 1895, 61: 291 332. Állandó nyomás, szívcsúcs 1904 Gottlieb & Magnus ballon (isovolumetric) 1939 Katz és mtsai konstans flow 5
Történelem - ex vivo szívperfúziós modell 4. Neely-féle perfúzió dolgozó perfúzió Neely, J.R.; Liebermeister, H.; Battersby, E.J.; Morgan, H.E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat hearts. Am. J. Physiol. 212: 804-814; 1967. 6
ex vivo szívperfúzió 7
Az ex vivo szívperfúzió előnyei Gyors, olcsó, könnyen kivitelezhető Jól reprodukálható, magas elemszám Szkrínelésre alkalmas Biokémiai, élettani, morfológiai és gyógyszertani vizsgálatok széles spektruma elérhető Szív specifikus kezelések vizsgálatára alkalmas Ellenőrzött környezet Iszkémia/reperfúzió Olyan kísérletek is végezhetők, amelyek in vivo esetben kivitelezhetetlenek lennének a kísérleti állat halála miatt (pl. infarktus indukált pumpafunkció csökkenés, szívmegállás, aritmiák) perifériás metabolikus hatások (NO, NO spin trapping) 8
Az ex vivo szívperfúzió hátrányai Az in vivo modellnél kevésbé fiziológiás A preparátum folyamatos és időarányos funkciócsökkenése (~10%/h, ozmotikus) Csak akut kísérletekre alkalmas (működése kb 3 óráig fenntartható) 9
Az ex vivo szívperfúzió alapkövetelményei Kísérleti állatból szív izolálása (szervdonorság nem engedélyköteles) Perfúziós rendszer Perfúziós folyadék Oxigén (karbogén) és oxigenátor Hőmérséklet kontroll Sebészi műszerek Adatrögzítő rendszer Gyakorlott kutató 10
Az ex vivo szívperfúzióra használt kísérleti állatok Bármely emlős állat lakalmas elsősorban patkány (méret és elterjedség) egér: transzgenikus állatok nyúl, tengerimalac, hörcsög,, guinea pig, hamster, futóegér, görény szintén használt: malac, majom, birka, kutya méret! ember is! 11
Perfúziós oldat Krisztalloid oldat (pl. Krebs-Henseleit oldat, Tyrode s oldat, stb.) Tápanyagok az energiatermeléshez (pl. glükóz, pyruvát, szabad zsírsav, stb.) inzulinnal vagy anélkül Ca2+ a kontrakcióhoz Pufferrendszer a ph 7.4±0.05 értéken tartásához (pl. HCO 3-, PO 3-4 ) Megfelelő extracelluláris ionmiliő (Mg 2+, K +, Na +, Cl - ), 300 mosm oxigén (see later) Néha szükséges az oldat kiegészítése fehérjével vagy egyéb onkotikusan aktív anyaggal Eltarthatóság 2-8 C max 3 nap Vér Antikoagulánsok, forrás, kimosás (mosogatás), oxigenáció 12
A perfúziós oldat jellegzetes összetétele Krebs-Henseleit oldat konc (mm) M (g/mol) NaCl 118.5 mm 58.5 NaHCO 3 25.0 mm 84 KCl 4.7 mm 74.5 MgSO 4 1.2 mm KH 2 PO 4 1.2 mm glükóz 11.0 mm* 180 CaCl 2 2.5 mm EDTA-Na (selecton B 2 ) 0.5 mm 372 piruvát 5.0 mm 110 inzulin 100 mu albumin (BSA) 0.2 % * Szívizom energiaellátása 13
Oxigén ellátás Szív állapota MVO 2 (ml O 2 min -1 100g -1 ) Megállított szív 2 Szív nyugalomban 8 Szív terhelés alatt 70 Agy 3 Vese 5 Bőr 0.2 Izom nyugalomban 1 Izom terhelés alatt 50 5 ml/l=cf 14 ml/min http://www.colby.edu/chemistry/ch331/o2%20solubility.html 30-35 salinity (norm see) 35 g/l (600 mm) 14
Végpontok, paraméterek Infarktus méret Morfológia, szövettan Miokardium kontraktilis funkciói Átáramlások: aorta, koronáriák, perctérfogat Kamrai nyomás és származékai Kamrai térfogat és származékai Elektrofiziológia és aritmiák Szöveti és perfuzátum minták különféle biokémiai és egyéb mérésekre 15
Adatgyűjtő rendszer elektromos aktivitás (ECG) aorta átáramlás AF koronária átáramlás CF perctérfogat CO aorta nyomár AP kamrai nyomás 16
Perfúziós rendszer Tárolóelemek: Összekötő elemek: Elvárások anyagokkal szemben: Neely rezervoár Langendorff rezervoár Buborékcsapda és szélkazán edénye Bal pitvari reservoár Szívedény Flexibilis összekötő elemek Merev összekötő elemek Kanülök merev és térfogattartó alaktartó, funkciótól függően hajlékony vagy merev átlátszó hőálló könnyen tisztítható sav és lúgálló gyógyszeret, anyagokat ne abszorbáljon viszonylag olcsó, könnyen cserélhető 17
December 14, 2017 18
December 14, 2017 19
December 14, 2017 20
Sejttenyészet a kardiovaszkuláris kutatásokban Gáspár Renáta, Csonka Csaba Szegedi Tudományegyetem,
Bevezetés A sejttenyésztés folyamata során prokarióta, eukarióta vagy növényi sejteket növesztünk vagy tartunk fenn kontrollált körülmények között A gyakorlatban állati eredetű sejtek tenyésztését értjük a kifejezés alatt A sejttenyésztés története több mint 100 évre vezethető vissza
Sejtkultúra típusai Primer sejtkultúrák (faj, szerv/sejt típus, neonatális, felnőtt) Immortalizált sejtvonalak (pl. H9C2, HL-1, AC16) Embrionális őssejtek Indukált pluripotens sejtek
Sejtkultúra típusai 2D sejtkultúra 3D sejtkultúra
Mérföldkövek a sejttenyésztés technológiai fejlődésében Az antibiotikumok használata (gátolja a kontamináló baktériumok növekedését) A trips pszin használata lehetővé tette az adherens sejtek szétválasztását (primer kultúrák létrehozása, sejtvonalak passzálása) Kémiailag jól definiált összetételű tenyésztő médium kialakítása
Sejttenyészetek főbb felhasználási területei Modell rendszer: Sejt biológia alapkutatások, betegséget okozó anyagok és sejtek kölcsönhatásának vizsgálata, gyógyszerek és gyógyszerjelöltek sejthatásainak vizsgálata (farmakológiai screening), Toxicitás vizsgálata Új gyógyszerjelöltek potenciális toxikus vagy mellék-hatásainak vizsgálata Rák kutatás Különböző vegyi anyagok, vírusok sugárzások hatásainak vizsgálata a rákos elfajulásra Virológia Vírusok szaporítása, vakcina termelés, vírusok hatásainak vizsgálata Genetic Engineering Fehérjék és egyéb biotechnológiai termékek előállítása Génterápia & szövet regeneráció Nem funkcionáló génekkel rendelkező sejtek helyettesítése funkcionáló géneket kifejező sejtekkel
Primer sejtkultúra készítése Primer sejttenyészet:egy élő szervezetből sejteket izolálunk (enzimatikusan vagy sebészi úton), s azokat megfelelő tenyésztő közegbe helyezve növesztjük őket.
Primer neonatális szívizomsejt kultúra előállítása 1-3 napos Wistar patkányok szívek izolálása emésztés
Primer neonatális szívizomsejt kultúra előállítása 24 óra előkiültetés növesztő médium differenciáló médium
állat NEONATÁLIS Újszülött - olcsó (limitált sejtszám érhető el) FELNŐTT Felnőtt drága (több sejt) elkészítés egyszerű komplikáltabb szenzitivitás Relatíve könnyen előállítható Nagyon érzékeny élettartam Néhány nap, max 2 hét (hosszabb időtartamú kísérletek is) max 2-3 nap (csak rövid időtartamú kísérletek) kontamináció igen, pl. fibroblaszt Nem jellemző Felszíni bevonat Nem szükséges kizárólag laminin-nal bevont felszínre tapadnak médium DMEM Médium 199 + további komponensek azonosítás Immunhisztokémia Mikroszkópos morfológia kitapadó igen igen
Sejtvonalak a tenyészet sejtjei vég nélkül képesek proliferálni mivel ezek a sejtek folymatosan osztódnak, benővik a rendelkezésre álló felületet, s ezért időről időre új tenyésztő edénybe kell őket átvinni (Passzálás) A sejteket le lehet fagyasztani, és később tovább tenyészteni őket Ha túlságosan hosszú ideig tartjuk fenn a tenyészetet, a spontán mutációk kialakulásának esélye növekszik Nem igényel állatokat A sejtek biológiája eltérhet azoktól a sejtekétől amelyeket modelleznek (pl. H9C2 kardiomiociták nem kontrahálnak)
2 napos neonatális szívizom kultúra
1 napos felnőtt szívizom kultúra
Tenyésztő médium A megfelelő médium kiválasztása függ a tenyésztett sejt típusától Általánosan használt médiumok: DMEM, GMEM, EMEM, stb. Általában bikarbonát alapú puffer A médiumot antibiotikummal (penicillin, sztreptomicin, stb) egészítjük ki ph, nutriensek, ionok, indikátor
Sejt toxicitás A citotoxikus hatások gátolják a sejtek növekedését Toxikus hatásokra a sejtréteg valamint az egyes sejtek morfológiája is megváltozhat (pl. óriás sejtek, többmagvú sejtek, szemcsés, egyenetlen megjelenés, vakuolumok a citoplazmában vagy a sejtmagban) A sejt toxicitás az életfunkciók elvesztését okozhatja A citotoxicitás mértékét különféle viabilitás mérési módszerekkel lehet meghatározni
Viabilitás mérés ELHALT SEJTEK Tripán-kék kizárás Propidium jodid (PI) Biológiai Membrán Membrán indikátor integritás integritás Detektálás módszere Kolorimetria mikroszkóp Fluoreszcencia FACS Idő 2 h 30 min limitáció 24 lyuk max 10 6 sejt/lyuk szükséges + Imre
Viabilitás mérés ÉLŐ SEJTEK Cell-Titer Glo (ATP) Cell Titer Blue resazurin Cell Titer 96 (MTS) MTT Biológiai indikátor ATP tartalom Redukáló képesség Redukáló képesség Redukáló képesség Detektálás Biolumi- Fluorimetria Kolorimetria Kolorimetria módszere neszcencia vagy kolorimetria Idő 10 min 1-4 h 1-4 h 4 h Szenzitivitás (96 plate) limitáció 50 sejt 390 sejt 800 sejt 800 sejt Lumi Fluoro olvasó olvasó
Sejt viabilitás tripán-kék festés bejut a nem-életképes vagy elhalt sejtekbe, míg az egészséges sejtekbe nem tud bejutni - életképes sejtek %-a = nem festődő sejtek száma x 100 össz sejtszám
Sejt viabilitás calcein festés calcein Mag as viab Alac ilitá Kardio sony s miocit viab háttér a ilitá kultúra
Szimulált iszkémia kivitelezése
Szimulált iszkémia kivitelezése
Sejttenyészet kontamináció A sejttenyészet kontaminációja eredetét tekintve lehet: Kémiai - nehéz kimutatni, okozhatja pl. endotoxin, fémionok vagy fertőtlenítőszer nyomai, amelyek nem láthatóak
Sejttenyészet kontamináció Biológiai látható jelei vannak a sejttenyészeten; ilyenek a mycoplasma, élesztő, baktériumok vagy gombák, de más sejtekkel történő kontaminálódás is ide sorolható Sejtenyésztő fülke & CO2 inkubátor!
Laminar box Segít megelőzni a kultúra kontaminációját amikor a sejtekkel dolgozunk (termék védelem) A kísérletező személyt és a környezetet is véd(het)i HEPA-szűrt levegőt keringtet
CO 2 inkubátor Fenntartja a CO 2 szintet (5-10%), Biztosítja páratartalmat és hőmérsékletet (37 o C) Izolálja a plateket a környezettől Tri-gáz inkubátor (CO 2, O 2, N 2 szintje szabályozott)