Lipopoliszacharidomika

Lipopoliszacharidomika Kilár Anikó écsi Tudományegyetem Kémia Intézet (TTK) Bioanalitikai Intézet (ÁOK) Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet (ÁOK) Magyar Tudomány Ünnepe 2012

Bakteriális lipopoliszacharid Gram-negatív baktérium Lipopoliszacharidok sejtfal A Gram-negatív baktériumok külsı sejtmembránjában található, erıs immunrendszer-stimuláló hatással rendelkezı molekulák. szeptikus sokk kiváltói, halálozási arány 30-60%

World Sepsis Day (2012 szeptember) [1] Sepsis: Hall MJ et al., A. NCHS data brief, no 62. Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics. 2011. [1] MI: Yeh RW, et al., N Engl J Med, 362:2155-2165, 2010. [1] Stroke: Feigin VL, et al., Lancet Neurol, 8:355-369, 2009. [1] Cancer: http://apps.nccd.cdc.gov/uscs/toptencancers.aspx [1] HIV: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/mc2919237/?tool=pubmed (2006) [2] http://report.nih.gov/categorical_spending.aspx, http://www.kff.org/hivaids/7029.cfm

Orvosi-élettani Nobel-díj j (2011) Azonosította a bakteriális lipopoliszacharid receptorát. Bruce Alan Beutler Toll-like receptor 4 (TLR4) myeloid differenciációs faktor-2 (MD-2) LS komplex molekuláris modellje.

Lipopoliszacharidok ( endotoxinok ) kimutatási lehetıségei Nyúl-teszt (lázkeltés) LAL-teszt (Limulus Amoebocyta Lizátum) gélképzıdés FDA visszavonta 2011-ben ( elavult ) infúziók, dializáló oldatok és egyéb parenterális készítmények sterilitási és pirogenitási ellenırzésére használatos, rendkívül érzékeny módszerek

Cél: új j kimutatási módszerek m kifejlesztése se Modern analitikai eszközökkel: Kromatográfia (GC; LC) Elektroforézis (CE; mikrochip CE) Tömegspektrometria (MS; MS/MS és MS n ) Kapcsolt technikák (GC-MS, HLC-MS, CE-MS)

Cél: új j kimutatási módszerek m kifejlesztése se [1] A. Kilár, B. Kocsis, I. Kustos, F. Kilár, S. Hjertén: CE to monitor endotoxins by protein complexation. Electrophoresis 27, 2006, 4188-4195. [2] A. Kilár, V. Farkas, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár: Novel quantitative electrophoretic analysis of endotoxins on microchips. Electrophoresis 29, 2008, 1713-1722. [3] A.Kilár, Z.éterfi, E.Csorba, F.Kilár, B.Kocsis: Capillary electrophoresis chips for screening of endotoxin chemotypes from whole-cell lysates. Journal of Chromatography A 1206, 2008, 21-25. [4] A. Kilár, Á. Dörnyei, A. Biu, Z. Szabó, B. Kocsis, F. Kilár. Structural variability of endotoxins from R-type isogenic mutants of Shigella sonnei. Journal of Mass Spectrometry 46, 2011, 61-70. [5] A. Bui, A. Kilár, Á. Dörnyei, V. oór, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár. Carbohydrate Composition of Endotoxins from R-type Isogenic Mutants of Shigella sonnei Studied by Capillary Electrophoresis and GC-MS. Croatica Chimica Acta 84, 2011, 393-398. [6] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár: Quantitative microfluidic analysis of S- and R-type endotoxin components with chip capillary electrophoresis. Electrophoresis 33, 2012 DOI 10.1002/elps.201200167 [7] A. Kilár, Á. Dörnyei, B. Kocsis. Structural characterization of bacterial lipopolisaccharides with mass spectrometry and on- and off-line separation techniques. Mass Sectrometry Reviews, 2012 DOI: 10.1002/mas.21352

A bakteriális lipopoliszacharid (LS) molekula szénhidrát régió lipid régió S-típusú LS virulens R-típusú LS avirulens roblémák: -OLDHATÓSÁG -OTIKAI DETEKTOROK ALKALMAZÁSA

Mikrochip elektroforézis módszer kifejlesztése se

LS kimutatása mikrofluidikával Mikrochip elektroforézis fluoreszcencia detektálással (Agilent) n=0 gyors azonosítás (R/S típus) karakterisztikus profilok mennyiségi meghatározás R-LS (Salmonella) minta n=0 S-LS (E. coli) n=1 n=2 n=3 n=19 n: poliszacharid lánc ismétlıdı egységek száma [1] A. Kilár, V. Farkas, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár. Novel quantitative electrophoretic analysis of endotoxins on microchips. Electrophoresis 29, 2008, 1713.

R-típusú lipopoliszacharidok detektálása mikrochippel Salmonella minnesota R595 Shigella sonnei R41 Shigella sonnei 4303 E.coli D31 [2] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár. Electrophoresis 33, 2012

S-típusú lipopoliszacharidok detektálása 1600 1400 S.. mikrochippel Escherichia coli O83 600 S.. Salmonella minnesota wild type FU 1200 1000 800 600 400 FU 500 400 300 200 FU 200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 migration time (s) S.. Escherichia coli O21 10 20 30 40 50 60 migration time (s) 100 n=19 n=24 A baktérium azonosítása? n=18 FU 0 15 25 35 45 55 65 75 migration time (s) 2500 2000 1500 1000 500 0 S.. 150 100 50 0 roteus morganii 352 25 35 45 55 n=29 10 20 30 40 50 60 migration time (s) [2] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár. Electrophoresis 33, 2012

Tömegspektrometriás módszer kifejlesztése se (MALDI-TOF)

LS + Mátrix (1 µl)

http://www.wiley-vch.de/books/info/3-527-30354-5/ Tömegspektrometriás vizsgálatok Készülék: Bruker Autoflex II. MALDI-TOF/TOF MS Software: FlexControl 2.4 Mátrix: 2,5-dihidroxi-benzoesav Detektálás: negatív [M-H] ionok, 800-10000 Da tartomány Minta: 1 mg/ml LS 0,1 M citromsavban

R-LS vizsgálata tömegspektrometri megspektrometriával Shigella sonnei 4303 LS MALDI-TOF tömegspektruma (negatív ion, lineár mód) (tri-acyl) 1134.5 1274.2 1354.1 1360.9 1568.7 1626.3 3122.0 (tri-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) 3637.3 1723.0 1798.0 1803.1 (hexa-acyl) 1943.2 1987.3 2023.0 2067.3 3348.7 3428.6 (tetra-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) 3557.2 (penta-acylunsat Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 ) 3786.8 3865.9 (hexa-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) Intens. [a.u.] 800 600 400 200 0 Lipid Core A 1000 1500 2000 2500 3000 3500 (Hep2 Hex ) 5 2 (tetra-acyl) (penta-acylunsat ) (Hep3Hex53) (Kdo(-CO2)Hep3Hex52) (Kdo2 Hep3Hex53) Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 1546.2 1767.1 1846.4 (KdoHep3Hex53) Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Intakt LS CO 2 m/z Core régió Lipid A A Shigella sonnei R-LS vázlatos szerkezete A. Kilár, Á. Dörnyei, A. Biu, Z. Szabó, B. Kocsis, F. Kilár. Structural variability of endotoxins from R-type isogenic mutants of Shigella sonnei. Journal of Mass Spectrometry 46, 2011, 61-70.

LS régir giók k vizsgálata külön-különk O-poliszacharid NMR GC-MS külsı core Core oligoszacharid belsı core enyhe savas hidrolízis (1-2% ecetsav, ph 3-4, 100 C, 1 óra) Lipid A GC-MS MS zsírsavak

A szepszist okozó Lipid A régir gió HO O OH O O 14 6' 4' 3' OH 5' 2' O 1' GlcN II O NH O O O O 14 14 12 O HO O O 14 6 5 4 3 2 O 1 GlcN I O O NH O O OH OH OH 14 OH A legtoxikusabb a fent látható E. coli típusú lipid A.

A biológiai hatás s függf ggése a szerkezettıl Endotoxikus Mérsékelten toxikus Inaktív [U. Seydel et al., Eur. J. Biochem. 267, 2000, 3032]

Lipid A vizsgálata tömegspektrometri megspektrometriával Salmonella minnesota R595 Lipid A MALDI-TOF tömegspektruma (negatív ion, reflektron mód). 1035.79 (tri-acylunsat ) 1053.58 (tri-acyl) 1097.72 1261.92 1177.65 1279.83 1359.83 1387.94 (tetra-acyl) (tetra-acyl) (penta-acyl) 1488.03 1490.01 1506.04 1568.01 (penta-acylunsat. ) 1598.06 1586.01 (penta-acyl) (penta-acyl) 1716.18 1824.21 (hexa-acyl) Intens. [a.u.] 1796.21 (hexa-acyl) 250 200 150 100 50 0 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 (tri-acyl) m/z Tandem tömegspektrometria alapján javasolt szerkezet.

Tandem tömegspektrometria során lejátsz tszódó folyamatok Hexa-acil lipid A Tri-acil lipid A C14:0 zsírsav vesztés 0,2 A 2 győrőhasadás C14:1 zsírsav vesztés m/z 1716.2 m/z 1488.0 C14:0(3-OH) C14:0(3-OH) m/z 1202.8 m/z 976.6 Di-acil lipid A C14:0 zsírsav vesztés 0,4 A 2 győrőhasadás C14:1 zsírsav vesztés m/z 1472.0 m/z 1243.8 m/z 916.6 m/z 690.4 A. Kilár, Á. Dörnyei, B. Kocsis. Structural characterization of bacterial lipopolisaccharides with mass spectrometry and on- and off-line separation techniques. Mass Sectrometry Reviews, 2012 DOI: 10.1002/mas.21352

Összefoglalás A lipopoliszacharidomika területén belül a bakteriális lipopoliszacharidok (endotoxinok) szerkezetkutatásával foglalkoztunk. Sikerült új, gyors és nagy érzékenységő szerkezetmeghatározási módszereket kifejlesztenünk: kapilláris elektroforézis, mikrochip elektroforézis, tömegspektrometriás és CE-MS kapcsolt technikák alkalmazásával. A szerkezet ismerete elengedhetetlen az lipopoliszacharidmolekulák pathomechanizmusának megértéséhez.

Kösz Kösz szönöm szönetnyilvánítás m a figyelmet! Bioanalitikai Intézet rof. Kilár Ferenc Dr. Dörnyei Ágnes Makszin Lilla (hd hallgató) Sándor Viktor (hd hallgatóm) Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet rof. Kocsis Béla Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet Dr. Szabó Zoltán ályázatok OTKA K-100667 CEEUS HU-0010 Szentágothai Kutató Központ TÁMO 4-2-1-B TÁMO 4-2-2-B