5. szeminárium Biokémiai számítások Jelen szeminárium célja a korábbi szemináriumok során tárgyalt diagnosztikus célú vizsgálatok és a fehérje-izolációs módszerek kapcsán leggyakrabban előforduló számolások gyakorlása. Egy valódi tisztítási folyamatot egy patofiziológiai szempontból releváns enzim, az alkalikus-foszfatáz (ALP) példáján fogunk szemléltetni. Elméleti háttér: Az ALP egy lúgos közegben aktív hidroláz (M=49,4 kda, pi=5,7), amely a szervezet számos foszforilált metabolitjából képes inorganikus foszfát-csoportot (P i ) felszabadítani. Az ALP homodimerként aktív és két legfőbb izoformája a vázrendszerben és a májban megtalálható izoforma, melyek közül az előbbi a nukleotidok, míg utóbbi a fehérjék defoszforilálását végzi. Az ALP megváltozott expressziós-szintje különböző malignus kórképek jellemző tünete lehet. Az ALP vérben mért koncentrációjának emelkedése figyelhető meg bizonyos típusú leukémiák és limfómák esetén, míg csökkenése krónikus mieloid leukémiában jellemző. Az enzim expressziós szintje más patofiziológiai folyamatokban, többek között hepatitisben, hipertireózisban, anémiában és csecsemőkori enteritisben ugyancsak eltérő értékeket mutathat. Célkitűzés: Célunk az ALP expressziója, tisztítása, katalitikus aktivitásának mérése és szerkezetének meghatározása. A bakteriális ALP-t a C-terminálisán egy címke (tag) szekvenciával E. coli-ban szeretnénk expresszálni. A fehérjetermelő sejteket egy éjszakán át rázva inkubáljuk, majd másnap sejtfeltárást végzünk. A lizátum centrifugálását követően, a sejttörmeléktől elválasztott felülúszót affinitás-kromatográfiás oszlopra visszük. A fehérje megkötődése után mosó-pufferrel a nem-specifikusan kötődő anyagokat lemossuk az oszlopról, végül pedig eluáljuk a fehérjét. K1: Milyen ph-jú mosó-puffert alkalmazzunk? Mivel az ALP lúgos ph-n aktív, az enzimaktivitás megőrzése érdekében lúgos ph-jú (pl. ph=9) puffert érdemes alkalmaznunk. A kromatográfiás elválasztás hatékonyságának és a fehérje-termék tisztaságának ellenőrzésére az egyes tisztítási lépések során gyűjtött frakciókból vett mintákat SDS-PAGE analízisnek vetjük alá. K2: A standardként használt 30 és 92 kda moláris tömegű fehérjék relatív elektroforetikus mobilitásai (a fehérjék futási távolságai/a jelölő festék futási távolsága) 0,80 és 0,41. Melyik mobilitási érték tartozik az egyik, illetve a másik standard fehérjéhez? Számolja ki az ALP (M=49,4 kda) várt relatív elektroforetikus mobilitását, figyelembe véve azt, hogy a natív fehérje egy homodimer! Elsőként határozzuk meg a két standard fehérje relatív mobilitás lg(m) értékpárjaira illeszthető egyenes egyenletét, két egyenletből álló kétismeretlenes egyenletrendszer segítségével: y=-0,80x+1,98. Az ALP moláris tömegének logaritmusát (lg(49,4)=1,694) az egyenletbe behelyettesítve a várt relatív mobilitás 0,63-nak adódik. Fontos, hogy SDS-PAGE során az ALP homodimerek disszociálnak, tehát a gélen a monomereket detektáljuk. A valóságban a standard minta ( létra ) kettőnél több fehérjét tartalmaz. Minél több pontra illesztjük az egyenest, annál pontosabban határozható meg az egyenes egyenlete és végül majd az általunk vizsgált fehérje várt relatív mobilitása is. 1
Probléma: Az affinitás-kromatográfiás tisztítást követően a gélen az ALP sávja mellett számos szennyeződés is megfigyelhető (1. ábra: 1. oszlop). A gélkép alapján levonható következtetések: 1.) az ALP overexpressziója megtörtént, tehát az expressziós protokoll megfelelő; 2.) további tisztítási lépések beiktatására van szükség. 1. ábra Az affinitás- (1. oszlop) vagy ioncserekromatográfiás (2. oszlop) tisztítás után nyert minták SDS- PAGE gélképei. A két módszert egymás után alkalmazva a minta nagyobb fokú tisztaságot mutat (3. oszlop). A kívánt tisztaságú ALP affinitás-, ioncsere- és méretkizárásoskromatográfiák egymás után történő alkalmazásával állítható elő (4. oszlop). A standard létra (nem látszik) által kijelölt kda értékek a baloldalon láthatóak. Egy ioncsere-kromatográfiás előtisztítási (azaz az affinitás-kromatográfiát megelőző) lépés beiktatását tervezzük a szennyeződések mértékének csökkentésére. K3: Milyen kémhatású puffert alkalmazzunk? Milyen típusú ioncserét válasszunk? Az enzimaktivitás megőrzése érdekében továbbra is lúgos közegben (pl. ph=9) érdemes dolgozni. ph=9-es oldatban az ALP nettó töltése negatív (mivel a pi=5,7), tehát anioncserére van szükség. A kapott ioncsere-profilon (2. ábra) megfigyelhető két csúcs azonosítása érdekében a csúcsokhoz tartozó frakciókat SDS-PAGE analízisnek vetjük alá (2. ábra, gélkép). K4: Melyik frakciót (vagy frakciókat) használná a soron következő affinitás kromatográfiás tisztításhoz? A 7-13-as számú frakciókat érdemes a továbbiakban használni, mivel ezekben a nagy mennyiségben jelen levő ALP-hez képest a kontamináció kismértékű. 2. ábra Ioncsere-profil. A kromatogramon az A 280 (ma.u. mértékegységben kifejezett) értékét az elúciós térfogat (ml) függvényében ábrázoltuk. A lizátum felvitelét és mosását követően só-gárdiens elúciót végeztünk. A piros számozással jelölt frakciókat gyűjtöttük és SDS-PAGE analízisnek vetettük alá (lásd gélkép; a standard létra és a megfelelő kda értékek az ábra bal oldalán láthatóak). 2
Az ioncsere-kromatográfiás tisztítás során kapott első elúciós csúcsot (az egyesített frakciókat) affinitáskromatográfiás tisztításnak vetettük alá, amely viszonylag tiszta ALP-mintát eredményezett (1. ábra: 3. oszlop). A tervezett szerkezet-meghatározási vizsgálatokhoz elengedhetetlen a teljes homogenitásig történő tisztítás, ezért egy további méretkizárásos-kromatográfiás lépést is beiktatunk. A ~14 ml-nél megfigyelt fő elúciós csúcshoz tartozó frakciókat gyűjtjük, ezek tartalmazzák az ALP-t. Ez a megtisztított fehérje-mintánk, melynek tisztaságát SDS-PAGE-analízissel ellenőrizzük (1. ábra: 4. oszlop). A következő feladat a minta fehérje-koncentrációjának meghatározása. 3. ábra Gélfiltrációs profil. A 280 (ma.u.) az elúciós térfogat (ml) függvényében ábrázolva. Az ALP ~14 ml-nél eluálódik a gélfiltrációs oszlopról. K5: Az ALP 280 nm-en jellemző moláris extrinkciós koefficiense 33000 M -1 cm -1. Mekkora a minta moláris koncentrációja, ha 10-szeres hígítást követően egy 1 cm fényúthosszúságú kvarc küvettában a mért abszorbancia (A 280 ) 0,267-nak adódik? Mennyi a koncentráció mg/ml-ben és mennyi fehérjét tartalmaz a minta összesen, ha a végső mintatérfogat 250 µl és M ALP =49,4 kda? Miért szükséges kvarc küvettát használnunk a méréshez? Szükséges volt a minta hígítása a mérést megelőzően? A Lambert-Beer törvény (A=ε*c*l) értelmében a moláris koncentráció 80,9 µm, amely 4 mg/ml-nek és 1 mg teljes fehérje-mennyiségnek felel meg. Az egyszerű üveg vagy műanyag küvettával szemben a kvarcüveg az UV-tartományban is átengedi a fényt, így használata 280 nm-en történő mérés esetében elengedhetetlen. Az abszorbancia csak egy bizonyos határértékig (A < ~1) áll lineáris összefüggésben a koncentrációval. A mérést megelőző 10-szeres hígítás nélkül A 280 =2,67 lenne, tehát a hígítás indokolt volt. Annak alátámasztására, hogy a megtisztított fehérje megtartotta katalitikus aktivitását, illetve az enzimaktivitás kvantitatív meghatározására az enzim által AMP-ből (szubsztrát) felszabadított P i (reakciótermék) mennyiségét mérjük az idő függvényében kolorimetriásan az ALP egy molekula AMP-ből egy molekula P i -t képes felszabadítani. Ehhez az ún. Fiske-Subarrow-módszert alkalmazzuk: a P i molibdáttal savas környezetben reagál és kék színű foszfo-molibdát komplexet képez. A reakcióelegyet az alábbiak szerint készítjük: Puffer 17 µl 20 mm AMP 2 µl 1000-szeres hígítású ALP-minta 1 µl 3
Megjegyzés: a tisztítást követően az ALP-mintát 1000-szeresére hígítottuk, majd az így kapott oldatból 1 µl-t adtunk a 20 µl végtérfogatú reakcióelegyhez. K6: Mennyi az ALP koncentrációja az 1000-szeresére hígított mintában és a végső 20 µl térfogatú reakcióelegyben? Mennyi az AMP koncentrációja a végső reakcióelegyben? Hány szubsztrát molekula jut egy fehérje molekulára (szubsztrát/enzim arány)? [ALP] kiindulási =80,9 µm, [ALP] 1000-szeres hígítás =80,9 nm, [ALP] reakcióelegy =4 nm, [AMP] reakcióelegy =2 mm, szubsztrát/enzim arány=500000. A reakciót az AMP hozzáadásával indítjuk. 10 perc inkubáció után a színreagenst is a reakcióelegyhez adjuk, ami a ph savas tartományba tolásával az ALP denaturációját okozza, így az enzimreakció leáll. Az elegyet további 20 percig inkubáljuk, ez idő alatt a kék szín fokozatosan kifejlődik. Végezetül a minta abszorbanciáját 715 nm-en (A 715 ) mérjük, miután a fotométert vízzel, mint vak -oldattal szemben nulláztuk. A mérés eredményeképpen A 715 =0,578. A reakcióelegy összemérésével párhuzamosan KH 2 PO 4 standard-oldatokat is készítünk (amelyek a P i -t ismert koncentrációkban tartalmazzák) és ezek abszorbanciáját (A 715 ) is mérjük: [Pi] (mm) A715 0 0,00 0,5 0,25 1,0 0,53 1,5 0,68 2,0 0,97 K7: Számolja ki az ALP enzimaktivitását (U egységben) a 20 µl-es reakcióelegyben és a teljes megtisztított mintában, a fajlagos (specifikus) aktivitást és az átviteli számot (k cat )! Elsőként ábrázoljuk a standard oldatok [P i ]-A 715 értékpárjait. A kalibrációs pontokra illesztett egyenes egyenlete: y=0,482x (a tengelymetszet az origóban van, mivel a vak-oldat P i -re nézve 0 mm koncentrációjú volt). A kalibrációs egyenes alapján az enzimatikus úton felszabadított P i mennyisége: 0,578/0,482=1,2 mm. Tehát a 20 µl-es reakcióelegyben, ami 4 ng fehérjét tartalmaz, a [P i ] növekedése 0,12 mm/min, azaz 120 µmol/l/min x 20x10-6 l = 0,0024 µmol P i /min. Az enzimaktivitás tehát 0,0024 U = 2,4 mu. A tisztítást követően kapott fehérje törzsoldat 1 mg fehérjét tartalmazott, a reakcióelegyben jelenlevő mennyiség 250000-szeresét, az abban mérhető enzimaktivitás tehát 250000 x 0,0024 U = 600 U lenne. A fajlagos aktivitás 600 U/mg. 1 mg fehérje 0,02 µmol-nak felel meg (49,4 kg/mol=49,4 mg/µmol). Ebből adódóan az átviteli szám k cat =600 µmol / 60 s/ 0,02 µmol = 500 s -1. Mivel minden tisztítási lépés során gyűjtött mintából megtartottunk egy kisebb mennyiséget, ki tudjuk számolni a tisztítás fokát, azaz hogy hányszorosára nőtt az ALP fajlagos aktivitása a nyers lizátumhoz képest. A tisztítás során a szennyező fehérjékkel együtt az ALP mennyisége is elkerülhetetlen módon csökken. A kiindulási lizátumban és a tiszta mintában mérhető enzimaktivitás értékek összehasonlításával a kitermelés hatékonysága, a kitermelési százalék is megadható. 4
K8: A sejtfeltárással kapott nyers ALP preparátum térfogata 100 ml volt, a Bradford-méréssel meghatározott összfehérje koncentrációja pedig 10 mg/ml. A nyers minta 100-szoros hígítását követően 1 µl-t adunk a 20 µl végtérfogatú reakcióelegyhez. Az előzőekben is alkalmazott Fiske-Subarrow módszerrel 300 µm P i felszabadulását mérjük 10 perc inkubációt követően. A kapott eredmények alapján mekkora a tisztítás foka és a kitermelési százalék a soklépéses tisztítást követően? 20 µl reakcióelegyben, ami 0,1 µg fehérjét tartalmaz, a [P i ] növekedése 30 µm/min, azaz 30 µmol/l/min x 20x10-6 l = 0,0006 µmol P i /min. A reakcióelegyben mérhető enzimaktivitás tehát 0,0006 U = 0,6 mu. Mivel a kiindulási preparátumban a fehérje mennyisége (1 g) 10 7 -szerese a reakcióelegyben jelenlevő mennyiségnek, a lizátumban mérhető enzimaktivitás 10 7 x0,0006 U= 6000 U. A fajlagos aktivitás 6000 U/g = 6 U/mg. A tisztított és a kiindulási minta fajlagos aktivitásának aránya (600 U/mg) / (6 U/mg) = 100, a tisztítás foka tehát 100-szoros. Az enzimaktivitások aránya 600 U / 6000 U = 0,1, azaz a kitermelési százalék mindössze 10 %. Összességében a vizsgálni kívánt fehérjét nagy tisztaságban és a kiindulási lizátumhoz képest 100-szoros koncentrációban sikerült előállítani, azonban a tisztítási procedúra során jelentős mértékű (90%-os) enzimaktivitás-csökkenést tapasztaltunk, azaz az ALP 90%-át elvesztettük a folyamat során. Ennek kiküszöbölésére a továbbiakban megfontolandó: 1.) a használt puffer-oldatok ph-jának további emelése, ami potenciálisan hatékonyabb kötődést eredményezhet az anioncserélő-oszlophoz, 2.) az ioncsere- és affinitás-kromatográfiás oszlopok kötőkapacitásainak növelése (nagyobb térfogatú oszlopok alkalmazásával), amely által akár a teljes expresszált ALP mennyiség megkötése is lehetővé válhat. A kromatográfiás oszlopokra való mintafelvitel során gyűjtött ún. átfolyó-frakció SDS-PAGE vizsgálata egy bevett gyakorlat a meg nem kötött cél-fehérje mennyiségének ellenőrzésére. Végezetül a nagytisztaságú fehérje-produktumot kristályosító oldat-sorozatokkal vizsgáljuk a kristályosítási körülmények optimalizálása érdekében. Ilyen módon megfelelő minőségű, diffraktáló kristályokat sikerült előállítanunk, melyeket röntgendiffrakciós-analízisnek alávetve meghatározzuk az ALP dimer térszerkezetét (4.a ábra). A szerkezetben eltérő színnel jelöltük a P i -kötő doméneket (4.b-c ábra). A kapott szerkezeti információk segítségünkre lehetnek például specifikus ALP-inhibitorok tervezésében. 4. ábra Az E. coli alkalikus-foszfatáz térszerkezete. Az 1,75 Å felbontású szerkezetet röntgen-krisztallográfiás módszerrel határozták meg. a Az enzimfehérjét két polipeptid lánc (zöld és ciánkék) építi fel, melyek egy-egy foszfátiont (narancssárga) képesek megkötni. b A szerkezetben színessel jelölt aminosav-oldalláncok egy Mg 2+ - és két Zn 2+ - ion segítségével alegységenként egy foszfát-iont kötnek. Néhány másodlagos szerkezeti elem a szemléletesebb ábrázolás érdekében nem került feltüntetésre. c Az aminosav-oldalláncok és az ionok közötti kölcsönhatások oldalnézetben. 5