Vese (patho) fiziológiai vizsgálatok mutifoton mikroszkóp segítségével

Vese (patho) fiziológiai vizsgálatok mutifoton mikroszkóp segítségével Doktori tézisek Dr. Sipos Arnold Semmelweis Egyetem Elméleti Tudományi Doktori Iskola Témavezetők: Dr. Rosivall László M.D., Ph.D., Med. habil., D.Sc.Med. Dr. Peti-Peterdi János M.D., Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Osváth Szabolcs, Ph.D. Dr. Balla József, M.D., Ph. D., Med. habil., D.SC.Med Szigorlati bizottság elnöke: Dr.Monos Emil, M.D., Ph.D., Med. habil., D.Sc.Med. Szigorlati bizottság tagja: Dr. Bartha Jenő, M.D., Ph.D. Dr. Kiss István, M.D., Ph.D. Budapest 2009

BEVEZETÉS A multifoton fluoreszcens mikroszkóp egy új, konfokális képalkotó eszköz, amely alkalmas élő szövetek eddiginél alaposabb, a szövet mélyebb rétegeit is feltáró vizsgálatára. Ennek a technikának használatával lehetséges noninvazív, valós idejű méréseket végezni fiziológiás és különböző betegségmodellekben. A multiphoton fluoreszcens mikroszkóp olyan nagy térbeli és időbeli felbontást nyújt, amelyre eddig más képalkotó eljárás nem volt képes. Ezt az új vizsgálati módszert alkalmaztam tudományos munkám során azzal a céllal, hogy a veseélettan klasszikus területét, a tubuloglomerularis feedback (TGF) mechanizmust tanulmányozzuk. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy milyen szerepe van a tubuláris folyadékáramlásnak a TGF folyamatában. Ezen túlmenően megfigyeléseink során vizsgáltuk a TGF effektor válaszának, az afferens arteriolanak (AA) vazokonstrikcióját. Számos eredmény utalt arra, hogy az AA funkcionálisan több egymástól elkülönülő szakasszal rendelkezik, amelyek közül egy proximális és egy juxtaglomeruláris regió részt vesz a TGF mechanizmusában. Végezetül, vizsgálataink utolsó szakaszában a tubuláris folyadékáramlás hatását elemeztük a disztális nephron területén, arra keresve a választ, hogy milyen hatással van a tubuláris folyadékáramlás változása a vesekéreg gyűjtőcsatorna fősejtjeiben végbemenő Na + visszaszívására. Doktori tézisemet az alábbi három fejezetben foglalom össze: A tubuláris folyadékáramlás hatása a macula densa sejtekre Intraglomerularis precapillary sphincter: a TGF új eleme Tubularis ATP szekréció és a pressure natriuresis vizsgálata connexin 30 knockout egerekben 1 A TUBULÁRIS FOLYADÉKÁRAMLÁS HATÁSA A MACULA DENSA SEJTEKRE A tubuloglomeruláris feedback az egyik fő veseélettani folyamat, amelynek szerepe a glomeruláris filtrációs ráta és a glomeruláris véráramlás szabályozása. A szabályás központi eleme a disztális tubulus NaCl koncentrációjának ([NaCl]) változása. A macula densa (MD) sejtek környezetében megemelkedő tubuláris [NaCl] hatására olyan többlépcsős jelátviteli folyamat indul be, amely az AA értónusát növeli. Ez a glomeruláris véráramlás, a glomeruláris filtrációs ráta és ezek következtében a disztális tubulus Na + és folyadékterhelésének csökkenését eredményezi. Ennek a szabályzómechanizmusnak a morfológiai alapja az a nagyon pontos anatómiai felépítés, aminek eredményeképpen a disztális tubulus macula densa (MD) sejtjei, és a glomeruláris erek közvetlen kapcsolatba 2

kerülnek. Ez az anatómiai felépítés lehetőséget teremet a feedback mechanizmus kialakulására: a tubuláris [NaCl] és vízvisszaszívás szabályozására a pre- és post glomeruláris erek tónusának változtatása révén. A tubuloglomerularis feedback felfedezése óta a TGF mechanizmusa a tudományos kutatások középpontjában állt. A kitüntető figyelem ellenére a TGF folyamatának számos részlete nem ismert, ill. nem pontosan meghatározott. A tudományos eredmények egyik vitatott területe a tubuláris folyadékáramlásnak a TGF mechanizmusában betöltött szerepe. A tubuláris folyadékáramlás TGF-re gyakorolt hatását már korábban is feltételezék. A jelenleg elfogadott TGF modell a macula densa sejtek környezetében kialakuló tubuláris [NaCl] változásra épül. Viszont a tubuláris [NaCl] változásával párhuzamosan a tubuláris folydékármalás is változik: amikor a [NaCl] emelekedik a tubuláris folyadékáramlás is fokozódik. Ha ez a két komponens egyidejűleg, egymástól függően változik, felmerül a lehetőség, hogy a szenzor (macula densa sejt) mindkét komponenst képes érzékelni. Kísérleteimben a tubuláris folyadékáramlás TGF-re kifejtett hatását kívántam meghatározni. 1.1 Célkitűzések Tudományos vizsgálataim során az alábbi kérdésekre kerestem a válaszokat: 1. Kiváltható-e a tubuloglomeruláris feedback kizárólag a tubuláris folyadékáramlás változtatásával? 2. Mi érzékeli a tubuláris folyadékáramás változását a disztális tubulusban? 3. Milyen hatással van a tubularis [NaCl] változás a tubuláris folyadékáramlás által kiváltott TGF-re? 4. Milyen jelátviteli mechanizmus vesz részt a tubuláris folyadékáramlás megváltoztatása által kiváltott tubuloglomeruláris feedbackben? 1.2 Módszerek Immunohisztokémia: C57/BL6 egereket altatásban (Inactin pentobarbital) hideg, izotóniás sóoldattal perfundáltuk. A veséket paraformaldehid infúzóval in situ fixáltuk. A veséket kioperátuk, és a pólusokat összekötő síkra merőlegesen felszeleteltük, majd paraffinba ágyaztuk. A mintákból 5-µm metszeteket készítettünk. A metszeteket először alfa-tubulin monoklonális egér elleni antitesttel inkubáltuk, majd mosást követően kecskében termeltetett Alexa 594-gyel konjugált egér elleni másodlagos antitesttel kezeltük. Végezetül a mintákat PBS-sel történtő mosás után DAPI-t tartalmazó fedőanyaggal (Vectashield) fedtük. 3

In vitro izolált és mikroperfundált glomerulurs JGA: C57/BL6 egerekből szabad kézzel egyedi glomerulusokat disszekáltunk, a glomerulushoz tartozó AA-val és a disztális tubulussal együtt. Az első modellben a glomerulusról a disztális tubulust leválasztottuk oly módon, hogy a MD sejteket intakan, a glomerulussal kontaktusban hagytuk. A szöveteket, amelyekben a MD sejtek nem voltak azonosíthatók, vagy sérültek, a kísérletünkbe nem vettük bele. A szövetet 37 -s Ringer oldatot tartalmazó edénybe helyeztük. Az AA-t üveg mikropipettával kanüláltuk, Ringer oldattal perfundáltuk, és az intracelluláris Ca 2+ koncentrációt jelző Fluo-4 (1 μm, 25 C, 15 min.) festékkel töltöttük. A TGF feedback mechanizmust az alabbi stimulusokkal váltottuk ki: A.) a MD sejtek felszínére lamináris folyadékáramlást applikáltunk (20nl/min) 0, 10, 80, 135mM NaCl koncentrációjú sóoldatot használva. Az izotónia fenntartásának érdekében, a NaCl koncentrációjának csökkentésével párhuzamosan, az oldatot az alábbi komponensekkel helyettesítettük: NMDG cyclamat, KCl, K-gluconat, CaCl 2. Egy külön kísérleti csoportban, a NKCC2 transportert 0mM NaCl tartalmú Ringer oldat és furosemid kombinációjával blokkoltuk; tempol és suramin alkalmazásával a szuperoxide anion és purinerg jelátvitel szerepét teszteltük. B.) A folyadékáramlás megváltoztatása nélkül a MD sejtek primer ciliumát mikropipettával megdöntöttük. A művelet során vékony (3-5 m) vastagságú mikropipettát mozgattunk a MD sejtek apikális felszínéhez közel anélkül, hogy a MD sejtek sejtmembránját érintnénk. C.) Duplaperfúziós modellben az AA-t Ringer oldattal, míg a disztális tubulust 10 vagy 80mM koncentrációjú NaCl-ot tartalmazó oldattal perfundáltuk. A tubulus perfúziója során a perfúziós rátát konstansan, 20nl/min értéken tartottuk. Egy kísérleti csoportban furosemidet adtunk a 10 mm NaCl koncentrációjú perfóziós oldathoz. A kísérleti modellünkben a különböző stimulusok hatására létrejövő TGF feedbacket, mint az AA vascularis simaizomsejtjeiben létrejövő intracellularis Ca 2+ emelkedésként, ill. mint az AA érátmérőjének csökkenését regisztráltuk. Vizsgálatainkat Zeiss Axiovert 200M mikroszkóppal végeztük. Az adatainkat a Stallion program segítségével, 2ms-ként gyűjtöttünk. Statisztika Eredményeinket átlag standard hiba (SE) formájában közöljük. A csoportok összehasonlításánál egyszempontos varianciaanalízist alkalmaztunk. A nullhipotézist elvetettük, ha a hiba valószínűsége (p) 0,05 alatti érték volt. 1.3 Eredmények A tubiláris áramlás hatására létrejövő TGF A MD sejtek apikális felszínét lamináris folyadékáramlással stimuláltuk, aminek hatására az AA simaizomsejtjeiben szignifikáns intracelluláris Ca 2+ ([Ca 2+ ]ic) emelkedést 4

regisztráltunk. A simaizomsejtekben a megemelkedő [Ca 2+ ]ic az AA vazokonstrikcióját váltotta ki. Ez a reakció a folyadékáramlás létrehozására alkalmazott oldat NaCl koncentrációjátül független volt: a [NaCl] fokozatos csökkentésével a simaizomsejtekben létrejövő [Ca 2+ ]ic emelkedés mérséklődött, de ez a tendencia statisztikailag mérhető különbséget nem eredményezett. Kísérleteink egy részében az AA-n azonosítottunk két elkülönülő, összehúzódásra képes régiót: egy proximális és egy juxtaglomeruláris területet. Ezt a két érszakaszt a renin pozitív, kontrakciót nem mutató terület kötötte össze. A stimulus többszöri ismétlése után is [Ca 2+ ]ic emelkedést és vasoconstrikciót regisztráltunk az AA simaizomsejtjeiben. Deszenzitizáció nem lépett fel. A folyadékáramlás emelésével kiváltott TGF során [Ca 2+ ]ic emelkedést tapasztaltunk a podocytákban is. A podocyták [Ca 2+ ]ic változásai megegyeztek az AA simaizomsejtjeiben regisztráltakkal: deszenzitizációt nem tapasztaltunk. Ezen túlmenően a folyadékáramlással kiváltott TGF-ben a mesangium is részt vett: a glomerulus átmérője csökkent. Amikor a folyadékáramlási stimulust az NKCC2 kotranszporter gátlásával (0mM [NaCl] + furosemide) párhuzamosan végeztük, ugyanolyan [Ca 2+ ]ic emelkedést mértünk a AA simaizomsejtjeiben, mint a 0mM NaCl koncentrációjú oldat esetében. A szuperoxid anion szintézisének gátlása nem befolyásolta a feedback választ, ellenben a purinerg receptorok gátlása szignifikánsan csökkentette a feedback mechanizmust. A tubuláris [NaCl] változásának és a folyadékáramlás hatásának az összehasonlítása Duplaperfúziós modellben a disztális tubulust 20nl/min konstans folyadékáramlási sebességgel perfundáltuk. A kísérlet során 80mM [NaCl] perfúziós oldatot használva szignifikáns [Ca 2+ ]ic emelkedést és AA vasokonstrikciót tapasztatltunk. A kísérletet 10mM NaCl perfúziós oldattal megismételve ismételten [Ca 2+ ]ic emelkedést és AA vasokonstrikciót regisztráltunk, ami statisztikailag kisebb biológiai válasz volt összehasolítva a 80mM [NaCl] perfúziós oldat eredményeivel. Amikor 10 mm [NaCl] oldathoz furosemidet adtunk a tapasztalt [Ca 2+ ]ic emelkedés és AA vasoconstrikció megegyezett a 10mM [NaCl] oldatnal mérttel. MD primer cilium Egér vesemetszetek szövettani vizsgálata során 5-8μm hosszú, apikális ciliumot azonosítottunk. Minden MD sejt egy primer ciliummal rendelkezett. A MD sejt primer ciliumának stimulálása A MD sejtek primer ciliumát egy vékony, 3-5 μm vastagságú mikropipettával megdöntöttük. A stimulus az AA simaizom sejtjeiben azonnali [Ca 2+ ]ic emelkedéshez és az AA vasokonstrikciójához vezetett. A stimulus megismétlése nem eredményezett 5

deszenzitizációt. A biológiai válasz specifikus volt a stimulusra, mivel a sejtek direkt mechanikai ingerlése (a sejtmembrán érintése) nem eredményezett sem [Ca 2+ ]ic emelkedést sem vasoconstrikciót az AA területén. 1.4 Következtetések Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a minden MD sejt rendelkezik egy apikális primer ciliummal. Fizológiás körülményekhez hasonlóan a MD sejtek felszínén folyadékáramlást keltve vagy a primer ciliumokat megdöntve a TGF mechanizmussal megegyezően az AA simaizom sejtjeiben [Ca 2+ ]ic emelkedést, és az AA vazokonstrikcióját váltunk ki. Ebben a mechanizmusban részt vesznek az AA simaizomsejtjei, a podocyták, és a teljes mesangium. Deszenzitizáció a stimulusok többszöri ismétlésével sem lép fel. A tubuláris áramlással kiváltott feedback mechanizmusban nem játszik szerepet a szuperoxid anion, ellenben a purinerg receptorok gátlása a feedback mechanizmus szignifikáns csökkenéséhez vezet. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a MD sejtek a tubuláris folyadékáramlás változását is képesek érzékelni. A MD sejteknek ez a tulajdonsága kiegészíti a MD sejtek eddig ismert funkcióját (a tubuláris NaCl koncentráció érzékelését), és hozzájárul a TGF folyamatához. 2 INTRAGLOMERULARIS PRECAPILLARY SPHINCTER: A TGF ÚJ ELEME A tubuloglomerularis feedback egy homeostatikus szabályzó mechanizmus, amelynek a szerepe, hogy a disztális tubulus lumenében a NaCl tartalmat stabilizálja és ezáltal a NaCl kiválasztás mértékét szűk határok között tartsa. A szabályozás bemeneti jele a disztális tubulus lumenében a [NaCl]-nak a változása, amelyet a MD sejetek érzékelnek. A [NaCl] emelkedése az afferens arteriola átmérőjének csökkenését, és ennek következtében a filtrált NaCl tartalom csökkenését váltja ki. Előzetes eredmények arra utaltak, hogy az AA terminális, intraglomeruláris szakaszán bizonyos sejtek duzzadnak/összhúzódnak a TGF során. Ez a kontrakció az AA igen jelentős szűkületét, az ér majdnem teljes mértékű elzáródását ereményezte. A prekapilláris sphincterekhez hasonló funkció miatt ezt az érszakaszt intraglomerularis precapillaris sphincternek neveztük el. 2.1 Célkitűzések Tudományos vizsgálataink során az alábbi kérdésekre kerestük a válaszokat: 1. Lehet-e az intraglomerularis precapillaris sphinctert in vitro és in vivo azonosítani? 2. Melyek azok a sejttípusok, amelyek az intraglomerularis precapillaris sphinctert alkotják? 6

3. Mi az intraglomerularis precapillaris sphincter működésének molekuláris mechanizmusa? 4. Létezik-e az intraglomerularis precapillaris sphincterhez hasonló postglomerularis sphincter az efferens arteriola juxtaglomerularis részén? 2.2 Módszerek In vitro mikroperfundált afferent arteriola-jga-glomerulus New Zealand, nőstény nyulakból glomerulust, és a hozzá kapcsolódó afferens arteriolát, distalis tubulust izoláltunk. Az arteriolát Krebs-Ringer-HCO 3 oldattal (mm: 115 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0.96 NaH 2 PO 4, 0.24 Na 2 HPO 4, 1.2 MgSO 4, 1.2 CaCl 2, 5.5 D- glucose), 50 Hgmm perfúziós nyomással perfundáltuk. A tubulust izozmotikus, alacsony NaCl tartalmú oldattal perfunáltuk (mm): 10 NaCl, 135 N-methyl-D-glucamine (NMDG) cyclamate, 5 KCl, 1 MgSO 4, 1.6 Na 2 HPO 4, 0.4 NaH 2 PO 4, 1.5 CaCl 2, 5 D-glucose, and 10 N - 2-hydroxyethyl-piperazine-N' -2-ethanesulfonic acid (HEPES). TGF-et izozmotikus 80mM NaCl-ot tartalmazó tubuláris perfúziós folyadékkal stimuláltuk (NMDG cyclamat koncentrációja 65mM). Tubulus perfúziós rátája 10nl/min volt. A bath oldat Krebs-Ringer- HCO 3 volt. A képalkotáshoz Leica DM IRE2 ivertált mikroszkópot használtunk (Leica TCS SP2). In vivo képalkotás Munich-Wistar patkányok jobboldali veséjét altatásban (Inactin), dorsalis metszésen keresztül a felszínre emeltük. A vesék innervátióját, vasculáris kötegét épségben megőriztük. A jobb v. femoralist kanüláltuk, amelyen keresztül a fluoreszcens festékeket infundáltuk (quinacrine: renin specifikus fluoreszcens anyag; rhodamine-konjugált 70kDa MW dextran: intravasculáris teret, a serumot megfestő fluoreszcens anyag). Az altatott állatot egy invertált mikroszkóp (Leica SP2) fűtött tárgyasztalára helyeztük. Vizsgálatainkat Leica DM IRE2 mikroszkóp, és titánium-zafír lézer (Mai-Tai, Spectra-Physics) segítségével végeztük (Leica TCS SP2). Immunohisztokémia Sprague-Dawley patkányokat altatásban (Inactin) hideg, izotóniás sóoldattal perfundáltuk. A veséket paraformaldehid infuzóval in situ fixáltuk, majd kioperátuk, és a pólusokat összekötő síkra merőlegesen felszeleteltük. A szövetet paraffinba ágyaztuk, és 5- µm vastagságú metszeteket készítettünk. A metszeteket először alfa-simaizom aktin elleni monoklonális egér antitesttel inkubáltuk, majd mosást követően Alexa Fluor 594-gyel konjugált másodlagos egér elleni kecske antitesttel, quinacrine-nal és DAPI-val kezeltük. 7

Statiszika Eredményeinket átlag szandard hiba (SE) formájában közöljük. A csoportok összehasonlításánál páros t-tesztet, és varianciaanalízist alkalmaztunk. A nullhipotézist elvetettük, ha a hiba valószínűsége (p) 0,05 alatti érték volt. 2.3 Eredmények Izolált és in vitro mikroperfundált AA-glomerulus-JGA preparátumon vizsgáltuk a TGF mechanizmusát. Stimulust megelőzően az AA ármérője az ér extraglomeruláris szakaszán 10.4 0.5 µm, míg az intraglomerularis területen 5.1 ± 0.6 µm. TGF során az extraglomerularis AA belső átmérője 34.2 ± 8.0 %-kal csökkent. Míg az intraglomerularis érszakasz belső átmérője 69.3 ± 5.9 %-kal szűkült. A TGF során a renin pozitív AA terület nem vett tészt a vazokonstrikcióban. In vivo kísérleteinkben sikerrel azonosítottuk az intraglomerularis, prekapillaris sphinctert. Néhány kísérletben a sphincter összehúzódásának köszönhetően a glomerulus teljes elzáródása is megfigyelhető volt. Immunohisztokémiai vizsgálatink során erős alpha-simaizom jelölést találtunk az AA extraglomerularis szakaszán. Az efferens arteriola simaizomrétege ennél gyengébb jelölést mutatott, míg az intraglomerularis sphincer területén alpha-simaizom tartalmú sejteket nem lehetett azonosítani. Funkcionális kísérleteinkben furosemid alkalmazása a tubuláris perfundáló folyadékban teljesen meggátola a sphincter összehúzódását. A P2 purinerg receptorgátló suramin szintén blokkolta a sphincter működését, és kismértékű relaxációt is eredményezett. Az adenosin A1-es receptort gátló DCPCX nem volt hatással a sphincter működésére. 2.4 Következtetések Tudományos vizsgálataink során azonosítottuk a terminális AA egy olyan szakaszát, amely a TGF során akár teljes mértékben is képes lecsökkenteni a glomerulus véráramlását, hasonlóan a kapilláris sphincterek működéséhez. Ezek az eredmények korábbi megfigyeléseinkkel is összhangban igazolták, hogy a TGF során a legnagyobb érellenállásfokozódás a sphincter területén jön létre. A sphincter kialalkításában nem a renin pozitív, módosult simaizomsejtek, hanem az ér környezetében lévő mesangiális sejtek vesznek részt. A sphincter létezését in vitro és in vivo kísérleteink során is sikerült bizonyítani. A glomeruláris sphincter összehúzódásában ATP mint jelátvivő molekula fontos szerepet játszik, ezzel is erőssítve azt a nézetet, hogy az ATP önmagában is, és nem csak bomlástermékein keresztül vesz részt a TGF folyamatában. 8

3 CONNEXIN 30 KNOCKOUT EGEREKBEN CSÖKKENT A LUMINÁLIS ATP SZEKRÉCIÓ ÉS A PRESSURE NATRIURESIS Ismert, hogy a vese epithel sejtjei ATP-t szekretálnak, ami a nephron későbbi szakaszaiban purinerg receptorokhoz kötődve befolyásolja a só és vízvisszaszívás folyamatát. Viszont az ATP szekréció pontos mechanizmusa, az ATP csatornák léte vitatott. Korábbi eredmények bizonyították, hogy a mechanikai stimulus, mint pl. a tubuláris folyadékáramlás fokozódása képes ATP elválasztást kiváltani. Connexin 30 (Cx30) egy gap junction protein. Több Cx molekula képes működő hemichannel-eket formálni a sejtek apikális membránján, még mielőtt a szomszédos sejtek Cx molekulájával gap junctiont alkotna. A Cx csatornák nagy konduktivitású, mechanoszenzitív ion csatornák, amelyek képesek számos, akár komplex molekulákat is, pl. ATP-t a sejtmembránon átjuttatni. Korábbi munkánk során a Cx30 csatornát a gyűjtőcsatorna közti sejtekjeinek non-junctionális, apikalis membránján lokalizáltuk. Ez felvetette a lehetőségét, hogy ha a Cx hemichannel-ek képesek ATP-t átengendni, akkor lehet, hogy az ATP szekréció a Cx30-as hemichannel-eken keresztül történik a nephron disztális szakaszán. Jelen kísérleteink során a Cx30 fiziológiai szerepét kívántuk tanulmányozni a presurre natriuresis folyamatában. Mivel a pressure natriuresisben tubuláris folyadékáramlás növekedés is kialkul, és a Cx30-as csatornák mechanoszenzitívek, azt feltételeztük, hogy a Cx30-as hemichannel részt vesz a pressure natriuresis folyamatában, ezen keresztül a szervezet folyadékhomeosztázisának és a vérnyomásnak a szabályozásában. 3.1 Célkitűzések Tudományos vizsgálataink során az alábbi kérdésekre kerestük a válaszokat: 1. A Cx30-s gap junction proteint kifejező sejtek képesek-e ATP szekrécióra? 2. Részt vesz-e a Cx30 gap junction protein a pressure natriuresis folyamatában? 3. Milyen szerepet tölt be a vesekéreg gyűjtőcsatornája a pressure natiuresisben? 4. Befolyásolja-e a Cx30 hemichannel a szervezet ph homeosztázisát? 3.2 Módszerek Immunohisztokémia Kísérleteinkhez Cx30 WT és KO egereket használtunk. Az egereket altatásban (Inactin) hideg, izotóniás sóoldattal perfundáltuk. A veséket paraformaldehid infuzóval, in situ fixáltuk, majd kioperátuk, és a pólusokat összekötő síkra merőlegesen felszeleteltük. A szövetet paraffinba ágyaztuk, és a mintákból 5-µm vastagságú metszeteket készítettünk. A 9

metszeteket először Cx30 antitesttel inkubáltuk, majd mosást követően Alexa Fluor 594-gyel konjugált másodlagos egér elleni kecske antitesttel és DAPI-val kezeltük. ATP Bioszenzor technika Cx30 WT és KO egerek veséit altatásban (Inactin) kioperáltuk, és kézzel vesekéreg gyűjtőcsatornákat disszekáltunk. A gyűjtőcsatornák egyik végét felnyitottuk, ezáltal az epithelsejtek luminalis felszíne szabadon hozzáférhetővé vált. A szövetet 37 C-os, oxigenizált Krebs-Ringer oldatba helyztük. A gyűjtőcsatornákat mikropipettával kanüláltuk, és 2-20nl/min pefúziós rátával perfundáltuk az alábbi összetételű oldattal (mm): 25NaCl, 5 KCl, 1MgSO4, 1.6 NaHPO4, 0.4 NaH2PO4,5 D-glucose, 1.5 CaCl2, 110 NMDG-cyclamat, 10 HEPES. Kísérleteink egy részében a szövettartó edényben lévő oldat osmolalitását 300 mosmról 270-mosm-ra csökkentettük. A gyűjtőcsatorna közti sejtjeit (KS) Alexa Fluor 594 peanut lectin-nel, a fősejteket (FS) quinacrinnel jelöltük. PC12 sejteket, mint bioszenzor sejteket használtunk ATP detektálására. A sejteket Fluo-4, Fura Red fluoreszcens festékkel töltöttük, így az ATP hatására megemelkedő [Ca 2+ ]ic detekálhatóvá vált. PC12 sejtek egy kisebb csoportját a gyűjtőcsatorna kanülálása és perfundálása után mikropipettával a KS vagy a FS apikális membránjával direkt kontaktusba hoztunk. Az ATP elválasztást mechanikai ingerrel, a gyűjtőcsatorna perfúziós rátájának emelésével (2 20nl/min) értük el. Néhány kísérletben a bioszenzor sejteket előkezeltük a purinerg receptorblokkoló suraminnal. A gyűjtőcsatornákat minden egyes kísérlethez külön állatból izoláltuk. A méréseket Leica DM IRE2 mikroszkópon, és titánium-zafír lézer (Mai-Tai, Spectra-Physics) segítségével végeztük (Leica TCS SP2). Pressure-Natriuresis modell 10-13 hetes Cx30 WT (n=8) és KO (n=6) egereket Katamine és Inaktin kombinációjával elaltattunk. Kanuláltuk a baloldali a. carotis int.-t (vérnyomásmérés), és a jobboldali v. femoralist (infúzió). Az operációt 15 perces nyugalmi periódus követett. A kontrol fázis után, a kísérleti állat vérnyomását két lépésben emeltük: először az aorta abdominalis (disztálisan az a. renalis-hoz képest), majd a truncus coeliacus elkötésésvel. Minden egyes periódus végén vér- és vizeletmintát vettünk a Na + és K + koncentrációk meghatározására. A vérvételt követően a vérvétel mennyiségének megfelelő térfogatban, a kísérlet megkezdésekor frissen nyert dornor egér vérét pótoltuk. Az 1. ábra a kísérleti protokolt szemlélteti. 10

20 min 20 min 15 min 20 min B, U minta B, U minta B, U minta B, U minta hormon infúzió FITC-inulin bolus hormon + FITC-inulin infúzió operáció equilibrium kontrol BP emelés #1 BP emelés #2 Ábra 1. A pressure natriuresis in vivo kísérlet modellje. Az operációt 15 perces nyugalmi periódus követte. Méréseket 3, egyenként 20 perces szakaszban végeztem: kontrol, 1. vérnyomásemelés (hasi aorta elkötése), 2. vérnyomásemelés (truncus coeliacus elkötése). V: vér-, U: vizeletminta gyűjtés, BP: vérnyomás. A v. femoralis kanülálását követően a kísérleti állat a mérés végéig albumin és hormintartalmú (noradrenalin, vasopresszin, hidrocortison, aldoszteron) infúziót kapott. Mértem a hematokritot, a szérum és a vizelet Na +, K + tartalmát (FLM 3 lángfotométer); a plasma Cl -, HCO 3 koncentrációját (Univ. Of South. California Klinikai Labor), aldoszteron (ELISA kit) és vasopresszin (EIA kit) szintet. A GFR-t FITC-inulinos módszer segítségével kalkuláltam (Photon Technology International, PTI küvetta alapú rendszer). Magas sótartalmú diéta Cx30 WT és KO egereket normál és magas sótartalmú diétán tartottunk 2 héten keresztül. Az állatok egy csoportja szelektív ENaC gátló benzamilt kapott a diétás kezelés 2. hetében. Az egerek vérnyomását altatásban (Ketamin+Inaktin), az a. carotis int.-n keresztül határoztuk meg. Vese iontranszporterek Western Blot analízise Cx30 WT és KO egerek veséjének kéregállományát elválasztottuk, és homogenizáltuk. A fehérjéket 4-20%-os SDS-PAGE-en szeparáltuk, és polyvinylidene difluoride membránra transzferáltuk. Ezt követően a mintát a vese iontranszporterek (ENaC, NaKCC2, NHE3 és 11

NCC; aktin) elleni antitestekkel inkubáltuk. A blot mosása után a mintát vagy kecske egér elleni antitesttel vagy kecsle nyúl elleni antitesttel kezeltük. RT-PCR Totál RNS-t Cx30 +/+ és Cx30 -/- egerek veséiből nyertük ki. Az RNS-t spectrofotométerrel kvantifikáltuk, avian reverz transzkriptázzal és random hexamerekkel egyszálú cdns-t készítettünk. cdns-t Taq polimerázzal amplifikáltuk. A Cx és ATP receptorok primereinek szekvenciáját és a band-ek méreteit korábban meghatározták. A PCR terméket 2%-os agaróz gélen analizáltuk. Statisztikai módszerek Eredményeinket átlag standard hiba (SE) formájában közöljük. A csoportok összehasonlításánál variancia analízist (ANOVA), és Bonferroni tesztet használtunk. A nullhipotézist elvetettük, ha a hiba valószínűsége (p) 0,05 alatti érték volt. 3.3 Eredmények Cx30 immunohisztokémia Egér veséjének immunohisztokémiai vizsgálata során Cx30 jelölést a gyűjtőcsatorna közti sejtjeinek apikális felszínén találtunk. Luminális ATP szekréció mérés A gyűjtőcsatorna perfúziós rátáját 2-ről 20nl/min-re emelve szignifikáns [Ca 2+ ]ic emelkedést tapasztaltunk, amikor a bioszenzor sejt a KS apikális membránjához volt pozicionálva. A bioszenzor sejteket a FS apikális membránjához érintve szignifikáncan alacsonyabb [Ca 2+ ]ic emelkedést regisztráltunk. A bioszenzor sejtek purinerg receptorgátlóval történt előkezelése teljesen megszüntette a folyadékáramlás mértékének növelése révén kiváltott [Ca 2+ ]ic emelkedést. Cx -/- szövetben végzett mérések alkalmával az áramlásnövekedéssel kiváltható [Ca 2+ ]ic emelkedés elhanyagolható volt. Amikor a bioszenzor sejtek nem kerültek direkt kontaktusba a KS vagy a FS-kel, [Ca 2+ ]ic emelkedés nem volt tapasztalható. A folyadékáramlás emeléséhez hasonlóan, amikor a bath ozmolalitása 270mosm-ra csökkentettük (interstitium-lumen osmotikus gradiens) jelentős [Ca 2+ ]ic emelkedést mértünk. Pressure Natriuresis in vivo kísérlet Cx 30 egérben WT és Cx30 KO egereket pressure natriuresis kísérlethez beoperáltuk. A konrol vérnyomás (115.0 4.5 Hgmm) az abduminális aorta elkötésével 131.0 4.1 Hgmm-re, míg a truncus coeliacus elkötése után 151 4.8 Hgmm-re emelkedett. Cx30 +/+ és Cx30 -/- állatok között nem volt vérnyomáskülönbség egyik kísérleti periódusban sem. A perfúzós nyomás emelkedésével párhuzamosan a WT és KO egerek diuresise is növekedett. Viszont az 12

emelkedés mértéke szignifikánsan kisebb volt a KO egerekben. Ugyanígy a nyomás-diurézis is kevésbé emelekedett a KO egerekben. A nyomás-kaliurézisben nem volt különbség a WT és KO egerek között. GFR és a hematokrit szignifikánsan nem tért el a Cx +/+ és Cx30 -/- egerek között egy kísérleti periódusban sem. Gyűjtőcsatorna specificitás Mivel normál körülmények között nem volt különbség a Cx30 WT és KO egerek között, ezért 2 hetes magas sótartalmú diétán tartottuk az állatokat. WT egerekben a vérnyomás nem változott (75.0 1.7 Hgmm), míg a KO egerek vérnyomása szignifikánsan megemelkedett (103.0 2.4 Hgmm). A gyújtőcsatorna specifikus epithelialis Na csatorna (EnaC) gátló benzamil nem változtatta meg a WT egerek vérnyomását, míg a KO egerek vérnyomását a normál érték közelébe állította vissza. Vese iontranszpotereinek, és az ENaC expressziója Cx30 egerekben Különbőző vese iontransporterek (NaHE3, NKCC2, NCC, ENaC) expresszióját vizsgáltuk Cx30 +/+ és Cx30 -/- egerekben. A vizsgált iontranszporterek egyenlő mértékben fejeződtek ki a WT és KO állatokban, kivételt a NCC csökkent expessziója jelentett Cx30 -/- állatokban. Cx és purinerg receptor expresszió Cx30 -/- egerekben A Cx ioncsatornák közül a Cx30, Cx30.3, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45 expresszióját hasonlítottuk össze RT-PCR segítségével. A Cx30 kivételével az összes vizsgált Cx csatorna egyenlő mértékben fejeződik ki a Cx WT és KO egerekben. Hasolnóléppen a purinerg receptorok különös tekintettel a P2Y2 receptor típus is egyelő mértékben expresszálódnak Cx30 +/+ és Cx30 -/- állatokban. Egyéb szisztémás és veseparaméterek Cx30 állatokban A kísérleteink során használt állatok azonos korúak és testsúlyúak voltak. A plasma elekrolit- (Na + és K + ) és hormon szintek (aldoszteron, vasopresszin) nem mutattak statisztikailag szignifikáns különbséget Cx30 WT és KO állat között. Tekintettel arra, hogy a Cx30 hemichannel a KS apikális felszínén expresszálódik a plazma ph, plazma [Cl - ] és [HCO - 3 ] értékeket is összehasonlítottuk. Az utóbbi paraméterek sem mutattak szignifikáns eltérést a Cx30 +/+ és Cx30 -/- állatok között. 3.4 Következtetések Kísérleteink során a Cx30 hemichannel-eket a gyűjtőcsatorna közti sejtjeinek apikális membránjában lokalizáltuk. In vitro és in vivo eredményeinkkel igazoltuk, hogy mechanikai stimulus hatására a Cx30-as hemichannelek kinyílnak. A közti sejtek Cx30-as csatornán keresztül képesek ATP-t elválasztani a tubulus lumenébe. Az elválasztott ATP fontos szerepet 13

tölt be a szomszédos fősejt epithelialis Na csatornájának szabályozásában, a pressure natriurezis folyamatában, amiken keresztül befolyásolja a szervezet folyadékháztartását és a vérnyomást. 14

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Disszertációhoz kapcsolódó közlemények 1. Sipos A, Vargas SL, Toma I, Hanner F, Willecke K, Peti-Peterdi J. Connexin 30 deficiency impairs renal tubular ATP release and pressure natriuresis. J Am Soc Nephrol 20: 1724-32, 2009. (PMID: 19478095) IF: 7.111. 2. Sipos A, Toma I, Kang JJ, Rosivall L, Peti-Peterdi J. Advances in renal (patho)physiology using multiphoton microscopy. Kidney Int 72:1188-91, 2007. (PMID: 17667980), IF: 4.922. 3. Kang JJ, Toma I, Sipos A, McCulloch F, Peti-Peterdi J. Imaging the renin-angiotensin system: An important target of anti-hypertensive therapy. Adv Drug Deliv Rev 58:824-33, 2006. (PMID: 16979787) IF: 7.977. 4. Rosivall L, Mirzahosseini S, Toma I, Sipos A, Peti-Peterdi J. Fluid flow in the juxtaglomerular interstitium visualized in vivo. Am J Physiol Renal Physiol 291:F1241-7, 2006. (PMID: 16868308) IF: 4.199. 5. Kang JJ, Toma I, Sipos A, McCulloch F, Peti-Peterdi J. Quantitative imaging of basic functions in renal (patho)physiology. Am J Physiol Renal Physiol 291:F495-502, 2006. (PMID: 16609147) IF: 4.199. 15

A disszertáció témájához szorosan nem kapcspolódó közlemények 1. Wilkinson L, Gilbert T, Sipos A, Toma I, Pennisi D, Peti-Peterdi J, Little M. Loss of renal microvascular integrity in postnatal Crim1 hypomorphic transgenetic mice. Kidney Int. 2009, Doi: 10.1038/ki.2009.345. IF: 6.418. 2. Peti-Peterdi J, Toma I, Sipos A, Vargas SL. Multiphoton Imaging of Renal Regulatory Mechanisms. Physiology 24:88-96, 2009. IF: 6.954. 3. Toma I, Kang JJ, Sipos A, Vargas S, Bansal E, Hanner F, Meer E, Peti-Peterdi J. Succinate receptor GPR91 provides a direct link between high glucose levels and renin release in murine and rabbit kidney. J Clin Invest. 118:2526-34, 2008. (PMID: 18535668) IF: 16.915. 4. Hanner F, von Maltzahn J, Maxeiner S, Toma I, Sipos A, Krüger O, Willecke K, Peti- Peterdi J. Connexin45 is expressed in the juxtaglomerular apparatus and is involved in the regulation of renin secretion and blood pressure. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 295:R371-80, 2008. (PMID: 18579650) IF: 3.661. 5. Kang JJ, Toma I, Sipos A, Meer EJ, Vargas SL, Peti-Peterdi J. The collecting duct is the major source of prorenin in diabetes. Hypertension. 51:1597-604, 2008. (PMID: 18413493) IF: 7.194. 6. Salmon AH, Toma I, Sipos A, Muston PR, Harper SJ, Bates DO, Neal CR, Peti- Peterdi J. Evidence for restriction of fluid and solute movement across the glomerular capillary wall by the subpodocyte space. Am J Physiol Renal Physio. 293:F1777-86, 2007. (PMID: 17804486) IF: 4.416. 16

Címlapképek: 1. Kidney International, Nature publishing group, 72 (10) November, 2007 from publication Sipos A, Toma I, Kang JJ, Rosivall L, Peti-Peterdi J. Advances in renal (patho)physiology using multiphoton microscopy. Kidney Int 72:1188-91, 2007. (PMID: 17667980) IF: 4.922 2. Hypertension, 51 (6) June, 2008 from publication Kang JJ, Toma I, Sipos A, Meer EJ, Vargas SL, Peti-Peterdi J. The collecting duct is the major source of prorenin in diabetes. Hypertension. 51:1597-604, 2008. (PMID: 18413493) IF: 7.194 3. Advanced Drug Delivery Reviews 58 (7) September, 2006 from publication Kang JJ, Toma I, Sipos A, McCulloch F, Peti-Peterdi J. Imaging the renin-angiotensin system: An important target of anti-hypertensive therapy. Adv Drug Deliv Rev 58:824-33, 2006. (PMID: 16979787) IF: 7.977 Könyvfejezet 1. Kang JJ, Toma I, Sipos A, Peti-Peterdi J. From in vitro to in vivo: imaging from the single cell to the whole organism. Curr Protoc Cytom. Edited by JP Robinson, Z Darzynkiewicz, R Hoffman, JP Nolan, A Orfao, PS Rabinovitch, S Watkins, T Downey; John Wiley & Sons Inc. 44: 12.12.1-12.12.26, 2008. (PMID: 18770644) 17

Idézhető absztraktok 1. Svenningsen P, Sipos A, Peti-PeterdiJ ATP releasing Connexin 30 hemichannels mediate flow-induced calcium signaling in the collecting duct JASN 2009. 2. Hanner F, Sipos A, Vargas S, Toma I, Peti-Peterdi J. Expression of pannexin 1 hemichannels in renal tubules Gap Junction Conference, 2009. 3. Sipos A, Vargas SL, Peti-Peterdi J. Connexin 30 knockout mice develop salt sensitivity JASN (19): 159A, 2008. 4. Sipos A, Toma I, Vargas SL, Peti-Peterdi J. Direct demonstration of tubular fluid flow sensing by macula densa cells FASEB Journal 22:761.28, 2008. 5. Hanner FP, Toma I, Sipos A, Vargas S, Peti-Peterdi J. Localization and function of connexin 45 in the renal cortical vasculature FASEB Journal 22:761.9, 2008. 6. Sipos A, Toma I, Vargas SL, McCulloch F, Peti-Peterdi J. Impaired luminal ATP release and pressure natriuresis in connexin 30 knockout mice FASEB Summer conference 2007. 7. Toma I, Kang JJ, Bansal E, Sipos A, McCulloch F, Peti-Peterdi J. GPR91 triggers paracrine signaling in the JGA FASEB Journal 21:595.4, 2007. 8. Kang JJ, Toma I, Sipos A, Bansal E, Peti-Peterdi J. Uric acid triggers renin release and causes glomerular hyperfiltration FASEB Journal 21:595.22, 2007. 9. McCullock F, Toma I, Sipos A, Peti-Peterdi J. Localization of connexin 45 in the kidney FASEB Journal 21:937.29, 2007. 10. Sipos A, McCulloch F, Toma I, Peti-Peterdi J. Impaired renal Na + and water reabsorption and K + secretion in mice lacking connexin 30 JASN (17): 472A, 2006. 11. Toma I, Sipos A, McCulloch F, Peti-Peterdi J. In vivo imaging of the kidney in early diabetes FASEB Journal 20:A1170, 2006. 12. Ambrus B, Hably Cs, Vág J, Kerémi B, Csillag M, Sipos A, Bartha J. The role of nitric oxide, 1-adrenergic and AT1 receptors in the regulation of blood flow of adrenal gland. Acta Physiologica Hungarica (89): 61, 2002. 13. Hably Cs, Vág J, Kerémi B, Csillag M, Ambrus B, Sipos A, Bartha J. AT1 but not 1- receptor blockade increases the nitric oxide synthesis in working and resting skeletal muscle. Acta Physiologica Hungarica (89): 62, 2002. 18

14. Kerémi B, Vág J, Csillag M, Hably Cs, Sipos A, Ambrus B, Bartha J, Fazekas Á. Candesartan treatment increases the vasoconstrictor effect of L-NAME in rat submandibular gland. Acta Physiologica Hungarica (89): 95, 2002. 15. Sipos A, Hably Cs, Vág J, Kerémi B, Csillag M, Ambrus B, Bartha J. Role of AT1 receptors in the L-NAME evoked hypertension and renal vasoconstriction: effect of dietary salt. Acta Physiologica Hungarica 89 (1-3) i-xii, 60, 2002. 16. Sipos A, Kiss I, Hably Cs, Vág J, Bartha J. Extracellular space, sodium and water turnover in rats: effect of NOS inhibition and dietary salt. Nephrol Dial Transplant 16(6):A4, 2001. 19