Ph.D. Tézisek SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA 2. sz. Doktori Iskola (Klinikai Orvostudományok) Mitokondriális és intracelluláris biokémiai sejtparaméterek jelentosége szisztémás lupus erythematosusban Dr. Gergely Péter A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu program Doktori Iskola vezetoje: Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár Programvezeto: Dr. Szendroi Miklós, egyetemi tanár Témavezeto: Dr. Poór Gyula, egyetemi magántanár 2003
ÖSSZEFOGLALÁS Szisztémás lupus erythematosusos (SLE) betegekben a perifériás vér limfocitákra fokozott spontán és csökkent aktiváció-indukálta apoptózis jellemzo. Jelen doktori munka során azt a feltételezést vizsgáltam, vajon az alábbi kulcsfontosságú biokémiai paraméterek döntoen befolyásolják-e a kóros jelátviteli folyamatokat SLE-ben. E paraméterek, a mitokondriális transzmembrán potenciál (?? m ), reaktív oxigén intermedierek (ROI), intracelluláris ph (phi), az ATP és glutation szint apoptózisban betöltött jelenoségét mostanában ismertük meg.?? m, ROI és phi értékeket magasabbnak találtam SLE-s limfocitákban az egészséges donorokhoz és rheumatoid arthritises betegekhez képest. Az intracelluláris glutation alacsonyabb volt, utalva a redukáló ekvivalensek fokozott felhasználására. H 2 O 2, egy ROI pre kurzor adására a kontrollokban átmeneti?? m emelkedés, majd apoptózis jött létre, míg SLE-ben, foként a T sejtekben a hiperpolarizáció elmaradt, és apoptózis helyett inkább nekrózist észleltünk. A sejtek ATP tartalma és ATP/ADP aránya, melyeket a sejthalál formáját meghatározó tényezokként ismerünk, SLE-ben csökkent volt és a?? m emelkedéssel volt arányos. A kontroll sejtekben mindezt CD3/CD28 kezeléssel modelleztük, melynek során átmeneti hiperpolarizáció, majd ATP depléció, ezt követoen a sejtek fokozott H 2 O 2 -indukálta nekrózisa jött létre. Az F o F 1 -ATP-ázgátló oligomicin szintén hasonló hatású volt. CD3/CD28-indukálta T sejt aktiváció során SLE-ben kisebb mérvu?? m, ph és ROI emelkedést találtunk. Az SLE patogenezisésben jelentosnek tartott IL-10 egészséges limfocitákban átmeneti hiperpolarizációt okozott, de sejthalált nem, SLE-ben viszont ROI termelést és apoptózist idézett elo, nem befolyásolva a?? m értékét. IL-10- ellenes neutralizáló antitest vagy antagonista IL-12 kezelés a stimulálatlan és 1
CD3/CD28-indukált ROI és phi változásokat normalizálta az SLE-s sejtekben, de a?? m értékét nem korrigálta. Doktori munkám alapján elmondható, hogy az emelkedett?? m, ROI szint és ph, az ATP depléció és a megváltozott IL-10 érzékenység fontos szerepet játszanak a lupusos sejtek kóros apoptózisában és T sejt aktivációjában. Ezen adatok nemcsak a betegség patogenezisének megismeréséhez járulhatnak hozzá, de újabb terápiás beavatkozásokra is lehetoséget biztosíthatnak. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK A szisztémás lupus erythematosus (SLE) akut és krónikus szakaszokkal váltakozó, a szervezet egészét, foként (bár nem kizárólagosan) a szüloképes korú noket érinto autoimmun betegség. Társadalmi és tudományos jelentoségét növeli, hogy incidenciája viszonylag gyakori (1:10 000), és sem etiológiája, illetve kialakulásának pontos mechanizmusa, sem a gyógyítása nem ismert, bár megfelelo kezelés mellett hosszú tünetmentes periódusok érhetok el. Az SLE patofiziológiájában genetikai, exogén, humorális és celluláris tényezoknek tulajdonítanak dönto szerepet? jelen doktori értekezés célja ez utóbbiak, a sejtes defektusok közelebbi vizsgálata. Az SLE-ban zajló sejtszintu patológiás történések központi eleme a T limfociták funkciózavara, mely azután elégtelen B sejt klón szuppressziót és fokozott autoantitest termelést eredményez. Mindez a normálistól jelentosen eltéro citokin milioben megy végbe, mely a kóros autoimmunitás oka és következménye egyaránt lehet. A lupusos celluláris abnormalitásokban a nem kelloen szabályozott apoptózisnak lényeges szerepe van. Az apoptózis a programozott sejthalál fiziológiás folyamata, mely során a szervezet a nemkívánatos sejtektol, így többek között a potenciálisan autoreaktív limfocitáktól, a felesleges B és T sejtektol is megszabadul. Az SLE-s limfociták programozott sejthalála paradox: 2
fokozott spontán és csökkent további (pl. T sejt) aktiváció -indukálta apoptózis észlelheto. A reaktív oxigéngyökök vagy intermedierek (ROI) a klasszikus elképzelés szerint az aerob sejtmuködés toxikus melléktermékei. Ezek ellen többféle biokémiai mechanizmussal is védekezik a sejt, ezek egyik legfontosabb eleme a a redukált és oxidált glutation rendszere. Újabban egyre több adat szól amellett, hogy kontrollált gyöktermelés számos fiziológiás sejtfunkcióhoz, így az apoptózishoz és a T sejt aktivációhoz is szükséges. A gyöktermelés számos transzkripciós faktor aktivitását szintén befolyásolja, és így szerepet játszhat az SLE-ben észlelt citokin abnormalitásokban is. A mitokondriális transzmembrán potenciál (?? m ) és intracelluláris ph állandó értéken tartása elengedhetetlen a sejt homeosztázisában? ebben kiemelt szerephez jut a mitokondriumok energia (ATP) -szintetizáló vagy bontó funkcióját végzo enzimkomplex, az F o F 1 -ATP-áz. A potenciálkülönbség jelentos csökkenése vagy megszunése a mitokondriumok funkcióvesztéséhez kapcsolható? így a programozott sejthalál során bekövetkezo?? m csökkenés (megszunés) és acidifikálódás mérésével a folyamat irreverzibilis fázisa detektálható. Ugyanakkor a legújabb adatok szerint az apoptózis korai szakában egy átmeneti, de szignifikáns?? m emelkedés (mitokondriális hiperpolarizáció) tapasztalható, melyet többféle apoptózis induktor, így hidrogén peroxid-okozta oxidatív stressz során is leírtak. A korai ph átmeneti emelkedése (alkalizáció) szintén egy újonnan megismert jelenség, a T sejt aktiváció során bekövetkezo alkalizáció régebb óta ismert. Vajon mi a patomechanizmusa az SLE-s limfocitákra jellemzo fokozott spontán, ugyanakkor további stimuláció, így T sejt aktiváció által okozott csökkent apoptózisnak? E doktori értekezésben az elobbi, alapveto fontosságú biokémiai paraméterek vizsgálatával, ill. a T sejt aktiváció, oxidatív stressz indukálta apoptózis és bizonyos citokinek hatására bekövetkezo 3
változások tanulmányozásával próbálom meg tisztázni a fenti kérdést, kísérletet téve a celluláris defektusok normalizálásra is. Az SLE-ben tapasztalható kóros celluláris folyamatok megismerése nemcsak a betegség patogenezisének pontosabb megértését könnyítheti meg, de az autoimmunitás alapkutatásának kulcskérdéseinek tisztázásában is segíthet, és esetleg hozzájárulhat a betegség gyógyítása érdekében végzett kutatásokhoz is. Az SLE-s limfociták apoptózisáról, a sejtaktiváció mechanizmusáról nagymennyiségu irodalmi adat áll rendelkezésre, mégis az adatok sokszor ellentmondóak és hiányosak, így az elobbiekben felsorolt számos, újonnan megismert jelentoségu sejtparaméter és az SLE kapcsolatára vonatkozóan ezidáig alig találtam közléseket. A betegség patogenezisét és a sejtes abnormalitások mibenlétét vizsgálandó, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Van-e eltérés?? m, ROI-k, glutation és intracelluláris ph alapszintekben SLE-s betegekbol szeparált (kezeletlen) limfocitákban rheumatoid arthritises és egészséges limfocitákhoz viszonyítva in vitro? 2. Hogyan jellemezhetok az oxidatív stressz, ill. T sejt aktiváció során létrejövo változások SLE-s, RA -s, ill. egészséges limfocitákban, különös tekintettel a sejthalálra és a fenti sejtfiziológiai/biokémiai paraméterekre? 3. Mi a jelentosége a mitokondriumok és az egész sejt homeosztázisában lényeges szereppel bíró F o F 1 -ATP-áznak és a sejtek ATP szintjének a lupusos celluláris abnormalitásokban? 4. Van-e szerepe az SLE patogenezisében lényegesnek tartott citokineknek a vizsgált biokémiai/sejtfiziológiai paraméterek befolyásolásában? 5. Milyen patomechanizmusok valószínusíthetok az SLE-s limfocitákra jellemzo celluláris defektusok mögött? 6. Van-e lehetoség az in vitro észlelt és modellezett kóros sejtparaméterek kísérletes normalizálására SLE-ben? 4
MÓDSZEREK 1. Beteganyag A vizsgálatokat 25 SLE-ben és 10 rheumatoid arthritisben szenvedo betegen végeztük. Kontrollként 25 egészséges, nemben és korban az SLE-s betegekhez illesztett személyt vontunk be. Egyéb olyan fennálló betegség, mely a vizsgálatok eredményét vélhetoen befolyásolhatta (diabetes mellitus, rosszindulatú daganat, fertozés, hematológiai betegségek) kizáró oknak minosült. Az SLE-s betegek aktivitását az SLE Betegségaktivitási Index-szel (SLEDAI) határoztuk meg. 2. Sejtkultúra és az egyes kezelések leírása Heparinizált perifériás vérbol mononukleáris sejteket izoláltunk Ficoll- Hypaque gradiens technikát alkalmazva, a limfocitákat a monociták eltávolítása révén nyertük. Oxidatív stressz vizsgálatánál a sejteket különbözo ideig inkubáltuk 50?M H 2 O 2 jelenlétében vagy anélkül. A T sejt aktiváció tanulmányozására OKT3 monoklonális antitestet és CD28 kostimulációt alkalmaztunk. Az F o F 1 -ATP-áz komplex aktivitásának szelekt ív gátlására a sejteket 30 percig elokezeltük 2,5?M oligomicinnel. A sejtek különbözo ideju in vitro citokin kezelésénél az alábbi citokineket alkalmaztuk: IL-2 (50-500 U/ml), IL-3 (10-100 ng/ml), IL-4 (10-100 ng/ml), IL-6 (5-50 ng/ml), IL-7 (5-50 ng/ml), IL-10 (10-100 ng/ml), IL-12 (5-50 ng/ml), IL-15 (50-500 ng/ml), TNF-? (20 ng/ml), TGF-? 1 (5-50 ng/ml) és IFN-? (500 U/ml). A kecskébol származó, poliklonális anti-humán IL-10-ellenes neutralizáló antitestet 25?g/ml-es koncentrációban alkalmaztuk. 5
3. Áramlásos citometria és fluoreszcens mikroszkópia 3.1. Sejthalál vizsgálata A tripánkék festéssel történt festés és sejtmorfológiai vizsgálat mellett a sejthalál további megítélésére a limfocitákat fluoreszcens indikátorral konjugált annexin V-tel, ill. propidium-jodiddal (PI) festettük, majd áramlásos citometriát és fluoreszcens mikroszkópiát alkalmaztunk. A nekrózis meghatározása PI festéssel történt, a sejtek morfológiai változásának megfigyelése mellett. 3.2.?? m és reaktív oxigéngyök termelés mérése A gyöktermelés mérésére oxidáció-szenzitív fluorokróm festékeket (DHR, HE és DCF) használtunk. A?? m meghatározását DiOC 6, JC-1, TMRM és CMXRos festések segítségével végeztük. 3.3. Limfocita szubpopulációk vizsgálata A?? m, ROI, sejthalál változásait az egyes limfocita szubpopulációkban FITC- v. Cy5-konjugált monoklonális antitestekkkel való festés után áramlásos citometriával követtük nyomon. 3.4. Intracelluláris ph mérése A sejtek ph-ját is áramlásos citometriával határoztuk meg SNARF-1 indikátor segítségével. 4. Glutation meghatározás A sejtek teljes glutation-tartalmát Tietze enzimatikus módszerével mértük, a GSH és GSSG tartalmat reverz-fázisú ioncserélo magas nyomású folyékony kromatográfiás (HPLC) módszerrel határoztuk meg. 5. Intracelluláris ATP mérés A sejtek ATP tartalmát a luciferin-luciferáz lumineszcencián alapuló módszerrrel mértük. Az ATP/ADP arány és ADP szint meghatározása ApoGlow kittel történt 6
6. IL-10 termelés vizsgálata Az limfociták IL-10 termelését 5 napos in vitro tenyésztés után mértük a sejtek centrifugálása után kapott felülúszóból ELISA kit segítségével. 7. Statisztikai analízis A normál eloszlást mutató változókat Student-féle t-próbával vizsgáltuk meg, hasonló eloszlást mutató értékek közötti kapcsolat számszerusítésére a Pearson-féle korrelációs koefficienst használtuk. Nem Gauss-i eloszlás esetén non-parametrikus Mann-Whitney tesztet alkalmaztunk, a nem normál eloszlást mutató változók kö zötti összefüggést pedig Spearman-féle korrelációs analízissel számítottuk. Az észlelt különbségeket, változásokat vagy korrelációt akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha p? 0,05. A statisztikai számításokhoz a GraphPad Prism 3.02 programot használtuk. EREDMÉNYEK 1. Sejtfiziológiai paraméterek vizsgálata stimulálatlan limfocitákban 1.1. Gyorsult apoptózis, mitokondriális hiperpolarizáció és fokozott reaktív oxigéngyök termelés az SLE-s (elsosorban T) limfocitákban Az apoptózis mértékét fokozottnak találtuk mind az RA-sokhoz, mind az egészségesekhez viszonyítva. A SLEDAI értékkel mért aktív (> 10) stádiumban lévo SLE-s betegek apoptózisa szignifikánsan magasabb volt az inaktívakénál, míg a gyógyszeres kezelés nem volt hatással a sejthalálra. Nyugalmi helyzetben emelkedett mitokondriális transzmembrán potenciált (azaz nyugalmi hiperpolarizációt) és fokozott reaktív oxigéngyök termelodést tapasztaltunk SLE-s betegekbol származó limfocitákban az egészséges kontrollokhoz vagy RA-s betegekhez képest, függetlenül az SLE 7
aktivitásával, kortikoszteroid vagy immunszuppresszív kezeléssel. Az SLE-seket érinto hiperpolarizáció elsosorban a T sejtekben jött létre. 1.2. Csökkent redukált glutation(gsh)-szint SLE-s limfocitákban A GSH értéke SLE-ben szignifikánsan alacsonyabb volt a kontrollokhoz képest, a GSSG-tartalomban nem volt különbség. 1.3. Intracelluláris alkalizáció SLE-s limfocitákban Az SLE-s betegekbol származó sejtek intracelluláris ph-ját magasabbnak találtuk, mint az egészséges vagy RA-s donorokét. 2. Oxidatív stressz hatására bekövetkezo változások vizsgálata 2.1. Limfociták H 2 O 2 -mediálta sejthalála SLE-ben eltéro 16 órás 50?M H 2 O 2 expozíció után a fénymikroszkópos kép alapján a lupusos limfocitáknak az egészségesekhez képest nagyobb hányada mutatta nekrózis morfológiai jeleit, a sejttörmelék aránya szintén nagyobb volt SLE-ben. H 2 O 2 -kezelés hatására az apoptotikus sejtek arányának növekedése szignifikánsan kisebb mértéku volt SLE-ben, különösen a lupusos T sejtekben, mint a kontrollokban. A H 2 O 2 -kezelés ugyanakkor a nekrózis arányának nagyobb arányú növekedését eredményezte a lupusos sejtekben, mint az egészséges donorokéban. Az RA-s betegek limfocitáinak nekrózisa hasonló volt a kontrollokéhoz. 2.2. Csökkent ROI termelés és mitokondrialis hiperpolarizáció elmaradása H 2 O 2 -kezelés hatására SLE-ben A gyöktermelés és az ezt követo apoptózis mértéke között szignifikáns korrelációt találtunk mind a kontroll, mind az SLE-s sejtekben. Az oxidatív stresszre kisebb mérvu apoptózist mutató lupusos limfociták radikáltermelése is kisebb mértéku volt, mint a kontrolloké. Szemben az egészségesekével, a lupusos limfociták mitokondriális potenciálja további emelkedést nem mutatott. A 16 órás H 2 O 2 -kezelés után mind a kontroll, mind az SLE-s limfociták?? m -ja 8
jóval a kiindulási érték alá csökkent a mitokondriális dezintegrációnak megfeleloen. 3. Az intracelluláris ATP -szint, F o F 1 -ATP -áz és T sejt aktiváció vizsgálata 3.1 Csökkent intracelluláris ATP szint SLE-ben Az, hogy a sejtet éro apoptotikus ingerre, így hidrogén-peroxidra programozott sejthalál vagy nekrózis következik-e be, újabb adatok alapján a sejt ATP szintjétol függ. Az SLE-s betegekbol származó sejtek ATP tartalmát alacsonyabbnak találtuk, mint az egészséges kontrollokét, az RA-s betegeké nem különbözött a kontrollokétól. Az ADP értéke nem különbözött az egyes csoportokban, így az ATP/ADP arány szintén az SLE-s sejtekben volt alacsonyabb. A lupusos sejtekben észlelt intracelluláris csökkent ATP koncentráció független volt a betegség aktivitásától, ill. a gyógyszeres kezeléstol, ugyanakkor fordított arányosságban állt a mitokondriális transzmembrán potenciált tükrözo relatív fluoreszcencia értékekkel. 3.2. Oligomicin-indukálta változások kontroll limfocitákon Az F o F 1 -ATP-áz komplexet szelektíven gátló oligomicin elokezelés hatására intracelluláris ATP szint csökkenést és?? m emelkedést mértünk, mintegy modellezve a lupusos limfocitákban tapasztalt jelenségeket. 3.3. CD3/CD28-indukálta változások kontroll limfocitákon Eddigi adataink alapján felmerül, hogy az észlelt változások az SLEben zajló kóros T sejt aktiváció eredményeképpen jönnek létre. CD3/CD28 stimuláció hatására átmeneti mitokondriális hiperpolarizációt észleltünk, az intracelluláris ATP szintje is csökkent, és 4 óra után tért vissza a kiindulási szintre. A ROI-k termelése folyamatos növekedést mutatott. A ph korai emelkedés után 72 óra után tért vissza a kiindulási értékre az egészséges sejteken. 9
A CD3/CD28-cal vagy oligomicinnel elokezelt kontroll limfociták H 2 O 2 adásra további?? m emelkedést már nem mutattak és mindkét elokezelés után a H 2 O 2 a sejtek fokozott nekrózisát eredményezte. A T sejt aktiváció és az F o F 1 -ATP-áz komplex blokkolása tehát a lupusos sejtekhez hasonló viselkedést váltott ki az egészséges limfocitákban. 3.4. CD3/CD28-indukálta változások SLE-s limfocitákon A kontrollokban tapasztalt?? m -t és ROI terme lés mértékét tükrözo relatív fluoreszcencia értékekhez képest kisebb emelkedést észleltünk az SLE-s limfocitákban, az RA-s betegekbol származó sejtekben mért értékek az egészségesekéhez voltak hasonlóak. Az intracelluláris alkalizáció foka szintén alacsonyabb volt SLE-ben, mint a kontrollokban vagy az RA-s betegekben. 4. Citokinek szerepe az SLE-s limfocitákban tapasztalt rendellenességekben 4.1. Különbözo citokinek hatása a mitokondriális potenciálra Az IL-3, IL-10, TGF-? 1, és IFN-? különbözo mértéku, de szignifikáns?? m -emelkedést okozott. Az utóbbi két citokin szintje inkább csökkent SLEben, IL-3 és a lupus kapcsolatát alátámasztó meggyozo adat nem áll rendelkezésre. Az emelkedett IL-10 szint azonban lényegesnek tunik az SLE patogenezisében. 4.2. Az IL-10 központi jelentosége SLE-ben SLE-s betegekbol szeparált limfociták in vitro IL-10 termelése magasabb volt a kontrollokhoz viszonyítva, s korrelált a betegség aktivitásával. Az IL-10 (10 ng/ml) a mitokondriális hiperpolarizációt okozó hatásán kívül egészséges limfociták gyöktermelését és apoptózisát nem befolyásolta. Ugyanakkor meglepo módon a lupusos sejtekben éppen ellenkezo hatást váltott ki: mitokondriális hiperpolarizációt nem okozott, viszont megnott a sejtek ROI termelése. Az IL-10 a gyöktermelés mellett az SLE-s sejtek apoptózisát növelte, 10
mely megfelel a korábbi irodalmi adatoknak. Mind az egészséges, mind a lupusos sejtek alkalikusabbá váltak IL-10 kezelés hatására. 4.3. Az SLE-ben észlelt kóros sejtparaméterek és funkciók részleges normalizálása IL-10 blokkolással Lupusos limfociták 16 órás neutralizáló IL-10-ellenes antitesttel vagy az IL-10 antagonista IL-12-vel történo kezelése a gyöktermelés szignifikáns csökkenését eredményezte. Egyik kezelés sem változtatott az egészséges donorok, ill. RA-s betegek sejtjeinek gyöktermelésén. Anti-IL-10 hatására a lupusos sejtek ph-ja csökkent. Egészséges és RA-s, ill. SLE-s alap?? m értékére egyik IL-10 blokkoló kezelés sem volt szignifikáns hatással. 16 órás anti-il-10 vagy IL-12 elokezelés hatására a CD3/CD28 stimuláció által okozott intracelluláris alkalizáció és gyöktermelés nem különbözött szignifikánsan a lupusos és kontroll sejtekben, tehát az IL-10 blokád normalizáló hatású volt. Ezzel szemben az anti-il-10 vagy IL-12 elokezelés nem volt képes korrigálni sem az SLE-s sejtek fokozott hiperpolarizációját, sem a T sejt aktiváció hatására létrejövo?? m változást. KÖVETKEZTETÉSEK 1. Igazoltuk, hogy az SLE-s limfocitában in vitro alaphelyzetben magasabb mitokondriális transzmembrán potenciál, fokozott ROI termelés és intracelluláris alkalizáció, ugyanakkor csökkent GSH szint mérheto. 2. Megállapítottuk továbbá, hogy oxidatív stresszre vagy T sejt aktivációra az SLE-s limfociták mitokondriális hiperpolarizációja, gyöktermelése és ph emelkedése csökkent. 3. A fokozott alaphelyzeti értékek és a stimulációra bekövetkezo, a kontrollhoz képest kisebb mértéku változások magyarázhatják a lupusban 11
tapasztalt fokozott spontán apoptózist és T sejt aktivációt, ugyanakkor a sejtek csökkent további válaszkészségét. 4. Igazoltuk, hogy az intracelluláris ATP szintje SLE-ben csökkent, ami ugyancsak az apoptotikus ingerekre való válaszkészség hiányát magyarázza. Ugyanakkor emiatt a sejtek nekrózisa no, ami a betegségben tapasztaltható gyulladásban játszhat szerepet. 5. A jelenségek hátterében felvetettük a mitokondriális potenciált és ATP szintet is befolyásoló FoF1-ATP-áz komplex szerepét, az ezt gátló oligomicinnel egészséges limfocitákban a lupusos abnormalitásokat modelleztük. Fiziológiás stimulusként a T sejt aktiváció is hasonló változásokat okozott. 6. Kimutattuk, hogy az IL-10 részben okozója az észlelt mitokondriális és celluláris abnormalitásoknak SLE-ben, és ennek blokádjával a defektusok részben normalizálhatók. A doktori munka eredményei szerint az SLE-ben észlelheto mitokondriális hiperpolarizáció, fokozott gyöktermelés, ATP depléció és oxidatív stressz-indukálta nekrózis, valamint a megnövekedett IL-10 termelés és eltéro IL-10 érzékenység fontos szerepet játszanak a kóros apoptózissal és T sejt aktivációval jellemzett celluláris folyamatokban. A lupusos limfocitákban észlelt celluláris abnormalitások elméleti alapot szolgáltathatnak már folyamatban lévo terápiás próbálkozásokhoz, pl. szabadgyökfogó vegyületek alkalmazásához vagy IL-10 gátláshoz, másfelol az eredmények alapján új terápiás célpontok is körvonalazódhatnak, pl. az intracelluláris ATP koncentráció vagy?? m normalizálása révén. A sejtes defektusok részleteinek megismerése révén nemcsak a betegség patogenezise válhat világosabbá, de a terápiás beavatkozások lehetosége is bovülhet. 12
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÉS NEMZETKÖZI ELOADÁSOK 1. Közlemények I. Gergely P Jr, Grossman C, Neupane H, Allam F, Niland B, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Mitochondrial hyperpolarization and ATP depletion in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2002;46:175-190. (IF: 7.389) II. Gergely P Jr, Niland B, Gonchoroff N, Pullmann R, Phillips PE, Perl A. Persistent mitochondrial hyperpolarization, increased reactive oxygen production and cytoplasmic alkalinization characterize altered IL-10 signaling in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 2002;169:1092-1101. (IF: 7.065) III. Perl A, Gergely P Jr, Puskas F, Banki K. Metabolic switches of T-cell activation and apoptosis. Antioxid Redox Signal 2002;4:427-43. 2. Idézheto eloadások 1. Gergely P Jr, Grossman C, Neupane H, Allam F, Niland B, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Hydrogen peroxide-induced changes in mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen intermediate levels and apoptosis in systemic lupus erythematosus. American College of Rheumatology 63rd Annual Scientific Meeting, Nov. 13-17. 1999, Boston, MA, USA (Arthritis Rheum 42, S9., 1999). 2. Gergely P Jr, Niland B, Grossman C, Neupane H, Allam F, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. CD3/CD28-induced production of reactive oxygen intermediates and changes in mitochondrial transmembrane potential are aberrant in patients with systemic lupus. The American Association of Immunologists and Clinical Immunology Society Joint Meeting, May 12-17, 2000, Seattle, WA, USA (FASEB Journal, Suppl., 2000). 3. Gergely P Jr, Niland B, Grossman C, Neupane H, Allam F, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. CD3/CD28-induced production of reactive oxygen intermediates and changes in mitochondrial transmembrane potential are aberrant in patients with systemic lupus. American College of Rheumatology 64th Annual Scientific Meeting, Oct. 28-Nov. 2. 2000, Philadelphia, PA, USA (Arthritis Rheum 43, Suppl., 2000). 13
4. Gergely P Jr, Grossman C, Niland B, Jampala V, Puskas F, Banki K, Phillips PE, Perl A. Mitochondrial hyperpolarization and ATP depletion in patients with systemic lupus erythematosus. American College of Rheumatology 65th Annual Scientific Meeting, Nov. 10-15 2001, San Francisco, CA, USA (Arthritis Rheum 44, Suppl., 2001). EGYÉB PUBLIKÁCIÓK 1. Csermely P, Kajtar J, Hollosi M, Jalsovszky G, Holly S, Kahn CR, Gergely P Jr, Soti C, Mihaly K, Somogyi J. ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein (hsp90). J Biol Chem. 1993; 268:1901-7. (IF:6.733) 2. Csermely P, Gergely P Jr, Nardai G, Schnaider T, Soti C, Szanto I, Somogyi J. A molekuláris chaperonok biokémiája. Biokémia 1994; 18:126-131. 3. Szanto I, Gergely P, Marcsek Z, Banyasz T, Somogyi J, Csermely P. Changes of the 78 kda glucose-regulated protein (grp78) in livers of diabetic rats. Acta Physiol Hung. 1995; 83:333-42. 4. Gergely P Jr. A rheumatoid arthritis mozgásszervi következményei és azok kezelése. Magyar Reumatológia 1996; 37:84-90. 5. Balint G, Gergely P Jr. Clinical immunotoxicity of antirheumatic drugs. Inflamm Res. 1996; 45:S91-5. (IF: 2.231) 6. Gergely P Jr, Balint G. Immunology of rheumatoid arthritis. Allergol Klin Immunol 1998; 1:35-39. 7. Balint G, Gergely P Jr. Rheumatoid Arthritis. In: Klinikai Immunológia Ed. Gy Szegedi et al. Budapest, 2002. 8. Thorell S, Gergely P Jr, Banki K, Perl A, Schneider G. The threedimensional structure of human transaldolase. FEBS Lett. 2000; 475:205-8. (IF: 3.44) 9. Puskas F, Gergely P Jr, Banki K, Perl A. Stimulation of the pentose phosphate pathway and glutathione levels by dehydroascorbate, the oxidized form of vitamin C. FASEB J. 2000; 14:1352-61. (IF: 8.817) 14
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönettel tartozom dr. Perl András professzornak, a SUNY Upstate Medical Univesity, Syracuse, USA Reumatológiai Osztálya vezetojének, aki lehetove tette számomra, hogy az általa irányított laboratóriumban két évig mint a National Institute of Health Fogarty Ösztöndíjasa, majd további egy évig mint kutató reumatológus dolgozhattam. Hálás vagyok neki a türelmes tanításért, az önálló munka lehetoségéért és segítségéért. Onála és otole sajátíthattam el mindazt a tudást és módszereket, melyek segítségével az eredmények, közlemények és jelen értekezés is megszülethettek. Köszönet illeti a laboratórium és a reumatológiai osztály többi munkatársát, akikkel csapatmunkában dolgozva jöttek létre az eredmények: dr. Paul E. Phillips akkori osztályvezeto professzort, dr. Bánki Katalin professzort, dr. Puskás Ferencet, dr. Rudolf Pullmann Jr.-t, dr. Hom Neupanet, dr. Fatme Allamot, Wendy Amidont és Craig Grossmant. Külön köszönöm Brian Nilandnak, hogy foként kutatómunkám elején mindenben segítségemre volt és dr. Nick Gonchoroffnak, hogy nemcsak megismertette, de meg is szerettette velem az áramlásos citometriát. Köszönöm dr. Poór Gyula professzornak, témavezetomnek, hogy az Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet-beli klinikusi tevékenységem alatt is lehetoséget bizosított számomra, sarkallt a kutatómunka folytatására és az Amerikában elért eredmények alapján saját PhD témájában jelen értekezést elkészíthettem. Hálával tartozom dr. Bálint Géza foorvosnak, aki reumatológiai pályámon elindított és dr. Csermely Péter professzornak, akinél diákkörösként a laboratóriumi kutatást elkezdhettem. 15
Köszönet illeti dr. Tulassay Zsolt professzort és dr. Szendroi Miklós professzort a lehetoségért, hogy a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájában a A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu programban egyéni felkészüloként számomra lehetoséget biztosítottak az értekezés elkészítésére és megvédésére. Végül szeretném megköszönni családomnak, feleségemnek és szüleimnek, hogy az ido- és energiaigényes kutatómunka során türelemmel és gondoskodással támogattak. 16