SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA. Ph.D. értekezések

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Ph.D. értekezések Dr. Gergely Péter A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu program Programvezeto: Dr. Szendroi Miklós, egyetemi tanár Témavezeto: Dr. Poór Gyula, egyetemi magántanár

2 Mitokondriális és intracelluláris biokémiai sejtparaméterek jelentosége szisztémás lupus erythematosusban Doktori (Ph.D.) disszertáció Dr. Gergely Péter A támasztó és mozgató szervrendszer muködésének fiziológiája címu program 2. sz. Doktori Iskola (Klinikai Orvostudományok) Doktori Iskola vezetoje: Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Budapest

3 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS... 5 BEVEZETÉS... 7 CÉLKITUZÉSEK... 9 IRODALMI HÁTTÉR REAKTÍV OXIGÉN INTERMEDIEREK, MITOKONDRIÁLIS TRANSZMEMBRÁN POTENCIÁL, INTRACELLULÁRIS PH ÉS ATP SZEREPE AZ APOPTÓZISBAN ÉS T SEJT AKTIVÁCIÓBAN MOLEKULÁRIS, CELLULÁRIS ÉS CITOKIN ABNORMALITÁSOK SLE-BEN MÓDSZEREK BETEGANYAG SEJTKULTÚRA ÉS AZ EGYES KEZELÉSEK LEÍRÁSA ÁRAMLÁSOS CITOMETRIA ÉS FLUORESZCENS MIKROSZKÓPIA Sejthalál vizsgálata Mitokondriális transzmembrán potenciál és reaktív oxigéngyök termelés mérése Limfocita szubpopulációk vizsgálata Intracelluláris ph mérése GLUTATION MEGHATÁROZÁS INTRACELLULÁRIS ATP MÉRÉS IL-10 TERMELÉS VIZSGÁLATA STATISZTIKAI ANALÍZIS EREDMÉNYEK SEJTFIZIOLÓGIAI PARAMÉTEREK VIZSGÁLATA STIMULÁLATLAN LIMFOCITÁKBAN Gyorsult apoptózis mellett mitokondriális hiperpolarizáció és fokozott reaktív oxigéngyök termelés jellemzo az SLE-s (elsosorban T) limfocitákra Csökkent redukált glutation(gsh)-szint SLE-s limfocitákban Intracelluláris alkalizáció SLE-s limfocitákban OXIDATÍV STRESSZ HATÁSÁRA BEKÖVETKEZO SEJTHALÁL, ILLETVE?? M ÉS ROI TERMELÉS VÁLTOZÁSAINAK VIZSGÁLATA Limfociták H 2 O 2 -mediálta sejthalála SLE-ben eltéro módon megy végbe

4 2.2. Csökkent ROI termelés és mitokondrialis hiperpolarizáció elmaradása H 2 O 2 - kezelés hatására SLE-ben AZ INTRACELLULÁRIS ATP-SZINT, F O F 1 -ATP-ÁZ ÉS T SEJT AKTIVÁCIÓ LEHETSÉGES SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA Csökkent intracelluláris ATP szint SLE-ben Oligomicin-indukálta változások kontroll limfocitákon: az F o F 1 -ATP-áz szerepének vizsgálata CD3/CD28-indukálta változások kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata CD3/CD28-indukálta változások összehasonlítása SLE-s és kontroll limfocitákon: a T sejt aktiváció szerepének vizsgálata CITOKINEK SZEREPE AZ SLE-S LIMFOCITÁKBAN TAPA SZTALT RENDELLENESSÉGEKBEN Különbözo citokinek hatása a mitokondriális potenciálra Az IL-10 központi jelentosége SLE-ben Az SLE-ben észlelt kóros sejtparaméterek és funkciók részleges normalizálása IL-10 blokkolással AZ ÉRTEKEZÉS SAJÁT EREDMÉNYEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA MEGBESZÉLÉS KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK IRODALOMJEGYZÉK KÜLÖNLENYOMATOK

5 ÖSSZEFOGLALÁS Mitokondriális és intracelluláris biokémiai sejtparaméterek jelentosége szisztémás lupus erythematosusban Dr. Gergely Péter Témavezeto: Prof. Dr. Poór Gyula; Semmelweis Egyetem, Budapest, Doktori Iskola, 2003 Szisztémás lupus erythematosusos (SLE) betegekben a perifériás vér limfocitákra fokozott spontán és csökkent aktiváció-indukálta apoptózis jellemzo. Jelen doktori munka során azt a feltételezést vizsgáltam, vajon az alábbi kulcsfontosságú biokémiai paraméterek döntoen befolyásolják-e a kóros jelátviteli folyamatokat SLE-ben. E paraméterek, a mitokondriális transzmembrán potenciál (?? m ), reaktív oxigén intermedierek (ROI), intracelluláris ph (phi), az ATP és glutation szint apoptózisban betöltött jelentoségét mostanában ismertük meg.?? m, ROI és phi értékeket magasabbnak találtam SLE-s limfocitákban az egészséges donorokhoz és rheumatoid arthritises betegekhez képest. Az intracelluláris glutation alacsonyabb volt, utalva a redukáló ekvivalensek fokozott felhasználására. H 2 O 2, egy ROI prekurzor adására a kontrollokban átmeneti?? m emelkedés, majd apoptózis jött létre, míg SLE-ben, foként a T sejtekben a hiperpolarizáció elmaradt és apoptózis helyett inkább nekrózist észleltünk. A sejtek ATP tartalma és ATP/ADP aránya, melyeket a sejthalál formáját meghatározó tényezokként ismerünk, SLE-ben csökkent volt és a?? m emelkedéssel volt arányos. A kontroll sejtekben mindezt CD3/CD28 kezeléssel modelleztük, melynek során tranziens hiperpolarizáció, majd ATP depléció, ezt követoen a sejtek fokozott H 2 O 2 -indukálta nekrózisa jött létre. Az F o F 1 -ATP-áz-gátló oligomicin szintén hasonló hatású volt. CD3/CD28-indukálta T sejt aktiváció során SLE-ben kisebb mérvu?? m, ph és ROI emelkedést találtunk. Az SLE patogenezisében jelentosnek tartott IL-10 kontroll limfocitákban átmeneti hiperpolarizációt okozott, de sejthalált nem, SLE-ben viszont ROI termelést és apoptózist idézett elo, nem befolyásolva a?? m értékét. IL-10-ellenes neutralizáló antitest vagy antagonista IL-12 kezelés a stimulálatlan és CD3/CD28-indukált ROI és phi változásokat normalizálta az SLE-s sejtekben, de a?? m értékét nem korrigálta. Doktori munkám alapján elmondható, hogy az emelkedett?? m, ROI szint és ph, az ATP depléció és a megváltozott IL-10 érzékenység fontos szerepet játszanak a lupusos sejtek defektusos apoptózisában és T sejt aktivációjában. Ezen adatok nemcsak a betegség patogenezisének megismeréséhez járulhatnak hozzá, de újabb terápiás beavatkozásokra is lehetoséget biztosíthatnak. 5

6 SUMMARY The Role of Mitochondrial and Intracellular Biochemical Parameters in Systemic Lupus Erythematosus Dr. Peter Gergely Tutor: Prof. Dr. Gyula Poór; Semmelweis University, Budapest, PhD School, 2003 Peripheral blood lymphocytes (PBL) from sytemic lupus erythematosus (SLE) patients exhibit increased spontaneous and diminished activation-induced apoptosis. In my thesis I tested the hypothesis that key biochemical checkpoints play an important role in the abnormal signaling process in SLE. The significance of these parameters, i. e. mitochondrial transmembrane potential (?? m ), reactive oxygen intermediate (ROI) levels, intracellular ph (phi), ATP and glutathion levels in apoptosis has recently been identified.?? m, ROI production and phi were elevated in lymphoctes from SLE patients compared to controls including healthy donors and patients with rheumatoid arthritis. Intracellular glutathion contents were diminished in SLE suggesting increased utilization of reducing equivalents. H 2 O 2, a precursor of ROIs, increased?? m and caused apoptosis in normal PBL. In contrast, H 2 O 2 -induced apoptosis and elevation of?? m were diminished, particularly in T cells, and necrosis was increased instead in SLE. Intracellular ATP content and ATP/ADP ratio, which had earlier been shown to determine the form of cell death, were reduced and correlated with?? m elevation in SLE. As a model, CD3/CD28 co-stimulation led to a transient elevation of the?? m followed by ATP depletion and sensitization of normal PBLs to H 2 O 2 -induced necrosis. Oligomycin, an inhibitor of F 0 F 1 -ATP-ase, had similar effects. CD3/CD28-induced T cell activation in SLE was also blunted as measured by diminished increase in ph,?? m, and ROI production. IL-10, a cytokine known to play an important role in the pathogenesis of SLE, led to a transient elevation of?? m but caused no apoptosis in normal PBL. In contrast, IL-10 induced ROI production and apoptosis in SLE lymphocytes without affecting?? m. IL- 10 blockade with neutralizing antibodies or antagonistic IL-12 normalized baseline and CD3/CD28-induced changes in ROI production and ph with no impact on?? m of lupus PBL. My work conludes that mitochondrial hyperpolarization, increased ROI production, intracellular alkalization and ATP depletion as well as altered IL-10 responsiveness play a crucial role in defective T cell activation and apoptosis in SLE. These findings may not only contribute to the better understanding of the pathogenesis of SLE but may also represent novel targets of pharmacologic intervention. 6

7 BEVEZETÉS A szisztémás lupus erythematosus (SLE) akut és krónikus szakaszokkal váltakozó, a szervezet egészét, foként (bár nem kizárólagosan) a szüloképes korú noket érinto autoimmun betegség. Társadalmi és tudományos jelentoségét növeli, hogy incidenciája viszonylag gyakori (1:10 000), és sem etiológiája, illetve kialakulásának pontos mechanizmusa nem ismert, sem a gyógyítása nem teljesen megoldott, bár megfelelo kezelés mellett hosszú tünetmentes periódusok érhetok el. A jelenleg rendelkezésre álló adatok szerint a betegségre hajlamosító gének és bizonyos környezeti tényezok komplex interakciója révén alakul ki az abnormális celluláris és humorális immunválasz. Az így beindult kóros autoimmun folyamat jellegzetessége a többféle, elsosorban sejtmagbeli autoantigén elleni fokozott antitesttermelés, majd az autoantitestek immunkomplexeket alkotva a parenchymás szervekben lerakódnak, gyulladást, majd a szervek súlyos funkciózavarát idézik elo. Az SLE patofiziológiájában tehát genetikai, exogén, humorális és celluláris tényezoknek tulajdonítanak dönto szerepet? a jelen doktori értekezés célja ez utóbbiak, a sejtes defektusok közelebbi vizsgálata. Az SLE-ban zajló sejtszintu patológiás történések központi eleme a T limfociták funkciózavara, mely azután a B sejt klónok elégtelen szuppresszióját és a már említett fokozott autoantitest termelést eredményezi. Mindez a normálistól jelentosen eltéro citokin milioben megy végbe, mely a kóros autoimmunitás oka és következménye egyaránt lehet. A lupusos celluláris abnormalitásokban a nem kelloen szabályozott apoptózisnak lényeges szerepe van. Az apoptózis a programozott sejthalál fiziológiás folyamata, mely során a szervezet a nemkívánatos sejtektol, így többek között a potenciálisan autoreaktív limfocitáktól, a felesleges B és T sejtektol is megszabadul. Az SLE-s limfociták programozott sejthalála több szempontból is paradox. Leegyszerusítve fokozott spontán és csökkent további (pl. T sejt) aktiváció-indukálta apoptózis észlelheto. A reaktív oxigéngyökök vagy intermedierek (ROI) a klasszikus elképzelés szerint az aerob sejtmuködés toxikus melléktermékei. Ezek ellen többféle biokémiai mechanizmussal is védekezik a sejt, ezek egyik legfontosabb eleme a a redukált és oxidált glutation rendszere. Újabban egyre több adat szól amellett, hogy kontrollált szabadgyök-termelés számos fiziológiás sejtfunkcióhoz, így az apoptózishoz és a T sejt aktivációhoz is szükséges. A szabadgyök-termelés számos transzkripciós faktor 7

8 aktivitását szintén befolyásolja és így szerepet játszhat az SLE-ben észlelt citokin eltérésekben is. A mitokondriális transzmembrán potenciál (?? m ) és intracelluláris ph állandó értéken tartása elengedhetetlen a sejt homeosztázisában? ebben kiemelt szerephez jut a mitokondriumok energia (ATP)-szintetizáló vagy bontó funkcióját végzo enzimkomplex, az F o F 1 -ATP-áz. A potenciálkülönbség jelentos csökkenése vagy megszunése a mitokondriumok funkcióvesztéséhez kapcsolható? így a programozott sejthalál során bekövetkezo?? m csökkenés (megszunés) és acidifikálódás mérésével a folyamat irreverzibilis fázisa detektálható. Ugyanakkor, a legújabb adatok szerint, az apoptózis korai szakában egy átmeneti de szignifikáns?? m emelkedés (mitokondriális hiperpolarizáció) tapasztalható, melyet többféle apoptózis induktor, így hidrogén peroxid-okozta oxidatív stressz során is leírtak. A korai ph átmeneti emelkedése (alkalizáció) szintén egy újonnan megismert jelenség, a T sejt aktiváció során bekövetkezo alkalizáció régebb óta ismert. Vajon mi a patomechanizmusa az SLE-s limfocitákra jellemzo fokozott spontán, ugyanakkor további stimuláció, így T sejt aktiváció által okozott csökkent apoptózisnak? E doktori értekezésben az elobbi, alapveto fontosságú sejtfiziológiai/biokémiai paraméterek vizsgálatával, ill. a T sejt aktiváció, oxidatív stressz indukálta apoptózis és bizonyos citokinek hatására bekövetkezo változások tanulmányozásával próbáltam tisztázni a fenti kérdést, kísérletet téve a celluláris defektusok normalizálásra is. A doktori munkám során végzett kísérletek a szigorúan vett alapkutatás tárgykörébe tartoznak, de eredményei közelebb vihetnek az SLE patogenezisének pontosabb megismeréséhez és hozzájárulhatnak a betegség gyógyítása érdekében végzett kutatásokhoz is. 8

9 CÉLKITUZÉSEK Az SLE-ben tapasztalható kóros celluláris folyamatok megismerése nemcsak a betegség patogenezisének pontosabb megértését könnyítheti meg, de az immunológiai alapkutatás kulcskérdéseinek tisztázásához is hozzájárulhat. Az SLE-s limfociták apoptózisáról, a sejtaktiváció mechanizmusáról nagymennyiségu irodalmi adat áll rendelkezésre, mégis az adatok sokszor ellentmondóak és hiányosak, így az elobbiekben felsorolt számos, újonnan megismert jelentoségu sejtparaméter és az SLE kapcsolatára vonatkozóan ezidáig alig találtam közléseket. A betegség patogenezisét és a sejtes abnormalitások mibenlétét tovább vizsgálandó, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Van-e eltérés?? m, reaktív oxigéngyökök, glutation és intracelluláris ph alapszintekben SLE-s betegekbol szeparált (kezeletlen) limfocitákban rheumatoid arthritises (RA-s) és egészséges limfocitákhoz viszonyítva in vitro? 2. Hogyan jellemezhetok az oxidatív stressz, ill. T sejt aktiváció során létrejövo változások SLE-s, RA-s, ill. egészséges limfocitákban, különös tekintettel a sejthalálra és a fenti sejtfiziológiai/biokémiai paraméterekre? 3. Mi a jelentosége a mitokondriumok és az egész sejt homeosztázisában lényeges szereppel bíró F o F 1 -ATP-áznak és a sejtek ATP szintjének a lupusos celluláris abnormalitásokban? 4. Van-e szerepe az SLE patogenezisében lényegesnek tartott citokineknek a vizsgált biokémiai/sejtfiziológiai paraméterek befolyásolásában egészséges és SLE-s sejtekben? 5. Milyen patomechanizmusok valószínusíthetok az SLE-s limfocitákra jellemzo, a doktori értekezésben újonnan leírt celluláris defektusok mögött? 6. Van-e lehetoség az in vitro észlelt és modellezett kóros sejtparaméterek kísérletes normalizálására SLE-ben? 9

10 IRODALMI HÁTTÉR 1. Reaktív oxigén intermedierek, mitokondriális transzmembrán potenciál, intracelluláris ph és ATP szerepe az apoptózisban és T sejt aktivációban Az aerob élet paradoxonja, hogy míg a magasabb fejlettségu eukarióta sejtek és élolények nem létezhetnek oxigén nélkül, az oxigén toxikus a muködésükre. Az oxigén káros volta abból az egyszeru kémiai törvényszeruségbol fakad, hogy minden egyes oxigén atom egy páratlan elektront, a molekuláris oxigén két páratlan elektront tartalmaz a külso héjon, s így reaktív gyöknek tekinthetok. A mitokondriális elektrontranszport-lánc komplex muködése következtében az oxigén tetravalens redukciójával az ártalmatlan (és nélkülözhetetlen) víz keletkezik, viszont részleges (univalens) redukció során létrejönnek a reaktív oxigéngyökök, vagy reaktív oxigén intermedierek (ROI), az aerob élet káros melléktermékei. Ezek, bár több fiziológiás folyamatban is szerepet játszanak (71, 110), oxidatív stressz révén felelosek a fehérjék, lipidek és DNS károsításáért és így számtalan celluláris defektusért (22). Az oxidatív stressz ellen az emberi szervezetben többféle védekezo rendszer alakult ki, melyek lényeges elemei a szervezet által termelt és a táplálékkal felvett anyagokból képzodo redukáló molekulák (E vitamin, C vitamin, szelén, cöruloplazmin, ferritin,? -karotin, glutation, tioredoxin, mangán, ubiquinon, cink) és enzimek (szuperoxid-dizmutázok, glutation-peroxidáz, glutation-reduktáz és kataláz). A reaktív oxigén intermediereket több betegségben is kóroki tényezoknek tartják, így pl. a daganatos betegségekben, ateroszklerózisban, valamint a gyulladásos betegségek közül a doktori értekezés témáját képezo SLE-ben (22). SLE-ben a ROI-k képzodése által keletkezo metabolitok (szérum lipid peroxidok, 8-oxo-7-hidrodeoxiguanozin, 8-epi-PGF 2? ), és az antioxidáns mechanizmusok (E vitamin, SOD, kataláz, glutation-peroxidáz) mérésével indirekt módon következtettek a betegségben zajló oxidatív stesszre (8,93,21,4). Ezek alapján vetodött fel a ROI-k szerepe a patogenezisben és vezetett azokra a diétás és terápiás kísérletekre, melyek lényege a szabadgyökök csökkentése a szervezetben (21). Mindemellett a perifériás vér limfociták, melyek az autoimmun folyamat lényeges elemei, direkt ROI termelésének korszeru módszerrel (pl. áramlásos citometriával) történo mérésérol irodalmi adat nem állt rendelkezésre, pedig a ROI-k azért is lényegesek SLE-ben, mivel olyan folyamatokat befolyásolnak, mint az apoptózist és T sejt aktivációt, melyek a betegség kialakulásában fontos szerepet 10

11 töltenek be (78). Hildeman és munkatársainak vizsgálata alapján humán sejtekben a T sejt aktiváció, majd a késobbi aktiváció-indukált apoptózis során szuperoxid termelés mérheto (48), a szuperoxid-dizmutáz analóg MnTBAP adására pedig a sejthalál kivédheto. Az apoptózis a programozott sejthalál fiziológiás, genetikailag meghatározott folyamata, mely során a szervezet a nemkívánatos sejtektol, így többek között a potenciálisan autoreaktív limfocitáktól, a felesleges B és T sejtektol is megszabadul. A legkülönbözobb ingerek okozhatnak apoptózist, melynek legfobb jellemzoi az ROI termelodés (39, 45, 86), fehérjebontó enzimek (szerin/cisztein proteázok, Granzyme B, kaszpázok) lánceakciószeru aktivációja, majd proteolízis és DNS fragmentáció (125). Leegyszerusítve, a kaszpázok aktivációja alapvetoen kétféle (sokszor egymással kapcsolódó és egymást nem kizáró) úton jöhet létre: a sejt felszínén levo sejthalál receptorokon (pl. Fas/TNF) keresztül, vagy a pro- és antiapoptotikus gének expressziójának megváltozása mitokondriális változásokhoz, citokróm C kiáramláshoz és apoptózist indukáló faktorok felszabadulásához vezet (59, 138). Az apoptózis jellegzetes morfológiai képpel jár: sejt- és sejtmagzsugorodás, a sejtmembrán apoptotikus bimbóinak megjelenése és a membrán belsejének kifelé fordulása (foszfatidil-szerin externalizáció), majd apoptotikus testekké fragmentálódás, melyeket végül a makrofág rendszer takarít el. Ennek elégtelensége esetén nekrózis alakul ki (ld. késobb az 1. táblázat). A ROI-k képzodésének fo helye a mitokondrium, mely mind a T sejt aktiváció (48, 137), mind az apoptózis (12, 54) folyamatának lényeges regulátora. Ezek jelátviteli folyamatainak kapcsolatát a Fas és TNF-indukált sejthalál, ill. antigén/cd28 kostimuláció példájával vázolom fel (1. ábra). A Fas/TNF receptorok külso stimulus - a megfelelo ligandok (FasL és TNF) megkötése - után felszabadítják a Fas-associált fehérjét (FADD), ami után a kaszpáz 8 aktiválódik. Ennek oligomerizációja és autoproteolízise után újabb kaszpázok aktiválódnak, melyek az apoptózis fontos végrehajtó bontó enzimei. A kaszpáz 3 által aktivált DN-áz (CAD) a sejt DNS-ét fragmentálja. A TNF receptor a DD-doméneken keresztül a TNF-receptor-asszociált faktorral (TRAF) kerül kölcsönhatásba, ami a nukleáris faktor-?b inhibitor (I?B) kináz (IKK) aktivációjához vezet egy kináz rendszeren keresztül (MAPKKK/ASK1). Az apoptózis szignál reguláló kináz 1 (ASK1) a tioredoxinhoz (TRX) való kötodés révén inaktív formában van, azonban ROI hatására a TRX leválik, és az ASK1 kináz aktivitása megno. Az IKK elosegíti az I?B 11

12 foszforiláció(p)-mediálta degradációját, és az NF-?B a magba transzlokálódik, ami számos NF-?B-szenzitív gént indukál. 1. ábra.?? m, ROI és redox rendszerek kapcsolata apoptózisban és T sejt aktivációban (Kammer et al, 2002 (51) után, módosítva, magyarázatot ld. a szövegben) A T sejt receptor (TCR) antigén kötése CD28 kostimuláció mellett a PI3K és PTK kinázokat aktiválja, a következményes Ca 2+ -flux a mitokondriumot is eléri és ROI termelést, valamint NF-?B aktivációt eredményez. A mitokondriális membrán integritásának fenntartását membránstabilizáló Bcl-2 és Bcl-x L, pórusnyitó Bax és BAD molekulák egyensúlya, ill. a mitokondrium redukáló ekvivalenseket (NADPH, GSH és 12

13 TRX) termelo képessége biztosítja. A BAD foszforilációja a mitokondriumhoz kötött PKA által az antiapoptotikus P-BAD citoszólba jutását eredményezi (49, 53). Az ROI kontrollált szintje és regulált NF-?B termelés a sejtek növekedéséhez szükséges, viszont a fokozott ROI produkció (vagy elégtelen redukció) a mitokondrium membránjának sérüléséhez és a belso membrán két oldala között fennálló feszültség, a mitokondriális transzmembrán potenciál (?? m ) csökkenéséhez vezet. Az ezt követo apoptózis során a kaszpázok vitális fehérjék (PARP, 70k U1 RNP, lamin és aktin) proteolízisét végzik, a CAD DNS fragmentációt okoz, a mitokondriális membrán dezintegrálódik és a citokróm c kiszabadul. A?? m csökkenése, majd megszunése az apoptózis irreverzibilis fázisát jelzi, mérésével az apoptotikus sejtek azonosíthatók. A klasszikus elképzeléssel szemben legújabban Vander Heiden és munkatársai 1997-ben Jurkat T sejtvonalon (131), Banki és munkatársai 1999-ben humán perifériás vér limfocitákon (7) Fas-indukált apoptózis korai szakaszában átmeneti?? m emelkedést, azaz mitokondriális hiperpolarizációt írtak le, mely a kaszpázok aktiválódása és a foszfatidil-szerin externelizáció elott történik. A doktori értekezés alapját képezo kísérletek kezdetekor (1998), amikor H 2 O 2 adására magunk is hasonló hiperpolarizációt észleltünk, ez a jelenség nem volt általánosan elfogadott, többen is vitatták. Késobb ezt többféle induktor, így hidrogénperoxid (105), p53 (69), TNF-? (37), staurosporin (109, 104), magas glükóz koncentráció-okozta oxidatív stressz (106, 133), ciszplatin (97), N(? )-hidroxi-l-arginin (112), oxidált LDL (36), szöveti transzglutamináz (ttg) túltermelés (103), laktacisztin (57) által okozott apoptózis esetén is leírták. A?? m állandó értéken tartása a sejt homeosztázisának lényeges eleme, és szabályozásában számos tényezo vesz részt. A mitokondrium negatív töltésu belseje és ehhez képest pozitív töltésu külseje között fennálló potenciálkülönbség létrehozásában és fenntartásában dönto jelentoségu a NADH-ról molekuláris oxigénre elektronokat szállító elektron transzport lánc és az F 0 F 1 -ATP-áz (113). Utóbbi az oxidatív foszforiláció során az elektrokémiai grádiens formájában tárolt energia felhasználásával ATP szintetázként muködve ADP-bol ATP-t hoz létre, vagy mint ATP-áz az ATP hidrolízisével nyert energiával protonokat pumpál ki, és így emeli a mitokondriális transzmembrán potenciált. Emellett a?? m értékét több más faktor is befolyásolja: redox rendszerek (intracelluláris GSH, NADH/NADPH), az intramitokondriális és intracelluláris ph, az elektrokémiai potenciálgrádiens, a mitokondriális membrán ion-transzporterek (OH-/Pi, 13

14 K+/H+, Na+/H+, H+/Pi, H+/piruvát, elektrogén K+ uniporter), a permeabilitást szabályozó pórus komplex (PTCP), melyet a külso membrán VDAC csatornája és a belso membrán ANT transzlokátora szabályoz), a Bcl-2 családba tartozó pro- és antiapoptotikus fehérjék oligomerizációja és intramitokondriális transzlokalizációja. Jelenleg egyértelmu magyarázat nincs arra vonatkozóan, hogy e faktorok közül melyek vesznek részt a mitokondriális hiperpolarizáció létrehozásában. Con A-val indukált T sejt aktiváció során a jelentos Ca 2+ -flux és intracelluláris ph emelkedés eléri a mitokondriumot (66), de a következményes hiper- és depolarizációt kiegyenlíto mechanizmusok muködése miatt a?? m konstans sertés limfocitákban (11). Humán perifériás vér limfociták kezelése Con A-val?? m emelkedést eredményezett (7), de CD3/CD28 kostimuláció és hiperpolarizáció kapcsolatára vonatkozó irodalmi adat nem áll rendelkezésre. Korábbi elképzelések szerint az apoptotikus folyamat mitokondriális depolarizációval és a kaszpázok aktivációjához szükséges celluláris acidifikációval jellemezheto (87). Ahogyan az apoptózis során fellépo mitokondriális hiperpolarizáció, úgy az intracelluláris alkalizáció is a reverzibilis korai szak nemrégen megismert eseménye, melyet többféle stimulus esetén leírtak: növekedési faktor megvonás (56), laktacisztin (57), és staurosporin (122). A korai ph emelkedés hátterében a plazmamembrán transzporterek (Na + /H + antiport, Na + -K + -Cl - -csatornák) aktiválódása és a Bax és Bid fehérjék mitokondriális transzlokációja állhat, ami után?? m változás, majd citokróm C felszabadulás és sejthalál jöhet létre (122). A T sejt aktiváció során fellépo, CD2-mediálta vagy mitogén lektinek által eloidézett alkalizálódás régebb óta ismert (33, 89). Az F 0 F 1 -ATP-áz/szintetáz nemcsak a?? m fenntartásában lényeges, de a termelt ATP az apoptózis aktív folyamatához elengedhetetlen, ennek hiányában a sejtek passzívan, egy meroben más morfológiát mutató formában, primer nekrózisban halnak meg (64). Az apoptózist követo elégtelen eltakarítás esetén is szekunder nekrózis alakul ki. Sokszor az apoptosis és nekrózis, valamint a primer és szekunder nekrózis közötti különbségtétel nehéz, és a folyamatok részletei napjaink egyre intenzívebben kutatott témái közé tartoznak (50). A sejthalál formái közötti különbségeket foglalja össze az 1. táblázat. Az apoptózis és nekrózis mégsem két egymással ellentétes fogalom, hanem inkább a sejthalál két végpontja, melyek az alábbiak szerint egymásba transzformálódhatnak (61): 14

15 - Az apoptózist nekrózis követheti (elégtelen elimináció esetén) - Ugyanaz az inger (pl. H 2 O 2 ) kis dózisban apoptózist, nagyobban nekrózist okoz - Patológiás eseményekben (pl. miokadiális infarktus) nekrózis is elofordul - Mitokondriális permeabilitásváltozás nekrózisban is lehet - Az antiapoptotikus Bcl-2 bizonyos modellekben nekrózis ellen is véd - Az intracelluláris ATP szint változtatásával a sejthalál formája befolyásolható - Bizonyos ingerek (Bax, Bak, c-myc expresszió, szérum megvonás, szteroidok) apoptózist okoznak, de kaszpáz-gátló (Z-VAD-fmk) jelenlétében nekrózis jön létre 1. táblázat. A sejthalál különbözo formái Apoptózis Primer nekrózis Szekunder nekrózis - Fiziológiás/patológiás - Extrém (vsz. külso) véletlen inger nyomán, mindig patológiás Hasonló, mint a primernél, de - Fogékonyság jól regulált - Fogékonyság nem, vagy alig regulált apoptózist követoen alakul ki, ha az -Sejtmembrán késoi károsodása, - Sejtmembrán korai károsodása apoptotikus sejt de korai PS externalizáció eliminációja - Sejt elimináció kontrollált, - Elimináció kontrollálatlan (makrofágok által) makrofágok által elégtelen - Sejttartalom nem áramlik ki: - Sejttartalom kiáramlik: gyulladás nincs gyulladás - Enzimatikus, ATP-dependens jól körülírható biokémiai folyamatokkal szabályozott - Morfológia: piknózis, karyorrhexis, endonukleolízis, kaszpáz-katalizált proteolízis, membrán asszimetria, sejtzsugorodás, nincs mitokondriális duzzadás - ATP- independens, nem enzimatikus passzív folyamatok nyomán alakul ki - Morfológia: teljes sejt duzzadás, onkózis, mitokondriális duzzadás 2. Molekuláris, celluláris és citokin abnormalitások SLE-ben Az SLE patogenezisének alapját képezo, régóta ismert abnormalitás a B sejtek funkciózavara és a kóros humorális immunválasz, mely a poliklonális hipergammaglobulinémia révén patogén autoantitestek termelésével jár. Az 1970-es évek eleje óta, amikor a lupusos anergiás borreakció hátterében defektusos késoi hiperszenzitivitást és limfocita funkciót igazoltak (108), mind több adat támogatja a többféle celluláris és citokin abnormalitás jelentoségét (101), és egyre inkább a T sejtek különbözo funkciózavarait tartják a betegség patogenezisében dönto szereppel bíró tényezoknek (51, ld. 2. ábra). E doktori értekezés is ezekkel foglalkozik elsosorban. 15

16 Az SLE-s T sejtek általánosságban csökkent citotoxicitást és proliferatív válaszkészséget mutatnak különbözo antigénekkel és mitogén lektinekkel szemben in vitro (127). A T helper (Th) sejtek aktivitása a citotoxikus /szuppresszor T sejtek rovására megno, s a természetes ölo (NK) sejtek funkciója szintén károsodott (128). A Th1 és Th2 sejtek egyensúlya az utóbbiak javára tolódik el, melynek következtében megno az IL-6 és IL-10 termelés, míg az IL-2 és IFN-? szintje csökken. Az aktivált Th sejtek felszínén fokozódik a TNF családba tartozó CD40L (CD154) expressziója, ami az IL-6 és IL-10 által is stimulált CD40+ B sejtek hiperaktivitásához és az autoantitestek termeléséhez vezet (19). Az antigénprezentáló sejtek (APC) és T limfociták kommunikációja szintén kóros SLE-ben, amint azt a sejtfelszíni receptorok (CD28, B7, LFA-1, HLA-DR) eltéro expressziója is jellemzi (127). 2. ábra. A T sejtek szerepe a normál és az SLE-s immunológiai történésekben EGÉSZSÉGES Ag APC Ag CD4 Th CD8 Ts/c Normál adhéziós molekula és cytokinexpresszió B sejt Normál immunglobulin termelés Normál T sejtfunkció SLE Ag/autoAg APC Ag/autoAg CD4 Th CD8 Ts/c Kóros adhéziós molekula és cytokinexpresszió B sejt Hypergammaglobulinémia és patogének autoantitestek termelése Ag: antigén, APC: antigén prezentáló sejt, Th: T helper sejt, Ts/c: szuppresszor/ cytotoxikus T sejt T sejtes funkciózavarok: - CD4 Th sejt fokozott muködés - CD8 Ts/c sejtek csökkent funkciója - Csökkent antitestfüggo cytotoxicitás - Th1 és Th2 cytokinek termelésének egyensúlya felbomlik - Csökkent proliferáció mitogénekre és antigénekre - Fokozott spontán és további indukcióra csökkent apoptosis 16

17 Az immunkompetens sejtek rendkívül szerteágazó funkcionális abnormalitásai alapján felteheto, hogy az SLE-s, foként a T limfocitákban valamiféle molekuláris defektus van. Az utóbbi évek kutatásai nyomán számos ilyen, jól körülírható, egy adott molekula abnormalitásához kapcsolódó, nem a gyulladásos autoimmun folyamat szekunder jelenségeinek tartott, hanem primer funkciózavart ismerhettünk meg (51). Ezek a sejten belüli folyamat lokalizációja alapján (a sejtmembrántól haladva a sejtmagig) három (proximális, középso és disztális) szakaszra oszthatók, melyeket a 2. táblázat és a 3. ábra szemléltet (Kammer et al, 2002 (51) után, módosítva). 2. táblázat. Molekuláris defektusok SLE-ben Proximális Középso Diszt. Defektus (lokalizáció az 3. ábrán) - CD45 tirozil foszfatáz defektus (1) - Csökkent/hiányzó TCR?-lánc homodimer és fokozott tirozil foszforiláció és lck tirozil kináz aktivitás (2) - Fokozott IP3 koncentráció (3) - Fokozott intracelluláris Ca ++ -flux (4) - Csökkent PKC által katalizált foszforiláció (5) - Csökkent PKA-I aktivitás (6) - Csökkent PKA-II aktivitás (7) - Mitokondriális defektus - Csökkent MEK katalizálta ERK foszforiláció (8) - eif2? fokozott foszforilációja PKR kináz által (9) - Csökkent Dnmt1 aktivitás (10) Irodalom - Takeuchi et al, 1997 (123) - Liossis et al, 1998 (70) és Matache et al, 2001(84) - Kammer etal, 2002 (51) - Tsokos és Liossis, 1999 (128) - Tada et al, 1991 (121) - Kammer, 1999 (52) - Mishra et al, 2000 (92) - Jelen doktori értekezés - Deng et al, 2001 (25) - Grolleau et al, 2000 (38) - Deng et al, 2001 (25) 3. ábra. T sejtes jelátviteli defektusok SLE-ben 17

18 Említésre méltó, hogy ezekben a defektusokban említett molekulák, különbözo kinázok és foszforilázok regulációjában az elobbiekben részletezett ROI képzodés és redox mechanizmusok fontos szerepet játszanak (1), s így ezen abnormalitások összhangban állnak az apoptózis és T sejt aktiváció SLE-ben észlelt zavaraival (51). Az SLE-s limfociták programozott sejthalálának defektusa manapság széles körben elfogadott, és a lupusos sejtek apoptózisa több szempontból is paradoxnak nevezheto (28), ám az irodalom sokhelyütt ellentmondásos. Emlen 1994-ben közölt, mára már klasszikusnak számító tanulmányának megjelenése óta tudjuk, hogy SLE-ben a perifériás vér limfocitái fokozott apoptózist mutatnak in vitro (29), s az ennek nyomán kialakuló fokozott autoantigén felszabadulásnak szerepe lehet az autoimmun reakció kiváltásában/fenntartásában (14). Ugyanakkor az irodalomban van arra vonatkozó adat is, miszerint az SLE-s limfociták spontán és (pl. UV által) indukált apoptózisa nem különbözik az egészségesektol (13). Az T sejt aktiváció-indukálta (CD3-mediálta) apoptózis viszont csökkent, mely az alacsonyabb TNF? szintézis következtében (60) perzisztáló autoreaktív sejtek fokozott túlélése miatt lehet fontos, ami ismét csak az autoimmun reakciót gerjeszti. Míg az apoptózis gének (Fas receptor, Fas ligand) mutációja állatmodellben SLE-szeru tünetet okoz (95, 16), és a Fas receptor genetikai hibája emberben a limfoid rendszer egy ritka defektusát idézi elo (34, 26), humán lupusban a Fas-mediált apoptózis intaktnak tunik (94, 13). Mindemellett a legújabb adatok szerint a T sejtek fokozott apoptózisa a szérum szolubilis Fas (sfas, CD95-Apo-1) szinttel korrelál és a sfas lényeges eleme lehet az aktív SLE-sekben észlelheto apoptózisnak (111). Az apoptózist és az elobbiekben említett redox folyamatokat befolyásoló molekulák, elsosorban a bcl-2 család tagjainak (Bcl-x L, Bax, Bak, BAD) SLE-ben betöltött szerepére vonatkozó irodalmi adatok ellentmondásosak, és nem adnak magyarázatot az SLE-ben észlelt celluláris defektusokra (51). A kóros apoptózis és T sejtaktiváció mediátorai között jelentos szerepet tölt be az SLE jellegzetességének tartott megváltozott citokin milio, mely elobbbi folyamatok okaként és következményeként is szerepelhet. Bár ebben is találunk ellentmondó adatokat az irodalomban, leegyszerusítve elmondható, hogy SLE-ben a TNF-? vagy inkább a TNF-? /szolubilis TNF-? R hányados, TGF-?, és IL-12 szint csökkent (116), míg az IFN-?, IL-2, IL-6 és IL-10 szintek emelkedettek (42, 73). Nemcsak a citokinek termelése, de az egyes sejtek citokinre adott válasza/érzékenysége (így apoptózisa) is 18

19 eltéro SLE-ben (65). Emellett, ill. ezekkel összefüggésben az SLE genetikai faktorai között több citokin gén polimorfizmust és fogékonyságot is leírtak (129). A kóros citokinmilio a megnövekedett reaktív gyöktermelés miatt megváltozott redox-szenzitív limfokinek expressziójának következtében is kialakulhat. Ebbol a szempontból különös jelentoséggel bír az IL-10, melynek reaktív oxigéngyökök által történt regulációját korábban is leírták (63), és amelynek szintje SLE-ben mind a szérumban (3), mind az in vitro tenyésztett limfociták centrifugálás után nyert szupernatánsában (120, 42) magasabb volt. Az apoptózisban kulcsszerepet betölto Fas receptor (67, 100, 9) és Fas ligand (55) expressziója szintén redox szenzitív. Mindezekkel alapján a fokozott IL-10 termelést (35), megnövekedett Fas ligand felszabadulást (44) és a Fas receptor fokozott expresszióját (76) a limfociták megnövekedett spontán apoptózisával hozták összefüggésbe. Utóbbi hátterében az emelkedett nitrogénoxid-termelést szintén valószínusítik (98, 17). 19

20 MÓDSZEREK 1. Beteganyag A vizsgálatokba 25 SLE-ben szenvedo beteget vontunk be, melyek mindegyike megfelelt az ACR SLE kritériumainak (124). 23 no- (átlagéletkor ± SD: 39,3 ± 5, év közöttiek) és ketto férfibeteget (átlagéletkor ± SD: 44,8 ± 10,2, év közöttiek) tanulmányoztunk. Kontrollként 25 egészséges, nemben és korban az SLE-s betegekhez illesztett személyt, valamint 10, az ACR kritériumok alapján (5) rheumatoid arthritisben szenvedo beteget (8 no, átlagéletkor ± SD: 51,3 ± 6,7 és 2 férfi, átlagéletkor ± SD: 54,0 ± 0) vontunk be a vizsgálatokba. Egyéb olyan fennálló betegség, mely a vizsgálatok eredményét vélhetoen befolyásolhatta (diabetes mellitus, rosszindulatú daganat, fertozés, hematológiai betegségek) kizáró oknak minosült. Az SLE-s betegek közül 15 részesült szteroid kezelésben (5-50 mg prednizon/nap), és 17 kapott valamilyen immunszuppresszív kezelést ( mg hidroxiklorokvint vagy 50 mg azatioprint naponta, vagy heti 7,5 mg methotrexatot). Az RA-s betegek methotrexat, sulfasalazin, cyclosporin A, leflunomid vagy etanercept terápia valamelyikében részesültek, prednizon kezeléssel kombinálva, vagy anélkül. Az SLE-s betegek aktivitását az SLE Betegségaktivitási Index-szel (SLEDAI) határoztuk meg (10). Eszerint 11 betegnek volt 10 vagy annál kisebb a SLEDAI értéke, oket inaktívnak értékeltük, míg 14 beteg esetében mértünk 10-nél nagyobb SLEDAI értéket, akiket aktívnak határoztunk meg. A vizsgálatokat a State University of New York, Upstate Medical University Etikai Bizottságának jóváhagyásával folytattuk, minden beteg és egészséges véradó részletes tájékoztatást kapott, és beleegyezo nyilatkozatot írt alá. 2. Sejtkultúra és az egyes kezelések leírása Heparinizált perifériás vérbol mononukleáris sejteket izoláltunk Ficoll-Hypaque gradiens technikát alkalmazva. A limfocitákat a monociták eltávolítása révén nyertük, melyet saját szérummal kezelt Petri csészéhez történt kitapasztással végeztünk. Az így szeparált limfocitákat RPMI 1640 médiumban reszuszpendáltuk 10 %-os fötális borjú szérummal, 2 mm-os L-glutaminnal, penicillinnnel (100 IU/ml) és gentamycinnel (100?g/ml) kiegészítve. A 10 6 /ml-es koncentrációjú sejtszuszpenziót muanyag edényben 37?C-on inkubátorban tároltuk, mely 5 %-os CO 2 -t tartalmazó párásított levegot 20

21 tartalmazott. A sejtek számolását és életképességének meghatározását tripánkék festéssel fénymikroszkóp alatt végeztük. Oxidatív stressz vizsgálatánál a sejteket különbözo ideig (20 perc, 1,2,3,16, és 72 óra) inkubáltuk 50?M H 2 O 2 jelenlétében vagy anélkül. A T sejt aktiváció tanulmányozására a sejteket olyan Petri-csészéhez adtuk, melyet 1 órával elotte 37?Con OKT3 (CRL 8001, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) monoklonális antitesttel (1? g/ml/csésze) borítottunk be. A CD28 kostimulációt 500 ng/ml CD28.2 monoklonális antitest (PharMingen, San Diego, CA, USA) hozzáadásával végeztük. A proliferáció mérésére 3 H-timidin inkorporációs tesztet alkalmaztunk. Az F o F 1 -ATP-áz komplex aktivitásának szelektív gátlására a sejteket 30 percig elokezeltük 2,5?M oligomicinnel (Sigma, St. Louis, MO, USA). A sejtek különbözo ideju in vitro citokin kezelésénél az alábbi citokineket alkalmaztuk: IL-2 ( U/ml), IL-3 ( ng/ml), IL-4 ( ng/ml), IL-6 (5-50 ng/ml), IL-7 (5-50 ng/ml), IL-10 ( ng/ml), IL-12 (5-50 ng/ml), IL-15 ( ng/ml), TNF-? (20 ng/ml), TGF-? 1 (5-50 ng/ml) és IFN-? (500 U/ml). Mindegyik citokin a PeproTech cégtol származott (Rocky Hill, NJ, USA). A kecskébol származó, poliklonális anti-humán IL-10-ellenes neutralizáló antitestet az R? D Systems cégtol rendeltük (Minneapolis, MN, USA), és 25? g/ml-es koncentrációban alkalmaztuk. 3. Áramlásos citometria és fluoreszcens mikroszkópia Az egyes fluoreszcens festékekkel jelzett sejtek vizsgálatát Becton Dickinson FACStar Plus (Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA) áramlásos ( flow ) citométerrel végeztük, mely 488 nm hullámhosszon 200 mw energiát kibocsátó argon ion lézerrel volt felszerelve. Az áramlásos citometriás mérések mellett a sejtek vizualizálása érdekében fluoreszcens mikroszkópiát használtunk (Nikon Eclipse E800 kamera, Nikon, Tokyo, Japán), a különbözo színu képeket digitálisan egymásra vetítettük SPOT software segítségével (Diagnostic Instruments, Sterling Height, MI, USA). A különbözo hullámhossztartományban emittáló festékek fluoreszcenciáját a citométer három csatornáján (FL1, FL2 és FL3) detektáltuk. Az egyidejuleg alkalmazott festéseknél (pl. T sejtek apoptózisának vizsgálatára annexin V-FITC:FL1 és CD3- Cy5:FL3) olyan indikátorokat használtunk, melyek emissziós spektruma nem mutatott átfedést a másik festékkel. Így lehetové vált az apoptózis és nekrózis egyideju mérése az adott sejtben, apoptózis vizsgálata különbözo limfocita szubpopulációkban,?? m, reaktív oxigéngyökök és apoptózis monitorozása ugyanabban a sejtben. A 3. táblázat a 21

22 vizsgálatokban alkalmazott festékek emissziós maximumát (nm) tartalmazza. A SNARF-1 esetében két csatornán (FL2 és FL3) egyidejuleg mértük az emissziót pulzus processzált módban, és az FL3/FL2 arányt használtuk a ph mérésére. Az áramlásos citometriás méréseknél nem vettük figyelembe a sejttörmeléket, melyet az elore és oldalra szórt fénnyel jellemzett populáció ( forward and side scatter measurements ) alapján a citométer szoftverét használva elektronikus úton kizártunk. Minden mérést legalább 10 ezer sejten végeztünk. 3. táblázat. Az alkalmazott fluoreszcens festékek jellemzoi Alkalmazás Festék Emissziós maximum (nm) Sejthalál Mitokondriális transzmembrán potenciál Annexin V Konjugált fluorokróm: FITC PE Propidium-jodid (PI) DiOC 6 JC-1 (monomer és dimer) TMRM CMXRos Reaktív oxigéngyök DHR? Rhodamin 123 HE? Etidium DCF-DA? DCF és Csatorna FL1 FL2 FL2 FL1 FL1 és FL2 FL2 FL2 FL1 FL2 FL1 Membrán potenciál DiBAC 4 (3) 516 FL1 ph i SNARF-1 650/580 FL3/FL2 Limfocita szubpopulációk CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO Konjugált fluorokróm: FITC Cy FL1 FL Sejthalál vizsgálata A tripánkék festéssel történt viabilitás meghatározás és hozzávetoleges sejtmorfológiai vizsgálat mellett a sejthalál további megítélésére a limfocitákat fluoreszcens indikátorral konjugált annexin V-tel, ill. propidium-jodiddal (PI) festettük, majd áramlásos citometriát és fluorescens mikroszkópiát alkalmaztunk. A festés és a citometria részleteit illetoen utalunk Nicoletti és munkatársainak közleményére (96). Az annexin V az egészséges sejteket nem festi, viszont az apoptózis során bekövetkezo sejtmembrán externalizáció (a sejthártya belsejének a külso tér felé fordulása) miatt kötodik a membrán foszfatidil-szerin (PS) részéhez (83). Indikátorral, fluoreszcein izotiocianáttal (FITC) vagy phycoerythrinnel (PE) konjugált annexin V-tel festve az apoptózis így áramlásos citometriával vagy fluoreszcens mikroszkóppal 22

23 vizsgálható (132). Emellett az apoptotikus sejtek alaki sajátságainak, a sejtzsugorodásnak és nukleáris fragmentációnak folyamatát is figyelemmel követtük fluoreszcens mikroszkópia segítségével, annexin V-FITC-el (FL1, zöld) és propidium jodiddal (PI, FL2, piros) festve. A nekrózis meghatározása PI festéssel történt, a sejtek morfológiai változásának (sejt- és sejtmagduzzadás és sejttörmelék képzodés, ld. 1. táblázat) megfigyelése mellett. Sem az élo, sem az apoptotikus sejtek nem festodnek PI-dal, a nekrotikus sejtek viszont festodnek annexin V-tel is, így a nekrózis aránya az annexin V pozitív populáción belüli PI-pozitivitás százalékával megadható. Az apoptózis pedig az egyszerre annexin V-pozitív és PI negatív sejtek arányával fejezheto ki. A PI festés (50?g/ml) után szintén fluoreszcens mikroszkópiát és áramlásos citometriát alkalmaztunk Mitokondriális transzmembrán potenciál és reaktív oxigéngyök termelés mérése A gyöktermelés mérésére oxidáció-szenzitív fluorokróm festékeket dihidrorodamin 123-at (DHR), hidroetidint (HE) és 5,6-karboxi-2,7 - diklorofluoreszcein-diacetátot (DCF-DA) használtunk. A?? m meghatározását 3,3 - dihexiloxakarbocianin jodid (DiOC 6 ), 5,5,6,6 -tetrakloro-1,1,3,3 -tetraetilbenzimidazolo-karbocianin jodid (JC-1), tetrametilrodamin-metilészter (TMRM) és klorometil-x-rozamin (CMXRos) festések segítségével végeztük. Mindegyik festék a Molecular Probes cég terméke volt (Eugene, OR, USA). A módszerek részletes leírásánál hivatkozunk korábbi közleményekre is (6). A kezeletlen vagy különféleképpen kezelt (H 2 O 2, CD3/CD28, oligomicin stb.) sejteket háromszor mostuk 10 mm-os HEPES-sel pufferolt sóoldatban (140 mm NaCl, 2,5 mm CaCl 2, ph: 7,4), majd ugyanebben az oldatban inkubáltuk 0,1?M DHR-rel 2 percig, vagy 1? M HE-vel 15 percig, ill. 1?M DCF-DA-val 15 percig, s utána áramlásos citometriát végeztünk. Míg az R123, a DHR oxidáció során keletkezo fluoreszcens terméke (FL1) a mitokondrium belso membránjához tapad, a DCF (FL1) és az etidium (FL2) a citoszólba kerül. Vizsgálataink során a DHR-t és HE-t szenzitívebbnek találtuk, mint a DCF-DA-t, és az eredményeknél csak a két elobbi festékkel mért adatokat közöljük. A mitokondriális transzmembrán potenciál áramlásos citometriás mérésére a sejteket 20 nm DiOC 6 -tal festettük 15 percig sötétben 37?C-on a fent részletezett HEPES oldatban. A DiOC 6 egy kationos, erosen lipofil molekula, melynek 23

24 fluoreszcenciája (FL1) független az oxidációtól (így a gyöktermelés nem befolyásolja) és arányos a?? m értékével (102). A mitokondriális potenciált JC-1 festékkel, 0,5?Mos koncentrációban 37?C-on 15 perces inkubálás után szintén mértük. A JC-1 alacsony potenciálon zöld (FL1, emisszió: 527 nm) fluoreszcenciájú monomer formában létezik, viszont magas potenciál esetén úgynevezett J-aggregátumok jönnnek létre, melyek piros színuek (FL2, emisszió: 590 nm). A?? m tehát az FL2 fluoreszcencia intenzitásával vagy az FL2/FL1 aránnyal mérheto (114, 18). Mind a gyöktermelés, mind a?? m számszerusítésére az átlag fluoreszcenciát ( mean channel fluorescence? S.E.M. ) használtuk, a különbözo festékekkel mért értékek jobb összehasonlíthatósága érdekében az egészséges donorokból származó sejtek átlagát 100,00-ra normalizáltuk és ehhez hasonlítottuk a többi adatot. A?? m mérésére TMRM-et és CMXRos-t is használtunk, melyek a DiOC 6 és JC-1 festékekkel gyakorlatilag megegyezo értékekek adtak, így az ezekkel mért eredményeket külön nem közöljük. Jóllehet a TMRM-et és CMXRos festékek excitációs maximuma távol esik az alkalmazott argon lézer által kibocsátott lézernyaláb 488 nm-es hullámhosszától, megfelelo excitációt és fluoreszcencia intenzitást tapasztaltunk e két festékkel is. A pozitív kontrollként használt protonofór anyaggal (5?M karbonilcianid m-klorofenilhidrazon, Sigma) való 15 perces kezelés 37 C-on mindegyik potenciometrikus festékkel mérve a?? m jelentos csökkenését eredményezte, jelezve a mitokondriális potenciálkülönbség kiegyenlítodését. A mitokondriális transzmembrán potenciál értékekben mért különbségek (pl. egészséges és SLE-s limfociták?? m -ja) a protonophorral való kezelés után megszuntek, így a protonophor belso kontrollként is szolgált, esetleges mutermék (eltéro festékkoncentráció, sejtszám stb) kiküszöbölésére. A?? m értéke nem teljesen független a sejtmembrán potenciáltól, azaz a sejt belso tere és az extracelluláris milio között fennálló potenciálkülönbségtol. Ezen túlmenoen az alkalmazott festékek fluoreszcenciáját a sejtmembrán potenciál is befolyásolhatja. Annak eldöntésére, hogy a mitokondriális transzmembrán potenciál értékekben mért különbségek létrejöttében szerepe van-e a sejtmembrán potenciálnak, az áramlásos citometriás méréseket a membránpotenciált tükrözo DiBAC 4 (3) festéssel is elvégeztük. Az egyes vizsgálati csoportok között nem tapasztaltunk különbséget, tehát a JC-1, DiOC 6, TMRM és CMXRos festékekkel mért különbségek valóban a?? m értékét tükrözték. 24

25 3.3. Limfocita szubpopulációk vizsgálata A?? m, ROI, sejthalál változásait az egyes limfocita szubpopulációkban Quantum Red/Cy5-konjugált monoklonális antitestekkkel (CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO) való festés után áramlásos citometriával követtük nyomon. A Cy5 FL3 fluoreszcenciája lehetové tette a FL1 és FL2 festékekkel (3. táblázat) történo egyideju festést. Az egyes kombinációkat az eredményeknél, ill. az ábráknál közöljük Intracelluláris ph mérése A sejtek ph-ját is áramlásos citometriával határoztuk meg karboxiseminaphthorhodafluor-1 (SNARF-1)-acetoximethylészter-acetát indikátor (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) segítségével. A mérésekhez Wieder és munkatársainak (136) módszerét használtuk az alábbi módosításokkal. A karboxi-snarf-1/am-acetát semleges töltésu észter formájában a sejtbe bediffundál, ahol az intracelluláris észterázok hidrolizáló hatása révén egy erosen poláros molekulává alakul. A belso térben rekedt fluoreszcens tulajdonságokkal bíró molekula emissziós spektruma az intracelluláris ph-tól függoen változik, és a két különbözo emissziós tartományban mért fluoreszcencia-intenzitás hányadosával a ph pontosan mérheto. Az in vitro inkubált limfocitákat (5x10 6 sejtet) 10 perces centrifugálás (1000 rpm) után foszfát pufferben ( phosphate buffered saline, PBS) mostuk és PBS-ben reszuszpendáltuk. Ezt követoen 5? g/ml karboxi-snarf-1/am-acetátot adtunk a szuszpenzióhoz 0,5 mg festék/ml-es dimetilszulfoxidos (DMSO) törzsoldatból és a sejteket 30 percig 37?C-on inkubáltuk. Minden kísérlethez friss karboxi-snarf-1- AM/acetát törzsoldatot készítettünk. Az inkubálás után áramlásos citometriát végeztünk és két emissziós sávban (FL2: 580 nm és FL3: 650 nm) vett fluoreszcencia intenzitás arányát (FL3/FL2) pulzus processzált módban kollektáltuk. Az intracelluláris ph-t az FL3/FL2 arányból számítva, ismert ph-jú oldatokkal készített kalibrációs egyenes segítségével határoztuk meg. A standard egyeneshez magas K + koncentrációjú pufferbol (120 mm KCl, 30 mm NaCl, 0.5 mm MgSO 4, 1 mm CaCl 2, 1 mm NaHPO 4, 5 mm glükóz és 10 mm HEPES) különbözo ph-jú oldatokat készítettünk, majd 5? g/ml nigericin (Sigma, St. Louis, MO, USA) adásával kiegyenlítettük az intra és extracelluláris ph-t. Így a referens oldatban levo sejtek intracelluláris ph-ja megegyezett az oldat (ismert) ph-jával. 25

26 4. Glutation meghatározás A sejtek teljes glutation-tartalmát Tietze enzimatikus módszerével mértük (126) sejtet 50? l 4,5 %-os sulfoszalicilsavas oldatban reszuszpendáltunk. A precipitált proteint 4?C-on 10 percig g-vel lecentrifugáltuk és a fehérjetartalmat Lowry módszerével határoztuk meg (79). A minták GSH tartalmát az ismert mennyiségu GSHval készített referencia görbe alapján számoltuk ki. A sejtek GSH és GSSG tartalmát reverz-fázisú ioncserélo magas nyomású folyékony kromatográfiás (HPLC) módszerrel határoztuk meg ultraibolya (UV, hullámhossz:365 nm) detektor alkalmazásával (30) sejtet deproteinizáltunk 10 %- os perklórsavval és 1 mm-os batofenantrolin-diszulfonsavval, majd háromszori fagyasztás és felolvasztás után a mintákat 3 percig g-vel lecentrifugáltuk. Ezután 500? l felülúszóhoz 50? l-nyi 100 mm-os monojódecetsavban oldott 0,2 mm m-krezol ibolyát adtunk, majd további 480? l 2M KOH és 2,4M KHCO 3 adásával neutralizáltuk az oldatot. A mintákat eloször szobahon sötétben 10 percig, majd 1 ml 1 %-os fluorodinitrobenzol adása után 4?C-on 12 óráig inkubáltuk. Centrifugálás és szurés után 100? l mintát injektáltunk a HPLC készülékbe (Waters Allience System, Milford, MA, USA), melyet egy Waters Spherisorb-NH 2 oszloppal szereltünk fel. A redukált és oxidált glutation tartalmat ismét ismert mennyiségu GSH és GSSG standardokkal készített referencia görbe segítségével határoztuk meg. 5. Intracelluláris ATP mérés A sejtek ATP tartalmát a luciferin-luciferáz lumineszcencián alapuló módszerrrel mértük (81). Az in vitro 16 óráig inkubált limfocitákat (5x10 6 sejtet) centrifugálással összegyujtöttük és PBS-ben mostuk, majd a sejteket 50? l PBS-ben reszuszpendáltuk és 50? l 2,5 %-os triklórecetsavat adtunk hozzá. A mintákat ezután - 20?C-on tároltuk, és a különbözo napokon extrahált mintákat egyszerre mértük, így lehetové vált több SLE-s és kontroll minta egyideju vizsgálata. A minták fehérjetartalmát Lowry módszerével határoztuk meg (79). A bioluminescencián alapuló ATP mérés lényege, hogy a luciferáz enzim katalízisével a luciferin szubsztrátból az ATP mennyiségétol függoen oxiluciferin termelodik: ATP + D-luciferin + O 2? AMP + pirofoszfát + oxiluciferin + CO 2 + fény. Megfelelo feltételek mellett a keletkezo fény (fotonok) mennyisége egyenesen arányos az ATP mennyiségével, a fény luminometriás mérésével az ATP tartalom igen pontosan meghatározható, akár nanomólos vagy pikomólos ATP mennyiségek esetén is. 26