A vékonybél autotranszplantáció kísérletes vizsgálata és szerepe az életminőségre

Pécsi Tudományegyetem Egészségtudományi Kar Egészségtudományi Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Bódis József az MTA doktora, egyetemi tanár, dékán TÖRTÉNELMI ÁTTEKINTÉS 192 Carrel: első kísérletes béltranszplantáció (Lyon Medico 192;98: 85964.) A vékonybél autotranszplantáció kísérletes vizsgálata és szerepe az életminőségre Habilitációs előadás Dr. Ferencz Andrea PhD PTE ÁOK Sebészeti Oktató és Kutató Intézet Pécs, PAB Székház, 21. május 2. 1959 Lillehei: orthotopikus vékonybél átültetés kutyákon (Ann Surg 1959;15: 5436.) 1971 Monchik, Russel: heterotopikus transzplantáció patkányon (Surgery 1971;7: 69372.) 1968 Első klinikai próbálkozások Európában és az USAban 1988 Grant: első sikeres han béltranszplantáció, melyet cadaver donorból Cyclosporin védelmében végzett el (Lancet 199; 335: 1814.) 1992 Új immunszuppresszáns, a tacrolimus (FK56) bevezetése a vékonybél transzplantációban (Ann Surg 1995; 222: 2782.) 1994 Intestinal Transplant Registry létrehozása THE INTESTINAL TRANSPLANT RESTRY VÉKONYBÉL TRANSZPLANTÁCIÓ INDIKÁCIÓI Argentína: 2 Ausztria: 1 Belgi: 3 Brazília: 2 Kanada: 4 Chile: 1 Kína: 5 Kolbia: 1 NagyBritannia: 4 Franciaország: 2 Németország: 4 Olaszország: 4 Japán: 3 Mexikó: 1 Hollandia: 1 Portugália: 1 Spanyolország: 1 Svédország: 4 Svájc: 1 Törökország: 1 USA: 31 21 ország 77 centrában történik vékonybél v. multiviscerális transzplantáció. Recipiensek és a graftok 1 éves túlélése 665%, 5 éves túlélése 6% alatt. Magyarországi klinikákon nincs bélátültetés. A témában 12 kutatóhelyen folynak vizsgálatok. Gyerek Aganglionosis (Hirschsprung disease) Congenital epithelial mucosal disease Gastrochisis Intestinal atresia Necrotizing enterocolitis Radiation enteritis Volvulus Short gut syndrome Felnőtt Crohn s disease Desmoid tors Gardner s syndrome/familial polyposis Ischemia Traa Volvulus Inflammatory bowel disease Hollow visceral myopathy Radiation enteritis Secretory diarrhea Autoimmune enteritis Short gut syndrome Több mint 75%nak hiánya (rezekciója) és/vagy működészavara A KUTATÁS ALAPJA A vékonybél transzplantáció sikerét befolyásoló tényezők Malabsorpciós szindróma Totál parenterális táplálás (1969 ) 1 éves túlélése 759% Szövődmény: cholestasis, irreverzibilis májkárosodás (fibrózis), rekurráló szepszis, trombózis Transzplantáció Nagyfokú immunogenitás GraftVersusHost Disease Microchimerismus Fokozott érzékenység az ischémiás/reperfúziós károsodással szemben A vékonybél a cardiac output 25%át kapja, melynek 9%a a mucosa (2 m 2 felület) és submucosa területére kerül. 1

A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása Ischémia A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA (Granger DM. Gastroenterol 1981; 81: 229.) (McCord JM. J Biol Chem 1969; 244: 64955.) ATP Reperfúzió ADP AMP Xanthin Dehidrogenáz Adenozin Inozin Xanthin Oxidáz Xanthin Hypoxanthin SOD O 2 O 2. Xanthin OxidázHugysav OH. Kemotaktikus faktorok (PAF, LTB 4, TNF) H 2 O 2 Kataláz Gpx H 2 O GSH Membránkárosodás MDA GSSG O 2 Gr Szövetkárosodás PMN leukocyták Proteázok, oxidázok Az ischémiás szövetkárosodást elsődlegesen az OFRs okozzák, melyek a reperfúzió alatt felszaporodnak. Az endogén védelem elégtelenné válik, kialakul az oxidatív stressz állapota membránkárosodásokkal, permeabilitás fokozódásával, transzportfolyamatok zavarával. (Ferencz et al. Magy Seb 1999; 52: 25) A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA Bélszövetkárosodás Lokális és s szisztémás s hatások Elégtelen felszívódás (tápanyag, gyógyszer, iontranszport) (de Zwart LL. Free Radic Biol Med 1999; 26: 2226.) Permeabilitási zavar Bakteriális transzlokáció (Zimmerman BJ. Am J Physiol 199; 259: 394. Endotoxémia, Sepsis Multi Organ Failure KÉRDÉSEINK Milyen mértékű oxidatív károsodás lép fel különböző időtartamú meleg ischémia/reperfúzió esetén? Hogyan változik a bélszövet morfológiája? Gyulladásos jelátvitel aktiválódik Hisztokompatibilitási complex antigének expressziója Rejekció (Salehi P. Surgery 27; 141: 79583.) A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA Kísérleti protokoll: Keverék kutyákon (n=2) meleg ischémia/reperfúzió vizsgálata I. Csoport (n=1) (n=1) Meleg ischémia 1 óra Meleg ischémia 3 óra Reperfúzió 1 óra A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Szöveti Malondialdehid (um/g) I. csoport II. csoport 25 2 15 1 5 4 3 2 1 Szöveti Redukált Glutation (um/g) I. csoport II. csoport Szöveti Szuperoxid Dizmutáz (IU/g) I. csoport II. csoport Ischémia vége Korai reperfúzió Reperfúzió vége Mean±SEM p<.5 vs. (Ferencz et al. Folia Hepatologica 21; 6: 28.) 2

A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA A strukturális változások kimutatása alapvetően szövettani módszerrel történik. (Scher et al. Am J Pathol1992; 14: 8318) Qualitatív meghatározás 8 7 6 Quantitatív meghatározás (Scion Image Software) 25 2 A károsodás Parkféle hisztológiai stádiai: Grade 5. (Surgery 199; 17: 574.) (Grade ) Mucosal thickness () 5 4 3 2 Depth of Crypts () 15 1 Stádi Grade A károsodás mértéke normál bélszövet, károsodás nélkül 1 ischemia reperfusion I ischemia I reperfusion 5 ischemia reperfusion I ischemia I reperfusion Grade 1 villusok kismértékű megemelkedése, kripták épek 14 Grade 2 Grade 3 Grade 4 jelentős epithel leválás, helyenként károsodott kriptákkal epithel leválás, villus denudáció, kriprakárosodás denudált villusok, lamina propria és a kripták decellularizációja, I. (ischémia) (Grade 1) I. (reperfúzió) (Grade 3) Muscle thickness () 12 1 8 6 4 2 Mean ± SEM. P<.5 vs. ; P<.1 vs. Grade 5 mucosa leválása, bélstruktúra jelentős szétesése II. (ischémia) (Grade 4) II. (reperfúzió) (Grade 5) ischemia reperfusion I ischemia I reperfusion KÖVETKEZTETÉS A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI Vékonybél 1 órás meleg ischémiája fokozta a membránkárosodást és csökkent az endogén antioxidáns kapacitás, melyet főként a SOD aktivitásának drámai csökkenése jelzett. Az oxidatív stressz 3 órás meleg ischémia hatására tovább fokozódott. A reperfúzió alatt a káros mechanizmusok tovább nőttek. A mucosa és crypta károsodás szignifikáns volt mind az 1, mind a 3 órás csoportokban. Az izomban jelentős morfológiai eltérést nem találtunk. 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása KONZERVÁLÓ OLDAT/HIDEG ISCHÉMIÁS IDŐ 1976 Collins fejlesztette oldat 1976 Eurotransplant Organisation módosította Collins oldatát 1986 University of Wisconsin oldat bevezetése EC, UW, HTK a leggyakrabban használt konzerválásra. Ma sincs kialakult álláspont, hogy melyik oldat a bél számára optimális. (Wei L. World J Gastroenterol 27; 13: 368491.) 1999. A kutatások során nem alakult ki konszenzus abban a tekintetben sem, hogy mennyi a bél számára elviselhető leghosszabb hideg ischémiás idő. 27. 68 óra maximális hideg ischémiás idő A klinik számára ma is az az ajánlás, hogy a vékonybél hideg ischémiás idejét a minimra kell csökkenteni, és mihelyt lehet át kell ültetni. Tartalom (mmol/l) Glukóz Laktobióz Raffinóz Foszfát puffer Bikarbonát puffer Allopurinol Adenozin Glutation Hidroxietil keményítő (kolloid) ph Osmolaliás (mosm/l) Az EC és UW oldat összetétele EC oldat 198 1 1 Na + 1 3 K + 115 12 Mg 2+ 5 7.2 355 UW oldat 1 3 25 1 5 3 5 g/l 7.4 32 ( Mülbacher F. Transplant Proc 1999; 31: 2697.) A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL KÉRDÉSEINK Milyen mértékű oxidatív károsodás lép fel különböző időtartamú hideg konzerválás és reperfúzió esetén? Hogyan változik a bélszövet morfológiája? Milyen mértékű a PMN leukocyták szabadgyök termelése? Hideg konzerválás hatására hogyan változik a programozott sejthalál mértéke? 3

A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL 12 Szöveti Malondialdehid (um/g) 4 Szöveti Redukált Glutation (um/g) Kísérleti protokoll: Keverék kutyákon (n=4) totál orthotop vékonybél autotranszplantáció 1 8 3 I. csoport (n=1) II. csoport (n=1) III. csoport (n=1) IV. csoport (n=1) Bélrezekció Konzerválás 2 óra Euro Collins oldat Konzerválás 3 óra Euro Collins oldat Konzerválás 6 óra Euro Collins oldat Konzerválás 3 óra University of Wisconsin oldat Reperfúzió 1 óra Reperfúzió 1 óra Reperfúzió 1 óra Reperfúzió 1 óra 6 4 2 I. csoport II. csoport III. csoport IV. csoport 3 25 2 15 1 5 2 1 Szöveti Szuperoxid Dizmutáz (IU/g) I. csoport II. csoport III. csoport IV. csoport I. csoport II. csoport III. csoport IV. csoport Ischémia vége Korai reperfúzió Reperfúzió vége Mean±SEM p<.5 vs. (Ferencz et al. Magy Seb 21; 54: 64.) A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL Qualitatív meghatározás (Parkféle klasszifikáció) A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL CERIUMHISZTOKÉMIA Az OFRs detektálása számos nehézségbe ütközik. (Grade ) I. (Grade 1) II. (Grade 2) III. (Grade 4) Ceri hisztokémia és Konfokális Laser Scanning Mikroszkóp együttes alkalmazásának lényege: az OFRs a Ce atomokkal laser fényben reflektanciát mutató ceriperhidroxi precipitátokat képez. Mucosal thickness (um) 8 7 6 5 4 3 2 1 Quantitatív meghatározás (Scion Image Software) Depth of Crypts (um) 25 2 15 1 5 Muscle thickness (um) 14 12 1 8 6 4 2 Minden csoportban a v. mesenterica superiorból vérmintákat vettünk a laparotomia után (kontroll) és a reperfúzió végén. Az izolált PMN leukocytákat in vitro inkubáltuk CeCl 3 al, a sejtek magját fluorescens markerrel (PI) jelöltük. ( Telek G. J Histochem Cytochem 1999; 47: 12112.) 1 hour 3 hours Preservation 6 hours 1 hour 3 hours Preservation 6 hours 1 hour 3 hours Preservation 6 hours Mean ± SEM. P<.5 vs. ; P<.1 vs. A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL A PMN LEUKOCYTÁK SZABADGYÖK TERMELÉSE A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL A DNS KÁROSODÁS KIMUTATÁSA BÉLSZÖVETBEN A B C D E 1972 Kerr: az apoptózis (programozott sejthalál) jelensége (Kerr JF. Br J Cancer 1972; 26: 23957.) 1997 Shah: 24 órás vékonybél konzerválás után a sejtek döntően apoptózis útján halnak el. (Shah KA. Transplantation 1997; 64: 13937. ) F G H I J Reperfundált IV. Csoport IV. Csoport Reperfundált (Ferencz et al. Magy Seb 22; 55: 3316.) Reperfundált IV. Csoport IV. Csoport Reperfundált TdT mediated dutp Nick End Labelling (TUNEL) technika (In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche ) 4

KÖVETKEZTETÉS A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI Vékonybél hideg konzerválása mérsékelte mind a kialakuló oxidatív, mind a morfológiai károsodásokat. Modellünkben az EC és UW oldatokban tárolt graftok esetén szignifikáns eltérést nem találtunk. A konzerválást követő reperfúzió alatt ugrásszerűen megnőtt a PMN leukocyták szabadgyök termelése és a sejtek DNS károsodása. 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása A PREKONDÍCIONÁLÁS ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁS (IPC) HőShock Kémiai Prekondícionálás Ischémiás 1986 Murry: IPC, mint endogén adaptációs mechanizmus (Murry CE. Circulation 1986; 74: 112436.) Perfúzió Ennek kiváltására olyan rövid I/Rs ciklusokat alkalmazunk, melyek nem okoznak szervkárosodást, de aktiválják az endogén védelmi rendszert, s így a szövet jobban ellenáll a későbbi, tartósabb ischémiás behatással szemben. (Yellon DM. Cardiovasc Res 1998; 37: 2133.) IPC Számos szövetnél (szív, máj, vázizomzat, agy) kimutatásra került, hogy az IPC korai és késői formája fokozza a szerv I/R károsodással szembeni toleranciáját. (Ishida T. Shock 1997; 8: 8694.) (Baxter GF. Circulation 1994; 9: 29933.) (Ferencz et al. Transplant Proc 24; 36: 2868.) Ischémia Ischémiás prekondícionálás Korai védelem (13 óra) Reperfúzió Késői védelem (2472 óra) IPC KASZKÁD MUCOSA SEJTEKBEN Adenosin, NO Endogén opioid peptidek OFRs Ischémia/Reperfúzió A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA G OFRs IκB foszforiláció és degradáció PLC PIP2 PLD IP3 + DAG IκB NFkB RelA Új fehérjék szintézise KÉSŐI ADAPTÁCIÓ? TyK MAP kinázok PKC PKC transzlokáció NFκBdependens gén transzkripció Szabad NF κb OFRs κb kötőhelyek kinázok? Sejtmembrán K ATP csatornák kinyílnak? OFRs más szubsztrátok KORAI ADAPTÁCIÓ OFRs KÉRDÉSEINK Hogyan befolyásolja az IPC alkalmazása a konzervált bélszövetben kialakuló oxidatív stressz mértékét? Milyen mértékű a PMN leukocyták szabadgyök termelése IPC hatására? Vékonybél IPC során történike NFκB transzkripciós faktor aktiválódás és hány ciklus szükséges ehhez? (de Oca J. Transplant Proc 1999; 31: 2573.) (Zhang Y. Life Sci 21; 68: 11319.) (McCallion K. Shock 2; 14: 42934.) (Gute D. Microcirculation 1996; 3: 88.) (Yang SP. Zhongguo Yao Li Xue Bao 1999; 2: 3414.) (Brennan P. Biochim Biophys Acta 1995; 126: 16775.) 5

A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA Kísérleti protokoll: Keverék kutyákon (n=3) total orthotop vékonybél autotranszplantáció I. csoport (n=1) II. csoport (n=1) III. csoport (n=1) 4 ciklus 4 ciklus Konzerválás 3 óra Euro Collins oldat Reperfúzió 1 óra Konzerválás 3 óra Reperfúzió 1 óra 4 ciklus University of Wisconsin oldat 1 8 6 4 2 Szöveti Malondialdehid (um/g) II. csoport 3 25 2 15 III. csoport 5 4 3 2 1 Szöveti Szuperoxid Dizmutáz (IU/g) Szöveti Redukált Glutation (um/g) II. csoport III. csoport 1 Ischémiás prekondícionálási protokoll 4 ciklus (1 ciklus= 5 perc ischémia + 1 perc reperfúzió) 5 II. csoport III. csoport Ischémia vége Korai reperfúzió Reperfúzió vége Mean±SEM p<.5 vs. Kontoll A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA CERIUMHISZTOKÉMIA A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA A DNS KÁROSODÁS KIMUTATÁSA BÉLSZÖVETBEN ReperfundáltI I Reperfundált Reperfundált I I Reperfundált (Ferencz et al. Surgery 22; 132: 87784.) A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA NUCLEAR FACTOR KAPPA BINDING (NFkB) 1986. Sen és Baltimore a HIV vírus enhancer és promoter régióin a kappa könnyűlánc transzkripciós aktivitásának mérése során mutattak ki egy olyan szekvenciát, melyhez a NFkB kötődött. (Sen R. Cell 1986; 46: 7516. ) A kutatások elején úgy vélték, hogy ez csak a B lymphocytákban található meg. Az NFkB család tagjai elterjedtek és szerkezetük jól konzerválódott az evolúció során. Közös jellemzőjük, hogy a citoplazmában inaktív formában egy gátló fehérjéhez, az IkBhez kötve találhatók. Aktiválódásuk során leválnak az IkBről és bejutva a sejtmagba szabályozzák egyes gének expresszióját. (Jobin C. Am J Physiol Cell Physiol 2; 278: 45162.) IPC: 4(5+1) AZ NFKB AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE EMSA MÓDSZERREL gel Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Sejtmag extraktok készítése mucosa sejt homegenizátából. A fehérjekoncentráció meghatározása BioRad Protein Assay segítségével. DNAfehérje komplexek elektroforézise polyakrilamid gélen. A gél analízise Cyclone Phosphorlmager Systemmel. Az NFkB fehérjecsalád tagjai: p65 (rela), RelB, crel, vrel, p5 (NFkB1), p52 (NFkB2) Emlősökben a Rel család valamennyi tagja képes homo v. heterodimer formát ölteni, ennek köszönhetően számos dimer kombináció jöhet létre. Ezek közül a dimerek közül a p5p65 heterodimert nevezzük NFkBnek. A fehérje dimerek feladata, hogy különböző környezeti hatásokra szabályozott génátírást indítsanak el, biztosítva ezáltal a citoplazma és a sejtmag közötti kommunikációt. (Das DK. Ann N Y Acad Sci 1994; 723: 29237.) Számos különböző stimulus képes aktiválni ezt a transzkripiós faktor családot. Az OFRs az NFkB fő induktorai. Az NFkB aktivációja redox szabályozás alatt áll. (van den Berg R, Br J Nutr 21; 86: 1217.) S N 5 1 3 1 óra 2 óra (Ferencz et al. Microsurgery 26; 26: 547.) 6

A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA AZ NFKB AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE ELISA MÓDSZERREL (Immunoassay for NFkB kit, Oxford Biomedical Research, Oxford, USA) NFkB aktiváció a citoplazmában (RLU) 16 14 12 3 perccel az IPC után 6 perccel az IPC után 12 perccel az IPC után NFkB aktiváció a sejtmagban (RLU) 16 14 12 3 perccel az IPC után 6 perccel az IPC után 12 perccel az IPC után A VÉKONYBÉL ISCHÉMIÁS PREKONDÍCIONÁLÁSA AZ IPC KÉSŐI HATÁSAINAK VIZSGÁLATA 24 órával az IPC után 1 1 8 8 6 6 4 4 2 2 I II III IV V VI VII VIII IX I II III IV V VI VII VIII IX I: no IPC II: 1+1 III: 2(1+1) IV: 2+2 V: 2(2+2) VI: 4(2+2) VII: 5+1 VIII: 2(5+1) IX: 4(5+1) (Ferencz et al. Transplant Proc 26; 38: 182.) Immunhisztokémia Szöveti HSP72 kimutatása (AntiHeat Shock Protein 7) KÖVETKEZTETÉS Az IPC mérsékelte a konzerválás és reperfúzió hatására kialakuló oxidatív károsodásokat. A konzerválást követő reperfúzió alatt csökkent a PMN leukocyták szabadgyök termelése és nőtt a sejtek DNS károsodása. Az NFkB aktiválódás az IPC után 3 és 12 perccel nőtt. Aktivitása bizázisos jellegű volt és az általunk alkalmazott legrövidebb IPC (1 perc I+ 1 perc R) is fokozta a citoplazmális és nukleáris NFkB aktiválódását. Tehát az IPC mechanizmus vékonybél szövet esetén is a minden vagy semmi törvény szerint működik. Az IPC késői hatásaként kimutattuk a szöveti HSP72 jelenlétét 24 órával az IPC után. A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása DIFFERENCIÁL SCANNING KALORIMETRIA A technikát Watson és O'Neill fejlesztett ki 196ban. Termoanalitikai módszer: vizsgált mintában lezajló szerkezeti átalakuláshoz szükséges hőáram mérésérését teszi lehetővé a hőmérséklet és az idő függvényében. A mért hőáram a minta és a referencia közti hőegyensúly megtartásához szükséges befektetett kompenzációs hőfluxus elektromos teljesítménnyé alakítva (entalpiaváltozás). A minta makromolekuláinak konformációjának megbontásakor a befektetett hő nem a belső energia növelésére, hanem ezek szerkezeti átalakulására fordítódik (minta hőt nyel el, endoterm folyamat). Ha mintánk egy merevebb (stabilabb) struktúrába megy át, akkor a rendszer entrópiája csökken (minta hőt ad el, exoterm folyamat). Garbett et al. Differential scanning calorimetry of blood plasma for clinical diagnosis and monitoring. Exp Mol Pathol 29; 86: 18691. A BÉLSZÖVET OXIDATÍV KÁROSODÁSA MELEG ISCHÉMIA ÉS REPERFÚZIÓ HATÁSÁRA Mucosa DSC Izom DSC Hõáram/mW,5,4,3,2 1 óra meleg ischémia kontroll mucosa,1 3 óra meleg ischémia, 6 óra meleg ischémia,1 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 Hõmérséklet/ o C Hõáram/mW,6,55 1 óra meleg ischémia,5,45,4,35,3 kontroll teljes bélfal,25,2,15,1,5,,5,1 Teljes bélfal DSC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hõmérséklet/ o C Hõáram/mW,6 6 óra meleg ischémia,4,2,,2 3 óra meleg ischémia,4,6 1 óra meleg ischémia,8 kontroll izom,1,12,14,16,18,2,22,24 35 4 45 5 55 6 65 7 75 Hõmérséklet/ o C 6 óra meleg ischémia 3 óra meleg ischémia (Nedvig et al. J Therm Analysis Calorimetry 29; 95: 7759.) 7

A BÉL ISCHÉMIÁS/REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSÁNAK MÉRSÉKLÉSE HIDEG KONZERVÁLÁSSAL Mucosa DSC Izom DSC Hõáram/mW,4,35,3,25,2,15 1 óra hideg ischémia 3 óra hideg ischémia kontroll mucosa,1,5 6 óra hideg ischémia, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 Hõmérséklet/ o C Hõáram/mW Hõáram/mW Teljes bélfal DSC,3 kontroll teljes bélfal 1 óra hideg ischémia,25,2 3 óra hideg ischémia,15 6 óra hideg ischémia,1,16,14,12,1 6 óra hideg ischémia,8,6,4 3 óra hideg ischémia,2,,2,4,6 1 óra hideg ischémia,8 kontroll izom,1,12,14 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 Hõmérséklet/ o C A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok,5,,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hõmérséklet/ o C 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása (Ferencz et al. Thermochimica Acta 21; 497: 415) Megtalálható: PACAP Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide A szekretin/glukagon/vip fehérjecsalád tagja 1989ben Miyata izolálta birka hipothalamusból a hypophysisben kifejtett adenilátcikláz aktiváló hatása segítségével 9% PACAP38, PACAP27, PACAPRelated Peptide braingut (neurointestinális) peptid Hatása: neurotranszmitter felszabadulás szabályozása, neurotrofikus és neuroprotektív vasodilatáció, brochodilatáció Antiapoptotikus, antiinflammatórikus, citoprotektív hatás (Gasz B. Ann N Y Acad Sci 26; 17: 2937.) központi és perifériás idegrendszerben belső elválasztású mirigy (mellékvese/pajzsmirigy, ovari, testis respiratórikus traktus gastrointestinális traktus (pancreas, máj, bél) PACAP A GASTROINTESTINÁLIS TRAKTUSBAN PACAP koncentráció a traktusban (Hannibal J. Cell Tissue Res 1998; 291: 6579.) PACAP38 PACAP receptorok a teljes béltraktusban kimutathatók: (Lauffer et al. 1999; Schulz et al. 24) VPAC1 receptor: mucosa (villus és crypta epithel sejtek), myenterikus neuronok VPAC2 receptor: neuroendokrin sejtek, érfal, simaizom sejtek PAC1 receptor: myenterikus neuronok, simaizom sejtek PACAP kimutatott hatása a traktusban: Szabályozza a gyomorsav elválasztást (Mungan Z. Peptides 1995; 16: 1516.) Vékonybélnedv elválasztást növeli, motilitást csökkenti (De Winter B. Br J Pharmacol 1998;124:11816.) Aktiválja a Protein Kináz At, Thyrozin kinázt, MAPKt (Zhou Y. Pediatr Res 25; 58: 11927.) KÉRDÉSEINK Kísérleti protokoll: Wistar patkányokon meleg I/Rs csoportok létrehozása Meleg I/Rs modellben változike az endogén PACAP38 koncentrációja a vékonybélben? Meleg I/Rs modellben iv. adott PACAP38 milyen hatással van a szöveti károsodásra és a MAPK aktivitásra? S csoport I. Csoport Áloperált: 6 óra Meleg ischémia 1 óra Meleg ischémia 2 óra I Meleg ischémia 3 óra 8

Szöveti PACAP38 (fmol/mg) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 I. Csoport I Szöveti endogén PACAP38 koncentrációs meghatározása Radioimmunoassay segítségével. (Ferencz et al. J Mol Neurosci 29; 37: 16876.) Mean±SEM p<.5 vs. p<.1 vs. Kísérleti protokoll: Wistar patkányokon meleg I/Rs csoportok létrehozása S csoport I. Csoport I IV. Csoport V. Csoport VI. Csoport Áloperált: 6 óra Meleg ischémia 1 óra Meleg ischémia 2 óra Meleg ischémia 3 óra Meleg ischémia 1 óra Meleg ischémia 2 óra Meleg ischémia 3 óra 5 ug bólus, majd 25 ug PACAP38 iv perfúzió. PHOSPHOERK1/2 AKTIVITÁSA AU 45 4 35 3 (Grade ) I. (Grade 2) II. (Grade 3) III. (Grade 5) 25 2 15 1 5 (Grade ) IV. (Grade 1) V. (Grade 2) VI. (Grade 3) PACAP38al kezelt csoportok A bél szöveti károsodásának Parkféle hisztológiai klasszifikációja: grade 5 (Surgery 199; 17: 574.) S S+PACAP I. IV. II. V. III. VI. Appearance of phosphoerk1/2 1I+3R +PACAP38 2I+3R +PACAP38 3I+3R +PACAP38 Mean±SEM p<.5 Immunhisztokémia: Phosphop44/42 MAPK antibody (Cell Signalling ) (Ferencz et al. FEBS J 26; 273: 123.) A1 A2 A3 A4 PA1 PA2 PA3 PA4 B1 B2 B3 B4 PB1 PB2 PB3 PB4 C1 C2 C3 C4 PC1 PC2 PC3 PC4 D1 D2 D3 D4 PD1 PD2 PD3 PD4 PHOSPHOJNK1/2 AKTIVITÁSA PHOSPHOp38 MAPK AKTIVITÁSA AU 6 5 4 3 PhosphoSAPK/JNK antibody (Cell Signalling ) AU 6 5 4 3 2 2 1 1 A1 A2 S S+PACAP I. IV. II. V. III. VI. A3 A4 PA1 PA2 PA3 PA4 B1 B2 B3 B4 PB1 PB2 PB3 PB4 C1 C2 C3 C4 PC1 1I+3R Apperarance +PACAP38 of phosphojnk1/2 2I+3R +PACAP38 3I+3R +PACAP38 PC2 PC3 PC4 D1 D2 D3 D4 PD1 PD2 PD3 PD4 A1 S S+PACAP I. IV. II. V. III. VI. A2 A3 A4 PA1 PA2 PA3 PA4 B1 B2 B3 B4 PB1 PB2 PB3 PB4 C1 C2 C3 C4 PC1 1I+3R Appearance +PACAP38 of phosphop38 2I+3R MAPK +PACAP38 3I+3R +PACAP38 PC2 PC3 PC4 D1 D2 D3 D4 PD1 PD2 PD3 PD4 Immunhisztokémia: PhosphoSAPK/JNK antibody (Cell Signalling ) Mean±SEM p<.5 Mean±SEM p<.5 Immunhisztokémia: Phosphop38 MAP Kinase antibody (Cell Signalling ) 9

PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK Tissue MDA (um/g) 2 18 16 14 12 1 8 6 Wildtype PACAP38 K.O. Tissue GSH (um/g) 12 1 8 6 4 # Wildtype PACAP38 K.O. Vad típusú egerek 4 2 2 I II V I II V I. (1 óra) II. (3 óra) III. (6 óra) Tissue SOD (IU/g) 25 2 15 1 Wildtype PACAP38 K.O. + # Mean±SEM p<.5 vs. +p<.5 vs. ; #p<.5 vs. I; p<.5 vs. II PACAP38 K.O. egerek 5 (Ferencz et al. J Mol Neurosci 21; DOI 1.17/s1231193576) I II V IV. (1 óra) V. (3 óra) VI. (6 óra) A C Mucosal thickness () Depht of the crypts () 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 2 15 1 5 PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK I II I II + # V V W ildtyp e PACAP38 K.O. W ildtyp e PACAP38 K.O. Mean±SEM p<.5 vs. +p<.5 vs. ; #p<.5vs. I; p<.5 vs. II B D Submucosal thickness () Muscle thickness () 6 5 4 3 2 1 15 1 5 I II I II V V W ild typ e PACAP38 K.O. W ildtyp e PACAP38 K.O. KÖVETKEZTETÉS Meleg I/R csökkentette az endogén PACAP38 koncentrációját a bélszövetben. Meleg ischémát követő reperfúzió alatt adott i.v. PACAP38 mérsékelte a szöveti károsodás mértékét. A meleg I/R hatására a bélszövetben csökkent a foszforilált ERK1/2 és emelkedett a JNK1/2 és p38 MAPK aktivitása, triggerelve a programozott sejthalál folyamatát. A PACAP38 kezelés azáltal, hogy fokozta a foszforilált ERK1/2 és csökkentette a JNK1/2 és p38 MAPK aktivitását védő hatással volt a bélszövetben bekövetkező apoptózissal szemben. 2. KÉRDÉSEINK 2. Kísérleti protokoll: Wistar patkányokon vékonybél konzerválás és autotranszplantáció (n=4) Hideg konzerváláskor az oldathoz adott PACAP38 befolyásolja e a szöveti oxidatív stressz mértékét, a struktúrális károsodás kiterjedését és a MAPK aktivitást? Konzerválás Reperfúzió I. 1 óra UW II. 2 óra UW III. 3 óra UW IV. 6 óra UW 3 óra V. 1 óra UW + 3 ug PACAP38 VI. 2 óra UW + 3 ug PACAP38 VII. 3 óra UW + 3 ug PACAP38 VIII. 6 óra UW + 3 ug PACAP38 1

12 1 8 6 Szöveti Malondialdehid (um/g) # # # # 8 5 4 Szöveti Redukált Glutation (um/g) # # # # KontrolL (Grade ) Reperfúzió 4 2 2 I II III IV V VI VII VIII I II III IV V VI VII VIII 12 1 8 Szöveti Szuperoxid Dizmutáz (IU/g) # # # # Mean±SEM p<.5 vs. p<.1 vs. I. (Grade 1) II. (Grade 2) III. (Grade 4) IV. (Grade 5) 6 4 2 I II III IV V VI VII VIII (Ferencz et al. Transplant Proc 29; 41: 579.) V. (Grade 1) VI. (Grade 1) VII. (Grade 3) VIII. (Grade 4) (Ferencz et al. J Mol Neurosci 29; 37: 16876.) PHOSPHOERK1/2 AKTIVITÁSA AU 45 4 35 3 25 2 15 1 5 I II V I II PACAP38al kezelt csoportok Mean±SEM p<.5 Immunhisztokémia: Phosphop44/42 MAPK antibody (Cell Signalling ) PHOSPHOJNK1/2 AKTIVITÁSA AU 6 5 4 3 2 1 I II V I II PACAP38al kezelt csoportok Immunhisztokémia: PhosphoSAPK/JNK antibody (Cell Signalling ) Mean±SEM p<.5 (Ferencz et al. Transplant Proc 29; 41: 62.) PHOSPHOp38 MAPK AKTIVITÁSA AU 6 5 Tissue MDA (um/g) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK Wildtype PACAP38 K.O. # Tissue GSH (um/g) Wildtype PACAP38 K.O. 9 8 7 6 5 4 3 2 4 2 1 3 I II V I II V 2 1 I II V I II PACAP38al kezelt csoportok Mean±SEM p<.5 Immunhisztokémia: Phosphop38 MAP Kinase antibody (Cell Signalling ) Tissue SOD (IU/g) 25 2 15 1 5 I II W ildtype PACAP38 K.O. V Mean±SEM p<.5 vs. #p<.5 vs. I; p<.5 vs. II (Ferencz et al. J Mol Neurosci 21; DOI 1.17/s123119352y) 11

PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK PACAP38 K.O. VIZSGÁLATOK Vad típusú egerek A 1 9 W ildtype PACAP38 K.O. B 6 W ildtype PACAP38 K.O. Mucosal thickness () 8 7 6 5 4 3 2 + Submucosal thickness () 5 4 3 2 1 1 I (1 óra konzerválás) II (3 óra konzerválás) III (6 óra konzerválás) I II V I II V PACAP38 K.O. egerek C 25 W ildtype PACAP38 K.O. D 15 Wildtype PACAP38 K.O. Depht of the crypts () 2 15 1 Muscle thickness () 1 5 5 I (1 óra konzerválás) II (3 óra konzerválás) III (6 óra konzerválás) I II V I II V (Ferencz et al. Transplant Proc 21; DOI: 1.116/j.transproceed.21.5.14) Mean±SEM p<.5 vs. +p<.5 vs. ; p<.5 vs. II KÖVETKEZTETÉS A KUTATÁS FŐ IRÁNYVONALAI A konzerváló oldathoz adott PACAP38 csökkentette a szöveti oxidatív stressz mértékét és mérsékelte a strukturális károsodást. A PACAP38 kezelés fokozta a foszforilált ERK1/2 és csökkentette a JNK1/2 és p38 MAPK aktivitását, így a konzervált bélszövetben antiapoptotikus védő hatást fejtett ki. Eredményeinket a PACAP38 K.O. egerekkel végzett vizsgálatok is megerősítették. 1. A bélszövet oxidatív károsodása meleg ischémia és reperfúzió hatására 2. A bél ischémiás/reperfúziós károsodásának mérséklése hideg konzerválással 3. A vékonybél ischémiás prekondícionálása 4. Differenciál Scanning Kalorimetriás vizsgálatok 5. PACAPal végzett vizsgálatok 6. A vékonybél ischémiás posztkondícionálása 23. VintenJohansen írta le szívizomban. (Am J Physiol Heart Circ Physiol 23; 285: 579.) Perfúzió Ischémia IPO Reperfúzió IPCnél leírt jelátviteli utak aktiválódnak (VintenJohansen et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 23; 285: 579.; Halkos et al. Ann Thorac Surg. 24;78: 961.; Tsang et al. Circ Res 24; 95: 23.) Prosurvival kinázok (RISK: Reperfusion Injury Salvage Kinase) aktiválódnak (PI3PKAkt, ERK1/2) KÉRDÉSEINK Meleg I/Rs modellünkben IPO hatására csökken e a bélszövetben bekövetkező oxidatív és morfológiai károsodás? Hatás: Mitokondriok ATPdependens K + csatornáinak kinyitása: szabályozza a mitokondriba beáramló K + mennyiségét mitokondriok Ca 2+ feltöltődése az ATP szintézis Az apoptózis 12

Kísérleti protokoll: sertéseken (n=2) meleg ischémia/reperfúzió vizsgálata Csoportok: I. 1 óra meleg ischémia + 3 óra reperfúzió II. 3 óra meleg ischémia + 3 óra reperfúzió III. 6 óra meleg ischémia + 3 óra reperfúzió IV. 1 óra meleg ischémia + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió V. 3 óra meleg ischémia + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió VI. 6 óra meleg ischémia + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió ol/g 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Szöveti MDA I II V IU/g 3 25 2 15 1 5 I II ol/g 15 14 13 12 11 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Szöveti SOD V Szöveti GSH I II V (Ferencz et al. Transplant Proc 21; DOI:1.116/j.transproceed.21.5.24) Mean±SE p<.5 Qualitatív meghatározás (Parkféle klasszifikáció) (Grade ) Quantitatív meghatározás (Scion Image Software) Mucosa vastagsága 1 9 8 7 6 5 Submucosa vastagsága 6 5 4 3 4 3 2 2 1 1 I. (Grade 2) II. (Grade 3) III. (Grade 5) 2 I II V Crypták mélysége 15 I II Izom vastagsága V Mean±SE p<.5 15 1 1 5 5 IV. (Grade 1) V. (Grade 2) VI. (Grade 3) I II V I II V KÉRDÉSEINK Kísérleti protokoll: sertéseken (n=2) hideg konzerválás UWban és autotranszplantáció Hideg konzerválást követő autotranszplantációs modellnkben IPO hatására csökken e a bélszövetben bekövetkező oxidatív és morfológiai károsodás? Csoportok: I. 1 óra hideg konzerválás UW oldatban + 3 óra reperfúzió II. 3 óra hideg konzerválás UW oldatban + 3 óra reperfúzió III. 6 óra hideg konzerválás UW oldatban + 3 óra reperfúzió IV. 1 óra hideg konzerválás + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió V. 3 óra hideg konzerválás + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió VI. 6 óra hideg konzerválás + IPO 3(3 I+3 R) + 3 óra reperfúzió 13

Szöveti MDA ol/g 2 18 16 14 12 1 ol/g Szöveti GSH 9 8 7 6 5 Qualitatív meghatározás (Parkféle klasszifikáció) (Grade ) 8 4 6 3 4 2 2 1 I II V I II V IU/g 25 2 Szöveti SOD Mean±SE p<.5 I. (Grade 1) II. (Grade 3) III. (Grade 4) 15 1 5 V (Ferencz et al. Transplant Proc 21; DOI:1.116/j.transproceed.21.5.23 ) I II IV. (Grade 1) V. (Grade 2) VI. (Grade 3) Quantitatív meghatározás (Scion Image Software) Mucosa vastagsága 1 9 8 7 6 5 6 5 4 3 Submucosa vastagsága KÖVETKEZTETÉS Az IPO csökkentette mind a meleg I/R, mind a hideg konzerválás és autotranszplantációt követő oxidatív és morfológiai károsodások mértékét. 4 3 2 1 I II Crypták mélysége V 2 2 1 15 I II V Izom vastagsága Mean±SE p<.5 További vizsgálatokat tervezünk a protektív folyamatok hátterének tanulmányozására. 15 1 1 5 5 I II V I II V ÖSSZEFOGLALÁS Megállapítottuk, hogy a bélszövet az I/R hatásokkal szemben érzékenyen reagál oxidatív stressz kivédésében szerepet játszó endogén antioxidáns védelem kapacitása jelentősen csökken hisztológiai módszerekkel a mucosa, a submucosa és a crypták károsodása kimutatható DSC igazolta az izomszövetben is bekövetkező strukturális változásokat a károsodások csökkenthetők hideg konzerválással az IPC és IPO a szervezet védő mechanizmusainak aktiválása révén protektív endogén adaptációs utakat aktivál az endogén PACAP38 mennyisége csökken I/R hatására a szisztémásan és a konzerváló oldathoz adott PACAP38 csökkentette az oxidatív és morfológiai károsodások mértékét A béltranszplantáció sikerességéhez az immunológiai egyezés mellett a konzerválás qualitásának javítása is alapvető fontosságú. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS PTE ÁOK Sebészeti Oktató és Kutató Intézet Prof. Dr. Wéber György Prof. Dr. Rőth Erzsébet Dr. Temes Gyula, Dr. Lantos János Dr. Szántó Zalán, Dr. Borsiczky Balázs Dr. Rácz Boglárka, Dr. Mohamed T. Jaberansari Dr. Jancsó Gábor, Dr. Gasz Balázs Dr. Cserepes Barbara, Dr. Benkő László Dr. Ferencz Sándor, Dr. Horváth Szabolcs Dr. Takács Ildikó, Dr. Balatonyi Borbála Dr. Jávor Szaniszló, Dr. Koba Shanava Dr. Süvecz Györgyné, Karádiné Sztárai Mária Pintérné Henrich Éva, Tóthné Fajtik Csilla Abrudbányai Katalin, Horváth Beáta Gelencsér Györgyné, Bakainé Matus Ilona Csizmadia Jánosné, TDK hallgatók Kutatásokat támogató pályázatok: 2427. OTKA F46593 29212. OTKA PD 77474 2711. MTA Bolyai János Ösztöndíj PTE ÁOK Tudományos Bizottsága NKTH Mecenatúra Pályázatok Pécsi Szervátültetés Fejlesztéséért Alapítvány PTE ÁOK Sebészeti Klinika Prof. Dr. Horváth Őrs Péter Dr. KalmárNagy Károly Dr. Afsin Tavakoli PTE Anatómiai Intézet Dr. Reglődi Dóra Dr. Tamás Andrea Dr. Lubics Andrea Dr. Kiss Péter Dittrich Erzsébet PTE Biofizikai Intézet Prof. Dr. Lőrinczy Dénes PTE Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet Dr. Rácz Boglárka PTE Orvosi Biológiai Intézet Prof. Dr. Szeberényi József Dr. Kiss Katalin DE Gyógyszertani Intézet Dr. Németh József 14