QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen 704545 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA), amely az IgA és IgG antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál a human szérum szintetikus, deamidált gliadin-származék peptideiben. E deamidált peptid antitestek jelenléte felhasználható a klinikai eredményekkel és egyéb laboratóriumi tesztekkel együtt az IgA szufficiens és IgA deficiens coeliakia valamint a dermatitis herpetiforms diagnózisának elősegítésére. A teszt összegzése és magyarázata A coeliakia, vagy glutén szenzitív enteropathia egy krónikus álapot, melynek legfőbb jellemzője az intestinalis mucosa gyulladása és az epithelium jellegzetes szövettani ellapulása, ami malabsorptiós szindrómát eredményez. A betegség pontos etiológiája még nem ismert, de a gliadin, vagyis a búza gluténjének alkoholos extraktuma nyilvánvalóan a toxikus ágens. 1 Eredetileg egy sor többszörös vékonybél biopsiára volt szükség a coeliakia és a hozzá kapcsolódó kórképek diagnózisának felállításához. Újabban szerológiai vizsgálatokat ajánlanak szűrésre glutén szenzitív enteropathia gyanúja esetén, valamint később a diéta megtartásának ellenőrzésére. 2-5 Az Europan Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) javasolja a szerológiai markerek használatát, mint amilyen az anti-gliadin, a reticulin és az endomysium ellenes antitestekkel együtt, annak érdekében, hogy a diagnózis felállításához szükséges biopsiák számát redukálni lehessen. 6 A közelmúltban végzett kutatómunkák során felderítették, hogy a coeliakiás betegekből származó gliadin-reaktív antitestek igen korlátozott számú specifikus epitópot kötnek meg a gliadin molekulán. 7,8 Ugyanezen vizsgálatok során az is kiderült, hogy a gliadin szelektív deamidálása, amelyet szöveti transzglutamináz enzimmel végeztek, az anti-gliadin antitestek általi megnövekedett kötődést eredményezett. A fenti megfigyelések alapján, deamidált és meghatározott peptidek alkalmazásával végzett assay-k esetében kimutatták, hogy a coeliakiára vonatkozóan utóbbiaknak nagyobb a diagnosztikai pontosságuk a standard anti-gliadin és ttg assay-khez viszonyítva. 9,10,11 Glutén szenzitív enteropathia eseteiben mind az IgA, mind pedig az IgG osztályba tartozó gliadin antitestek kimutathatók a betegek szérumában. 2,3 A veszélyeztetett populációkat érintő érzékeny szűrési stratégia magában foglalja az IgG és az IgA antitestekre vonatkozó tesztelést egyaránt, mivel a coeliakiás betegek jelentős arányban IgA-deficiensek. 12 A Gliadin IgA antitestek érdeklődésre tarthatnak számot a betegség időbeli lefolyásának követése, valamint a gluténmentes diéta betartásának megfigyelése szempontjából. 5 A dermatitis herpetiformis (DH) olyan bőrbetegség, amelyet, csakúgy, mint a coeliakia esetében, a búzafehérje fogyasztása okoz. A DH-ban szenvedő betegek többsége esetén a coeliakiában tapasztalttal azonos jejunális villosus atrophia jelentkezik, és a szigorú gluténmentes diéta a mind a bél, mind a bőr laesióit javítja. 13, 14 A jelenlegi szerológiai módszerek, mint például az EMA és a ttg assay-k, a DH-ra vonatkozó tesztelés során 60-75% közötti érzékenységükkel nem nyújtanak kielégítő teljesítményt 15,16, a coeliakia esetében leírt 95%-os vagy annál magasabb érzékenységgel összehasonlítva. A QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen javított teljesítményű teszt, amely az IgG és az IgA antitestek szimultán detektálására alkalmazható, a gliadin búzafehérjéből származó szelektíven deamidált, szintetikus fehérjéhez való kötődése során, s így lehetővé teszi a coeliakia kimutatását koegzisztens IgA deficiencia esetében is. 1
A módszer elve A tisztított, szintetikus gliadinpeptidek olyan körülmények között kötődnek a polisztirol microwell lemez mélyedéseihez (well), amelyek az antigént natív formában megőrzik. Az előzetesen hígított kontrollmintákat és a hígított betegszérumokat eltérő mélyedésekhez adják, lehetővé téve bármely jelenlévő gliadin peptid IgA vagy IgG antitest számára, hogy az immobilizált antigénhez kötődjön. A megkötetlen mintát lemossák és mindegyik mélyedéshez enzimjelölt anti-humán IgA és IgG konjugátumot adnak. A második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgA és/vagy IgG minden olyan beteg antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a mikromélyedéshez (microwell) kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt anti-humán IgA és/vagy IgG lemosása után a fennmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított gliadin peptidek (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 puffert tartalmazó ampulla, amely tartósítószert és humán szérumot tartalmaz, gliadin peptidekhez kötődő humán IgA vagy IgG antitestek nélkül, előhígítva, 1.2mL 3. Celiac DGP Screen ELISA Low (mérsékelten pozitív kontroll), 1 puffert tartalmazó ampulla, amely tartósítószert és humán szérumot, valamint gliadin peptidekhez kötődő humán IgA és IgG antitesteket tartalmaz, előhígítva, 1.2mL 4. Celiac DGP Screen ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 puffert tartalmazó ampulla, amely tartósítószert és humán szérumot, valamint gliadin peptidekhez kötődő humán IgA és IgG antitesteket tartalmaz, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP Ig G/A Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG és IgA, 1 üveg színtelen, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 17 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet 2
képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. 3
Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 18 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 Celiac DGP Screen A ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll előhígítva 1 1.2mL Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP Ig G/A Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG és IgA 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 4
felhasználandó mérőhely számára adjon 2.0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. A Gliadin IgA és vagy IgG antitestek jelenlétének vagy hiányának meghatározása céljából használjon mindhárom kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérskleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP Ig G/A Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3. lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. 5
Minőség-ellenőrzés 1. A Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív, a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív, a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0- nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. Az ELISA negatív kontroll és a Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll a reagens minőségének jelentősebb eltérését kontrollálja. A Celiac DGP Screen ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást az assay küszöb (cutoff) koncentrációja közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 19 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Az eredményt megszorozza a Celiac DGP Screen ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén található egységek mérőszámával. Minta OD Minta éretéke = x Celiac DGP Screen ELISA mérs.poz.kontroll (egység) Celiac DGP Screen ELISA mérs.poz.kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. 6
Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, gyengén pozitív, mérsékelten vagy erősen pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív 20-30 Mérsékelt vagy erősen pozitív >30 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában gliadin IgA és/vagy IgG antitestek vannak, és felveti bizonyos glutén szenzitív enteropathiák, mint a coeliakia és a dermatitis herpetiformis fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs gliadin IgA vagy IgG antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott anti-gliadin IgA vagy IgG értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgA érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. A kezeletlen beteg esetében tapasztalt negatív eredmény nem zárja ki teljesen a gluténszenzitiv enteropathiát. A negatív minták újratesztelhetők egyéb coeliakiával kapcsolatos antitestekre vonatkozóan, mint például anti-endomysium (EM) vagy szöveti transzglutamináz (ttg). 2. Kezelt betegekben, akikről ismert, hogy IgA antitesttel rendelkeztek, a gliadin IgA antitest eredmény jobban jelzi a diéta megtartását, mint a gliadin IgG antitest koncentrációja. 5 3. Téves pozitív eredmény (nagy antitest koncentráció jellegzetes hisztológiai eltérések nélkül) előfordulhat. Ritka esetben egyéb gastrointestinalis betegségek és normál minták esetén is előfordulhatnak a DGP antigénnel reagáló antitestek. 4. A dermatitis herpetiformis és a glutén-szenzitív enteropathia asszociációja olyan erős, hogy valószínűnek tartják, hogy a két betegség etiológiája közös, ezért a DGP antitest meghatározása az ilyen betegekben is hasznos a tünetmentes coeliakia felfedezése, és a gastrointestinális érintettség súlyosságának becslése céljából. 13,14 5. A jelen teszt egyidejűleg mutatja ki az IgA és az IgG antitesteket. Ha a specifikus IgA vagy IgG antitestek egyéni meghatározására van szükség, az INOVA külön IgA és IgG ELISA készleteket (QUANTA Lite TM Gliadin IgA II és QUANTA Lite TM Gliadin IgG II) is biztosít erre a célra. 6. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 7. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek A QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen gliadin IgG és IgA antitestek kimutatására való alkalmasságát a QUANTA Lite TM Gliadin IgA II és a QUANTA Lite TM Gliadin IgG II ELISA tesztekkel összehasonlítva értékelték ki. 7
Referens tartomány Négyszázkilencvenhét random, tünetmentes, egészséges, az USA-ban élő egyént teszteltek a DGP antitesteire vonatkozóan. Ezek közül, háromszáz donor 14-től 78 évesig terjedő korcsoportban volt, és egyenlő arányban voltak köztük nők és férfiak. Négy minta (0.8%) a 20-egységes cutoff-érték felett volt. Kettő gyenge pozitív eredményt adott, 20.1 illetve 20.2 egységnyi értékkel, egy pedig mérsékelten pozitív volt 46.6 egységnyi eredménnyel. A negyedik pozitív eredményt, 25.4 egységgel, a vizsgálatot végzők véleménye szerint valódi coeliakiás beteg adta, abból kiindulva, hogy a minta úgyszintén erős pozitív eredményt adott a szöveti transzglutaminázhoz kötődő IgA antitestekre vonatkozóan (57 egység). A 497 minta középértéke 3.17 egység volt. A minták standard deviációja 3.0 egység volt. A középérték hatszoros standard deviáció a 20-egységes cutoff alatt. Konkrét teljesítmény jellemzők Referenciaeszközökkel való összehasonlítás Három, coeliakiával foglalkozó referencialaboratóriumból származó százegy mintát teszteltek belső eljárással a QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen, QUANTA Lite TM Gliadin IgA II és a QUANTA Lite TM Gliadin IgG II ELISA tesztekkel. Ezek az eredmények, valamint a 497 normál minta az alábbi diagramon szerepelnek: N= 598 Gliadin IgG II és /vagy Gliadin IgA II Pozitív Negative Celiac DGP Screen Pozitív 39 3* Negatív 11** 545 Pozitív százalékos egyezés: 39/50 (78.0%) Negatív százalékos egyezés:545/548 (99.4%) Összesített egyezés: 548/598 (91.6%) Abból a 3 mintából, amelyet a Celiac DGP Screen során pozitívnak, de mindkét Gliadin II készlet esetén negatívnak találtak, 2 gluténmentes diétában részesülő coeliakiában szenvedő beteg volt 28.7 és 20.9 egységgel. A harmadik beteg coeliakiás beteg közeli rokona volt 20.2 egységgel. **Abból a tizenegy mintából, amelyet a Celiac DGP Screen során negatívnak, de valamelyik Gliadin II készlet esetén pozitívnak találtak, 9 származott a normál vizsgálatból. A fennmaradó két minta mindegyikét gluténmentes diétában részesülő, coeliakiában szenvedő beteg adta. Az egyik 20.1 egységet adott a Gliadin IgG II teszten, a másik pedig 25.3 egységet a Gliadin IgA II teszten. Klinikai vizsgálatok A klinikailag coeliakiás betegek, IgA-deficiens coeliakiás betegek, gluténmentes diétában részesülő coeliakiás betegek, coeliakiás beteg elsőfokú rokonai, dermatitis herpetiformisban szenvedő betegek, IgA deficiens kontrollok vagy coeliakiában nem szenvedő betegek által meghatározott mintákat belső és külső klinikai vizsgálatok során tesztelték a QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen alkalmazásával. Az alábbi táblázat a klinikailag meghatározott minták, valamint a fent említett, normál tartományba eső minták közül 517 összegzését tartalmazza. 8
Betegcsoport Szám Pozitív Celiac DGP Screen % Coeliakiás 85 81 95.3% Coeliakiás IgA deficiens 50 50 100% Coeliakiás gluténmentes diétán 33 9 27% Elsőfokú rokonok 18 2* 11% Dermatitis herpetiformisban szenvedők 65 59** 91% IgA deficiens kontrollok 36 0 0% Nem coeliakiás betegek 81 1 1.2% Normál minták 517 4*** 0.8% *Az egyik rokon 41.3 egységnyi értéket, s mind a h-ttg-re, mind az EMA-ra pozitív eredményt mutatott. A második 20.2 egységnyi értéket, s mind a h-ttg-re, mind az EMA-ra negatív eredményt mutatott. **Ugyanezen betegcsoportban csak 54 vagy 83% volt h-ttg pozitív és a 65 személy közül 6 esetében a bél nem játszott szerepet (Marsh 0 biopszia). ***E 4 mintából az egyik 20.1 egységet, egy másik pedig 20.2 egységet mutatott. A cutoff érték 20 egység. A 4 minta újabb tagja pedig 25.4 egységet mutatott, és a h-ttg-re erősen pozitív eredményt, ő ténylegesen coeliakiás beteg lehet. A Celiac DGP Screen ELISA teljesítménye a coeliakia diagnózisával: QUANTA LITE DGP Screen Érzékenység: 97% (131/135) Specificitás: 99.2% (629/634) Diagnózisával Pozitív Negatív (Beteg kontrollok és egészséges kontrollok) Pozitív 131 5 136 Negatív 4 629 633 Total 135 634 769 Összesen Érzékenység A coeliakiára vonatkozó összesített érzékenységet a 85 coeliakiás, valamint az 50 IgA deficiens coeliakiás eredményeinek csoportosításával számoljuk. A coeliakiások teljes száma 135, melyből 131 páciens, vagy 97% pozitív. Specificitás A specificitás az 517 normális tesztalany (beleértve a h-ttg-pozitív mintát), a 81 coeliakiában nem szenvedő kontroll és a 36 IgA-deficiens kontroll csoportosításával számítható ki. E csoport összesen 634 mintát tartalmaz. Ezek közül csak 5 minta volt pozitív 99.2%-os specificitással. Kereszt-reaktivitás A más autoantitestekkel lehetséges kereszt-reaktivitás miatt várható problémák felmérése céljából különböző nagy titerű autoantitest pozitív mintákat vizsgáltak a QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen kittel. Összességében 86 mintát teszteltek. Közülük több minta más INOVA QUANTA Lite TM autoantitest kitekhez tartozó erősen pozitív kontroll volt. A minták között található kettős szálú Centromere (4), Actin (4) Sm (9), SS-A (12), RNP (9), Jo-1 (9), SS-B (8), Scl-70 (8), GBM (4), MPO (6), RF (5) Ribo P (4) and M2 (4). Ennek a 86 mintának az átlagos eredménye 2.40 egység lett. Az összes minta negatív volt a QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen teszten. A középérték nyolcszoros standard deviáció a 20-egységnyi cutoff alatt. 9
Precizitás és reprodukálhatóság A QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA intra-assay teljesítményét 13 minta egyenként 5-ször ismételt tesztelésével értékelték ki. Az eredmények az alábbiakban láthatók. Intra-assay teljesítmény of QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Közepes egységek 57.5 51.8 102.0 27.5 121.0 162.0 7.9 4.6 5.3 17.7 25.0 17.4 23.4 SD 0.3 1.4 0.9 0.4 1.3 2.8 0.4 0.2 0.1 0.4 0.7 0.4 0.7 CV % 0.5 2.7 0.9 1.6 1.1 1.7 4.7 4.1 2.6 2.2 2.8 2.2 2.8 Inter-assay változás vizsgálata során 3 napig kétszeresen teszteltek egy 8 mintából álló panelt, valamint az diagnosztikus eszköz magas pozitív kontrollját (high positive control) napjában kétszer (reggel és délután egyszer-egyszer). A vizsgálat eredményeinek összegzése az alábbiakban látható. Inter-assay teljesítmény for QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA HPC A B C D E F G H Közepes egységek 110.4 54.6 48.5 27.5 157.9 9.8 16.4 22.2 18.8 SD 3.4 1.4 1.9 1.0 3.8 0.6 0.1 0.7 0.6 CV% 3.0 2.5 3.8 3.6 2.4 5.8 4.7 3.2 3.4 10
Hivatkozások 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: 1709-1719, 1991. 2. Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: 150-158, 1991. 3. McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: 1163-1165, 1991. 4. Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: 403-506, 1992. 5. Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: 941-947, 1991. 6. Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: 909-911, 1990. 7. Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: 248-254, 2000. 8. Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clinical Chemistry 47: 2023-2028, 2001. 9. Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 50: 2370-2375, 2004. 10. Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Glidin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 13: 150-151, 2006. 11. Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 4: 1112-1117, 2006. 12. Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand Journal Gastroenterology 27: 367-371, 1992. 13. Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July 202-211,1986. 14. Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: 335-341, 2005. 15. Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitus herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: 464-473, 1986. 16. Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117:749-750, 1999. 17. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 18. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), 2004. 19. CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), 2006. 11
A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 624545HUN August 2008 Revision 0 12