Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Scholtz Beáta Molekuláris Terápiák 2. előadás FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.
FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez. 1.1 DEFINÍCIÓK 1.2 A BETEGSÉGEKRŐL 1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI 1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei 1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért 1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek 1.3.4 Genom microarray-k 1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (acgh)
Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért Ki tartozik a magasabb kockázatú csoportba (Prognózis) Kinél várható jó (vagy gyenge) terápiás válasz Alternatívák a kemorezisztens rákok kezelésére Létező és új gyógyszerek hatékonyabb alkalmazása Gyógyszerek egyedi kombinációinak kidolgozása 4
Herceptin: a páciensek kiválasztásának fontossága Összes emlőtumoros páciens Her2+ emlőtumoros páciensek Herceptin Herceptin 10% válasz 35-50% válasz Alkalmazható-e ugyanez az általános kemoterápiás kezeléseknél is? 5 Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
Előrehaladott stádiumú petefészekrák Jelenlegi protokoll Műtét Primer kemoterápia Platina/taxán 70% teljes válasz 30% részleges válasz Kiújuló betegség Másodlagos kemoterápia 10-20% válasz 80-90% nincs válasz Inaktív ágensek - szükségtelen toxicitás Sok pácienst kezelnek eredmény nélkül 6 Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
NCI-60 sejtvonal panel Kemorezisztens tumorok kezelésének újabb lehetőségei rezisztens és érzékeny sejtvonalak azonosítása expressziós prediktor a válasz előrejelzésére - Kemoterápiás válasz adatai - Affymetrix expressziós adatok több mint 50 gén Kemoterápiás válasz prediktív profil rezisztens érzékeny 14 sejtvonal 7 Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007
8 Potti et al. Nat Med 2006
Expressziós mintázat egyéb kemoterápiás ágensekre - ugyanaz az alapelv Génlista NCI-60 sejtekre 9 Potti et al. Nat Med 2006
Páciensadatok (petefészekrák) Már meglévő génexpressziós adatok a GEO adatbázisból Valószínűségi szám, Potti et al. által hozzárendelve Kemoterápiás válasz adata ua. kísérletből Potti et al. Nat Med 2006 10
Korreláció onkogén szignál útvonalak aktivációja és kemorezisztenciák között: Kombinációs terápia az útvonalakat célzó gyógyszerekkel? src: SU6656 PI3K: LY-294002 11 Potti et al. Nat Med 2006
Miért tanulmányozzuk a tumorok DNS-ét? A sejtbéli információ alapvető tárhelye Ugyanazok a DNS aberrációk ismétlődnek a tumorokban - nem hagyható figyelmen kívül! Bizonyos fajta DNS aberrációkra nagyon hatékony, általános vizsgálómódszerek léteznek A DNS meglehetősen stabil, és sokféleképpen kezelt mintákban is analizálható, pl. kórházi laborokból származó archív szövetmintákban. 12
Sokféle genetikai aberráció okozhat fejlődési rendellenességet vagy betegséget Pontmutáció - egy vagy néhány bázis megváltozása - megváltozik a protein vagy az expressziós szintje Gén egyik kópiája elvész - expressziós szint csökkenése (tumorszuppresszor elvesztése) Extra génkópia - expressziós szint nő (onkogén aktiváció) Génpromoter metilációja/demetilációja - expressziós szint csökken/nő (tumorszuppresszor elvesztése/ onkogén aktiváció) A DNS törése és a végek aberráns újracsatlakozása új géneket eredményezhet. 13
Genetikai aberrációk térképezése Pozíció finomítása Gén azonosítása Aberráció térképezése Prognózis, diagnózis, progresszió, stádiumok, terápia választás genetikai háttere Génspecifikus terápia Valószínűsíthető gén/útvonal teljes biológiai analízise 14
Genom microarray-k Definíció: Felhasználás: Jelentőség: Olyan microarray technológia, mely a kromoszóma aberrációkat detektálja Klinikai laboratórium: fluroeszcens in situ hibridizációval (FISH) komplementer technológia Kutatólaboratórium: azonosíthatja a betegségek genetikai hátterét Sok betegséget mikrodeléciók és olyan egyéb kromoszóma aberrációk okozhatnak, melyeket a FISH technika nem detektál. SNP array-k még jobb felbontást biztosítanak, és a genotípusról és kópiaszámról is adnak információt. 15
Sokféle microarray, különböző célkitűzésekhez 16
Array összehasonlító genom hibridizáció (comparative genomic hybridization, CGH) Microarray alapú összehasonlító genom hibridizáció Nem az RNS, hanem a DNS mennyiségét méri Két mintát hasonlít össze: Teszt minta Referencia minta Nagy felbontás 1-3 Mb (teljes genom array CGH), vagy 10-25 kb (oligó acgh) vs 5-10 Mb (kariotipizálás) Időigény : 3-4 nap (array CGH) vs 2-4 hét (kariotipizálás) Egyszerű DNS preparálás az acgh-hoz, szemben a metafázisos kromoszómák analízisével 17
Array CGH Tumorokban előforduló genetikai átrendeződések detektálása (tumor genom és normál genom összehasonlítása) Genom kópiaszám variációk analízise szegregálódó variánsok léteznek a populációban Bizonyos patogén variánsok betegségekkel asszociálódnak Beteg és egészséges egyének genomjának összehasonlítása Genetikai markerekkel kapcsolt, ismert próbák használata a betegségek jobb megértésehez vezethet 18
Arány Array CGH: azonosítja a DNS kópiaszám változásokat, és pozíciójukat a genomban Teszt genom DNS Referencia genom DNS Extra DNS kópiák a tumorban DNS vesztés a tumorban pozíció a szekvenciában 19
Egy tumorgenom array CGH analízise Extra Vesztett 20
A tumorok kópiaszám profilja két folyamatot tükröz Olyan génexpressziós változások szelekciója, melyek a tumor kialakulásának kedveznek. Bizonyos genetikai aberrációk együttesének megtartása szelektív előnyt jelent. A genetikaiminstabilitás többféle mechanizmus révén indukál változásokat a genomban. (Iniciáló onkogén események egérmodellekben és metotrexát rezisztencia MMR deficiens és proficiens sejtvonalakban) 21
acgh hasznosítása a rákkutatásban Az eredmények alapján jobb tesztek alakíthatók ki, melyek az onkogének és tumor szuppresszor gének kópiaszámát detektálják Tumorprogresszió monitorozása, korai és metasztatikus léziók megkülönböztetése FISH próbákkal, melyek a több tumortípusban megfigyelhető kópiaszámváltozások régióit detektálják. További kópiaszám markerek azonosítása, melyek tumor predikcióra alkalmasak A tumorok kialakulásában közreműködő gének azonosítása és analízise segíthet olyan új gyógyszerek tervezésében, melyek a diszfunkcionális géneket/útvonalakat veszik célba, és/vagy nem okoznak terápia rezisztenciát. 22
Elváltozások egy tumorsejtvonal genomban: Kromoszomális és microarray alapú CGH megfeleltetése Amplifikációk: aktivált onkogének Deléciók: Inaktivált gének (tumorszuppresszorok) 23
A SNP array-k ereje: loss-of-heterozygosity detektálása, kópiaszám változás hiányában is Tan DSP et al. Laboratory Investigation 2007. 87:737 24
SNP adatbázisok dbsnp az NCBI honlapon http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp Humán SNP adatbázis (Whitehead Institute) http://www.broad.mit.edu/tools/data/genvar.html A SNP Konzorcium (TSC) http://snp.cshl.org J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics 25
26
Új terápiás célpontok azonosítása: a felülről lefelé módszer Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63 27
Új terápiás célpontok azonosítása: a lentről felfelé módszer Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63 28
Myeloma multiplex acgh analízise 55 MM sejtvonal, 73 páciens minta Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313 29
Myeloma multiplex acgh analízise: prognosztikus besorolás hiperdiploid: k1, k2 nem-hiperdiploid: k3,k4 Konklúzió: ch11 extra : jobb prognózis ch1q extra: rosszabb ch13 vesztés: rosszabb Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313 30
Myeloma multiplex kombinált génexpressziós és acgh analízise Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313 31
Laphámsejtes tüdőrák acgh analízise A: Összes minta PIK3CA 3q26.2-q27.3 B: Magas kópiaszám változások Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372 32
Laphámsejtes tüdőrák acgh analízise: PIK3CA expressziós szintek és amplifikáció korrelációja Új terápiás célpont? Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372 33
A PIK3/Akt/mTOR szignál transzdukciós útvonal 34
Klinikai kipróbáláson levő PI3K inhibitorok jellemzői Ihle N T, Powis G Mol Cancer Ther 2009;8:1-9 35