MIKROSZKÓPIA AZ ORVOS GYÓGYSZERÉSZ GYAKORLATBAN - DIAGOSZTIKA -TERÁPIA például: szemészet nőgyógyászat szövettan bakteriológia patológia gyógyszerek fejlesztése, tesztelése Modern mikroszkópiai módszerek 1 Bugyi Beáta - PTE ÁOK Biofizikai Intézet A mikroszkópia segítségével láthatóvá tehetjük az élő rendszerek különböző szerveződési szintjeit: szervektől (cm 10 - m) egyedi molekulákig (nm 10-9 m). 7 nagyságrend!! Modern mikroszkópiai módszerek TEMATIKA 1. A mikroszkópiáról általában. A mikroszkópiai módszerek csoportosítása 3. A mikroszkóp képalkotásának általános elvei 4. Fénymikroszkópia fáziskontraszt mikroszkópia sztereomikroszkópia fluoreszcencia mikroszkópia konfokális evaneszcens mező: TIRFM emisszió stimulált gyengítése: STED Förster rezonancia energia transzfer: FRET 5. Elektronmikroszkópia 6. Pásztázószondás mikroszkópia Modern mikroszkópiai módszerek 3 Modern mikroszkópiai módszerek 4 MI AZ AMIT TUDNUNK KELL, HOGY MEGÉRTSÜK 1. GEOMETRIKAI OPTIKA fény törés, visszaverődés lencsék képalkotása fókusz lencsehibák: színi hiba (kromatikus aberráció) gömbi hiba (szférikus aberráció) asztigmatizmus. HULLÁMOPTIKA elhajlás (diffrakció) polarizáció lézer 3. FLUORESZCENCIA élettartam anizotrópia kioltás FRET 4. LÁTÁS Modern mikroszkópiai módszerek 5 HISZEM, HA LÁTOM Az emberi szem felbontásának hullámoptikai határa függ: hullámhossztól: pupillaátmérőtől: d ha = 800 nm, d = mm 1.68 szögperc ha = 400 nm, d = mm 0.8 szögperc!? Modern mikroszkópiai módszerek 6 1
MIKROSZKÓPIA MIKROSZKÓP az emberi szem számára láthatatlan, apró vizsgálati objektumok, tárgyak megjelenítése MIKRO SZKÓPIA MIKRON = kicsi + SZKOPEIN = nézni A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA Képalkotás: HOGYAN? MIKROSZKÓPIA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS Minta leképezése: fény Lencsék: üveg Jel: fény Fáziskontraszt mikroszkópia Fluoreszcencia mikroszkópia Polarizációs mikroszkópia Sztereomikroszkópia Ultramikroszkópia Ultraibolya mikroszkópia Minta leképezése: elektronsugár Lencsék: elektromágnes Jel: elektron Minta leképezése: mikroszkopikus szonda Jel: a minta és a szonda között fellépő kölcsönhatás Atomerő mikroszkópia (AFM ) Közeli mező optikai mikroszkópia (NSOM) Alagútelektron-mikroszkópia (STM) Elektrosztatikus mikroszkópia Mágneses erőmikroszkópia Pásztázó elektronmikroszkópia Modern mikroszkópiai módszerek 7 Modern mikroszkópiai módszerek 8 A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS Fluoreszcencia mikroszkópia Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) Atomerő mikroszkópia (AFM) MIKROSZKÓPIA TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS ~ 1000 Abbas Ibn Firnas (Cordóba) homok üveg olvasó kő félgömb alakú lencse ~ 184 Salvino D'Armate (olasz) első szemüveg 1590 Zaccharias testvérek (holland) összetett lencserendszer 1665 Robert Hook (angol) mikroszkóp fejlesztés, megvilágítás 1674 Anton van Leeuwenhoek csiszolt lencsék, 70x nagyítás 1830 Joseph Jackson Lister 187 Ernst Abbe lencsehibák korrekciója lencsék kombinációjával Abbe Sine Condition felbontási határ 1893 August Köhler Köhler megvilágítás 10 μm 1 μm 10 μm Modern mikroszkópiai módszerek 9 1903 193 1931 1981 1994 Richard Zsigmondy Kémiai Nobel Díj 195 Frits Zernike Fizikai Nobel Díj 1953 Ernst Ruska Fizikai Nobel Díj 1986 Gerd Binnig, Heinrich Rohrer Fizikai Nobel Díj 1986 Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Y. Tsien Kémiai Nobel Díj 008 ultramikroszkóp fázis-kontraszt mikroszkóp elektron mikroszkóp alagútelektron-mikroszkópia (STM) felbontás: XY: 0.1 nm Z: 0.01 nm GFP: zöld fluoreszcens fehérje Modern mikroszkópiai módszerek 10 MIKROSZKÓPIA MÉRFÖLDKÖVEK http://www.nature.com/milestones/milelight/timeline.html OPTIKAI FÉNY MIKROSZKÓPIA A képalkotáshoz látható fényt ( = 400 700 nm) és üvegből készült lencséket használ. Modern mikroszkópiai módszerek 11 Modern mikroszkópiai módszerek 1
AZ EGYSZERŰ NAGYÍTÓ LUPE 1 GYŰJTŐLENCSE AZ EGYSZERŰ MIKROSZKÓP GYŰJTŐLENCSE retina szem GYŰJTŐLENCSE k t retina szem OKULÁR - szemlencse 1: objektív objektív 1 valódi, nagyított, fordított állású fókuszponton belül F f f F OBJEKTÍV - tárgylencse okulár látszólagos, nagyított, egyenes állású látszólagos egyenes állású nagyított Modern mikroszkópiai módszerek 13 : okulár objektív + okulár látszólagos, nagyított, fordított állású Modern mikroszkópiai módszerek 14 A MODERN MIKROSZKÓP A MODERN MIKROSZKÓP ÁTESŐFÉNY transzmissziós INVERTÁLT epi MINTA FÉNYFORRÁS MINTA FÉNYFORRÁS OKULÁR db binokulár DETEKTOR FÉNYFORRÁS DETEKTOR OBJEKTÍV 1db Modern mikroszkópiai módszerek 15 Modern mikroszkópiai módszerek 16 ALKOTÁS : FOTON DIGITÁLIS JEL -PONT A ALKOTÁS LEGFŐBB KÖVETELMÉNYEI Képalkotás: KÖVETELMÉNYEK - PONT : PIXEL INTENZITÁS TÉR Modern mikroszkópiai módszerek 17 NAGYÍTÁS elég nagy legyen FELBONTÁS minden érdekes részlet láthatóvá váljon KONTRASZT minden érdekes részlet jól elkülönüljön a környezetétől Modern mikroszkópiai módszerek 18 3
NAGYÍTÁS hányszor nagyobb a kép, mint a tárgy FELBONTÓESSÉG FELBONTÓESSÉG az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen OBJEKTÍV: N objektív = 1 150 OKULÁR: N okulár =5 30 MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA N mikroszkóp = N objektív x N okulár Modern mikroszkópiai módszerek 19 Modern mikroszkópiai módszerek 0 FELBONTÓESSÉG DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS) Milyen kicsi dolgokat láthatunk? FELBONTÓESSÉG DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS) 0 rend 0-1 rend 0 - rend 0-4 rend - -1 0 +1 + DESTRUKTÍV kioltás - sötét kép INTERFERENCIA KONSTRUKTÍV erősítés - világos objektív kondenzor fényrekesz elhajlási irány optikai rács fényáteresztő képesség periodikusan változik ELHAJLÁS DIFFRAKCIÓ tárgy OPTIKAI RÁCS Modern mikroszkópiai módszerek 1 tökéletes kép összes elhajlási rend (nem teljesíthető) Minél magasabb rendben elhajlott sugarak vesznek részt a leképezésben annál részletgazdagabb képet kapunk. ABBE ELV DIFFRAKCIÓS LIMIT Modern mikroszkópiai módszerek FELBONTÓESSÉG AIRY KORONG George Biddel Airy (1801-189) Egyetlen tárgypontról képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki elhajlási kép egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG FELBONTÓESSÉG AIRY KORONG d erősítés kioltás 3 1 0 kép pont 1 kép pont felbontott nem felbontott Modern mikroszkópiai módszerek 3 Az egyik maximuma éppen a másik első minimumába esik. Modern mikroszkópiai módszerek 4 4
FELBONTÓESSÉG ABBE ELV DIFFRAKCIÓS LIMIT Ernst Abbe (1840-1905) FELBONTÓESSÉG FÉNYMIKROSZKÓP XY irányban a minta síkjában Z irányban optikai tengely mentén = 0.61 d z = ( ) d: az a legkisebb távolság, amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen : a megvilágítás hullámhossza ω : objektív fél nyílásszöge (apertura szög) n: a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójától 1/d: feloldóképesség Jobb a mikroszkóp felbontása, ha d kicsi, vagyis 1/d nagy. XY irányban a minta síkjában 30 nm Z irányban optikai tengely mentén 1000 nm Modern mikroszkópiai módszerek 5 Modern mikroszkópiai módszerek 6 FELBONTÓESSÉG HULLÁMHOSSZ Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi) = 0.61 Hogyan? : a megvilágítás hullámhosszának csökkentése HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÓESSÉG - XY nm FELBONTÓESSÉG - Z nm 360 156 367 400 174 408 450 196 459 500 17 510 550 39 561 600 61 61 650 83 663 700 Modern 305 mikroszkópiai módszerek 714 7 FELBONTÓESSÉG TÖRÉSMUTATÓ Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi) = 0.61 Hogyan? n : a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójának növelése immerziós közeg alkalmazása (nagy törésmutató) immerziós közeg törésmutató n levegő 1.000 olaj 1.5 glicerin 1.4695 víz 1.3333 módszerek Modern mikroszkópiai 8 FELBONTÓESSÉG APERTURA SZÖG Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi) = 0.61 Hogyan? α : objektív fél nyílásszögének (apertúra szög) növelése FELBONTÓESSÉG NUMERIKUS APERTÚRA: NA az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma az objektív mekkora szögben (α) képes begyűjteni az egy tárgypontból érkező sugarakat NA = Modern mikroszkópiai módszerek 9 Modern mikroszkópiai módszerek 30 5
KONTRASZT A tárgynak a leképezés szerinti inhomogenitását erősítjük fel KONTRASZT A tárgynak azt a tulajdonságát használjuk ki, ami megkülönbözteti a környezetétől. Például: OPTIKAI INHOMOGENITÁS miatt fényelnyelés törésmutató alak szín a tárgyon áthaladó FÉNYSUGARAK SAJÁTSÁGAI MEGVÁLTOZHATNAK irány sebesség fázis hullámhossz Modern mikroszkópiai módszerek 31 KONTRASZT ÁTESŐFÉNY (TRANSZMISSZIÓS) MIKROSZKÓPIA (a) világos látóterű (b) differenciális interferencia kontraszt (DIC) vastagság, alak, törésmutató (c) fázis-kontraszt vastagság, alak, törésmutató (d) Hoffman modulációs kontraszt (HMC) vastagság, alak, törésmutató (e) ultramikroszkópia - sötétlátóterű kis fényszóró objektumok (f) polarizációs kettősen törő anyagok Modern mikroszkópiai módszerek 3 KONTRASZT FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA (a) vékony minta (b) vastag minta (c) DIC + FLUO FÁZIS KONTRASZT MIKROSZKÓPIA Frits Zernike (1888-1966) INHOMOGENITÁSA FÁZISBELI KÜLÖNBSÉGEK INTENZITÁSBELI KÜLÖNBSÉGEK HOMOGÉN (d) HMC + FLUO (e) fázis kontraszt + FLUO (f) többszínű fluoreszcencia KONTRASZTOS Modern mikroszkópiai módszerek 33 Modern mikroszkópiai módszerek 34 emberi glia agysejtek egyrétegű kultúrában FÁZIS KONTRASZT MIKROSZKÓPIA SZTEREOMIKROSZKÓPIA 3D sejtmozgás Listeria monocytogenes két mikroszkóptubus 14 o objektív + okulár NE KEVERJÜK ÖSSZE A BINOKULÁRRAL!!! modell rendszer 14 o tárgy két D kép (bal - jobb) egy 3D kép Modern mikroszkópiai módszerek 35 Alkalmazás mikrosebészet Modern mikroszkópiai módszerek 36 6