2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-1 2.2.33. MÁGNESES MGREZONNCI SPEKTROMETRI 01/2009:20233 EVEZETÉS mágneses magrezonancia spektrometria (NMR) olyan analitikai módszer, amely különösen alkalmas szerves molekulák kémiai szerkezetének felderítésére, a molekulák 1 H- vagy heteroatom-magjaiból (pl. 13 C, 19 F, 15 N, 31 P) származó NMRspektrumok értelmezése révén. spektrumok kvalitatív és kvantitatív célokra is használhatók. lkalmas kísérleti körülmények között az NMR-jelek intenzitásának integrálja egyenesen arányos az adott jelet adó csoportban található magspinek számával. Ezek az integrálok mennyiségi elemzéshez is alkalmasak. LPELVEK Ha impulzusmomentummal és mágneses momentummal rendelkező atommagokat statikus mágneses térbe ( 0 ) helyezünk, az atommagok a mágneses tér irányához képest különböző, kvantummechanikailag meghatározott irányokba rendeződnek. z egyes orientációk energiaszintjei különbözők. Egy nagy frekvenciával oszcilláló mágneses tér ( 1 ), amelynek iránya merőleges a 0 -ra, nettó energiaabszorpción keresztül képes átmeneteket létrehozni az egyes energiaszintek között. rezonanciafeltétel szerint ekkor ω 0 = γ 0, ahol γ a giromágneses együttható, ω 0 pedig a Larmor-frekvencia. Mind a 0, mind pedig a 1 változtatásával nyerhető spektrum (folyamatos pásztázás (continuous wave CW) módszer). Manapság a 1 besugárzás rádiófrekvenciás tér alkalmazásával történik (Fouriertranszformációs FT módszer). kezdeti állapotba való visszatérés során kibocsátott koherens sugárzás egy csillapodó görbével írható le, amelyet szabad indukciós lecsengésnek (free induction decay FID) nevezünk. z ezt követő Fourier-transzformáció az időfüggő jelet frekvencia-tartományú spektrummá alakítja, amely információt nyújt a molekuláris szerkezetről. z atommagok közötti skaláris kölcsönhatások kiküszöbölésére további rádiófrekvenciás tér is alkalmazható ( lecsatolás ). z egy-és többdimenziós technikák egyaránt alkalmazhatóak minőségi és mennyiségi elemzés céljára, folyadék- vagy szilárdfázisú minták esetében.
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-2 következő spektroszkópiás paraméterekből nyerhető fontos szerkezeti információ: rezonanciafrekvencia a rezonanciajelek (szingulett, multiplett) száma kémiai eltolódás δ (ppm) jelintenzitás a csatolási mintázat multiplicitása csatolási állandó n J (Hz) a vizsgált atommag fajtája a kémiailag nem ekvivalens atom(csoport)ok száma a vizsgált szerkezeti elem kémiai tulajdonsága és környezete a jelet szolgáltató magok száma a vizsgált maggal skalárisan csatoló magok száma a csatolásban résztvevő magok közötti kötések száma és a kötésgeometria spektrális paraméterek közötti korreláció (például kémiai eltolódás és csatolási állandó vagy különböző magok kémiai eltolódásai ugyanazon molekulában) homovagy heteronukleáris két- és többdimenziós módszerekkel vizsgálható. Megfelelő módszerekkel információ nyerhető továbbá a T 1 és T 2 relaxációs időkről, a mag Overhauser hatásról (NOE), illetve idő függvényében lejátszódó folyamatok kinetikájáról. KÉSZÜLÉK nagyfelbontású NMR-spektrométer alapvető részei: a 0 állandó mágneses teret biztosító mágnes; termosztált mérőfej, mely tartalmazza a mintát, itt történik a rádiófrekvenciás impulzus kibocsátása és a minta által kibocsátott sugárzás detektálása; egy elektronikus konzol, amely generálja a nagy energiájú rádiófrekvenciás impulzusokat, illetve gyűjti és digitalizálja a FID jelet; ez az egység felelős a készülék elektronikájának stabilitásáért; adatgyűjtő és -feldolgozó egység (számítógép); a spektrométer tartalmazhat továbbá: átfolyó cellát folyadékkromatográf-nmr kapcsolt technika esetén, vagy folyamatosan áramló rendszereken végzett analízis esetén impulzus-grádiensek előállítására alkalmas egységet. z erős mágneses teret egy folyékony héliummal töltött, hőszigetelt tartályban lévő szupravezető tekercs biztosítja. mérőfejbe a mintát általában egy 5 mm külső
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-3 átmérőjű mintatartó csőben vagy az átfolyó cellába juttatjuk be; a mérőfejet az konzollal rádiófrekvenciás kábel kapcsolja össze, amely továbbítja a lock-, 1 H és heteroatom-frekvenciákat. További egységek szükségesek a hangoláshoz és a minta hőmérsékleti kontrolljának megvalósításához. Igazolni kell, hogy az NMR-spektrométer megfelelően működik. Ennek céljára általában a következő vizsgálatok alkalmazhatók: a jelszélesség mérése meghatározott körülmények között felvett, meghatározott jelek félmagasságánál, jel/zaj viszony (S/N) standard keverékek esetében, impulzusteljesítmény (90 -os pulzusszélességben kifejezve) és az impulzus reprodukálhatósága. készülékek gyártói az egyes készülék/mérőfej kombinációkra minden esetben közzéteszik az ezen paraméterekre vonatkozó követelményeket és mérési protokollokat; igazolni kell a követelményeknek való megfelelést. FOURIER-TRNSZFORMÁCIÓS NMR (FT-NMR) jelenleg használt spektrométerek általában Fourier-transzformációs (FT) elven működnek: miután a minta besugárzása megtörtént megfelelő frekvenciájú (ν), amplitúdójú ( 1 ), időtartamú (τ p ) rádiófrekvenciás impulzussal, rövid holtidőt (t d ) követően (az elektronika visszaállítása céljából) a felerősített FID jel gyűjtése az adatgyűjtés időtartama (t ac ) alatt történik. Ezután egy analóg-digitális konverter (DC) a jelet digitalizálja, majd az adatokat a spektrométer memóriájában tárolja. jel felerősítésére a digitalizálás előtt azért van szükség, hogy a maximális érzékenység elérhető legyen az DC telítése nélkül. Heteroatomok vizsgálata esetén, amennyiben szükséges, a mérés során szélessávú 1 H-lecsatolás is történik, az összes proton besugárzásával. jel/zaj viszony növelése érdekében lehetőség van több FID jel akkumulációjára és összegzésére. z idő-domíniumú jel Fouriertranszformációjával nyerhető a frekvencia-domíniumú spektrum. PRMÉTEREK Egy FT mérés eredményét a következő paraméterek befolyásolják, melyeket ezért be kell állítani és ellenőrizni kell. Impulzusszélesség (τ p ). gerjesztéshez használt impulzus az úgynevezett forgó koordinátarendszer x-tengely irányába mutat; időtartama (vagy szélessége, τ p ) meghatározza a precesszió szögét (θ) és ezáltal a rezonanciajel intenzitását (I): 1 p (1) M y M 0 sin (2) megfigyelt mágnesezettség (M y ) θ = 90 -nál a legnagyobb. z impulzus időtartamának olyan rövidnek kell lennie, ami garantálja, hogy a
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-4 spektrumtartományban minden jel hasonló mértékben legyen gerjesztve. mágnesezettség a relaxációs folyamatok során cseng le. Holtidő (t d ). Holtidőnek nevezzük az impulzus vége és az adatgyűjtés kezdete közötti időt. holtidő technikai okokból szükséges. Mivel befolyásolhatja a jelintenzitást és a jel fázisát, kellő körültekintést igényel. gyorsan lecsengő jelek (amelyek széles spektrumvonalakat eredményeznek) intenzitása nagyobb mértékben csökken, mint a lassan lecsengő jeleké (amelyek keskeny spektrumvonalakat eredményeznek). z adatgyűjtés időtartama (t ac ). z adatgyűjtés időtartama (t ac ) a spektrumszélességgel (a teljes vizsgált tartománnyal) és az adatgyűjtés során gyűjtött digitális adatpontok (DP) számával van összefüggésben. DP t ac (3) 2SW kkor érhető el a legnagyobb jelintenzitás és jel/zaj viszony, ha t ac 1,2/(πν 1/2 ), ahol ν 1/2 a jelszélesség a csúcsmagasság felénél, viszont a jeltorzulás minimalizálása érdekében nagyobbra kell állítani 5/(πν 1/2 ) értéknél. Ismétlési idő (t r ). spin-rács relaxáció (T 1 ) határozza meg azt az időt, amíg a spinek egy impulzus után visszatérnek az egyensúlyi állapotba. relaxációs idő speciális reagensekkel csökkenthető. Kvantitatív mérés esetén az ismétlési időt a T 1 és θ függvényében úgy kell beállítani, hogy elkerüljük a telítést. Jelerősítés. detektált analóg jelet a digitalizálás és tárolás előtt erősíteni kell, melynek mértékét úgy kell automatikusan vagy kézi úton beállítani, hogy az erősített jel ne okozza az DC túltelítését, ami a jel torzulásához vezet, de tegye lehetővé a véletlen zaj digitalizálását (mivel annak értéke nem nulla). Z DTGYŰJTÉSI ÉS -FELDOLGOZÁSI PRMÉTEREK OPTIMLIZÁLÁS KVNTITTÍV MÉRÉS CÉLJÁÓL z adatgyűjtési paraméterek mellett a jelintenzitást számos adatfeldolgozási paraméter is befolyásolja. Megfelelő számú felvétel után a FID Fouriertranszformációja történik. megbízható kvantitatív mérés céljából a következő paramétereket kell optimalizálni. Digitális felbontás. digitális felbontás az adatpontok közötti frekvencia különbséget jelenti. feldolgozott jelnek legalább 5 adatponttal kell rendelkeznie az integrálandó jelek félmagassága felett. digitális felbontás javítása érdekében a mérés során kapott FID végét nulla intenzitású pontokkal egészíthetjük ki a jel transzformációja előtt ( zero filling ). Jel/zaj viszony (S/N). jel/zaj viszony egy adott jelre jellemző intenzitás (jelmagasság) és a jelben a véletlen ingadozás okozta hatás aránya. véletlen
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-5 ingadozást általában a spektrumnak a vizsgált anyagtól származó jelet nem tartalmazó régiójában mérjük. gyenge jel/zaj viszony korlátozza a jelek integrálásának és a mennyiségi meghatározásnak a helyességét. mennyiben a jel/zaj viszony legalább 150:1, az integrálás relatív szórása (standard deviációja) kevesebb, mint 1%. jelenleg használt spektrométerek rendelkeznek olyan szoftver algoritmussal, amely kiszámítja az adott jelekre vonatkozó jel/zaj viszonyt. izonyos esetekben, például híg oldatok vizsgálatánál, vagy abban az esetben, ha 1 H-tól eltérő magokat vizsgálunk, nehézséget okozhat a megfelelő S/N érték elérése. következő módszerek lehetnek alkalmasak az S/N növelésére: a mérések számának (n) növelése, mivel az S/N n-nel arányosan növekszik; a FID jel exponenciális fügvénnyel történő szorzása a Fourier-transzformáció előtt; az exponenciális szorzótényezőnek a jel félmagasságnál mért csúcsszélességének megfelelő nagyságrendűnek kell lennie; nagyobb 0 mágneses térrel rendelkező spektrométerek használata, mivel az S/N 0 3/2 -nel arányos; digitális szűrés alkalmazása a zaj csökkentésére; olyan mérőfej használata, amely a lehető legnagyobb kitöltési tényezővel rendelkezik; hűtött mérőfej használata a termikus zaj csökkentésére. z integrálás intervalluma. z NMR-jelek intenzitásának értékét kvázi analóg integrálással nyerjük, lépcsőfüggvény szerinti integrálással vagy pontosabb módon szakaszonkénti integrálással és digitális adatelőállítással. Folyadékfázisú NMR esetében a jelek alakja Lorentz-görbe szerinti. gyógyszerkönyvi cikkelyben jelzett esetek, illetve a jelek átlapolásának kivételével, ugyanazon integrálási tartomány, a jelek félmagasságánál vett csúcsszélessége többszöröseként kifejezve, alkalmazandó a vizsgált jel és az összehasonlító jel esetében. Dinamikus tartomány. z analóg-digitális konverter (DC) dinamikus tartománya meghatározza azt a legkisebb intenzitásvonalat, amely megfigyelhető vagy mennyiségileg meghatározható, amennyiben egy spektrumban két azonos szélességű jelet integrálunk. Egy 16 bites DC esetében még azonosítható egy olyan jel, melynek relatív intenzitása 0,003% egy olyan erős jelhez viszonyítva, amely teljesen kitölti az DC dinamikus tartományát. OLDTFÁZISÚ MINTÁK VIZSGÁLT NMR-REL z NMR-vizsgálatok többségét a vizsgálandó minta megfelelő oldószerrel készült híg (kb. 1%-os) oldatában végzik, amelyhez megfelelő standard adható a kémiai eltolódás skála kalibrációja érdekében.
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-6 Oldószerek. z oldószer képes legyen a minta oldására egyéb kölcsönhatás nélkül, kivéve ha más az oldás célja. nagy oldószerjelek minimalizálása érdekében teljesen deuterált oldószerek (R deutérium-oxid, R deuterokloroform, R deuterodimetil-szulfoxid, R deuteroaceton, R deuterometanol stb.) alkalmazandók. z oldószer atomjainak jeleit könnyű azonosítani kémiai eltolódásuk alapján, és használhatók a kémiai eltolódás skála kalibrálására (másodlagos referencia). kémiai eltolódás megadása. z atomnak a molekulában lévő kémiai környezetétől leginkább függő spektrális paramétere a kémiai eltolódás, melyet δ- val jelölünk és ppm-ben (parts per million; milliomodrész) fejezünk ki. Egy NMRaktív mag rezonanciájának kémiai eltolódását (δ X, minta ) ppm-ben a következő módon fejezzük ki: az adott mag rezonanciafrekvenciájának (ν X, minta ) és a kémiai eltolódás referenciastandard rezonanciafrekvenciájának (ν X, referencia ) különbségét (mindkét frekvenciát hertzben kifejezve) elosztjuk a spektrométer megahertzben kifejezett alapfrekvenciájával (ν spektrométer ), egy adott 0 mágneses térben: X, minta X,min ta X, referencia (4) spektrométer Megállapodás szerint a kémiai eltolódás megadásához használt standard az R tetrametilszilán (TMS) 1 H rezonanciája, vagyis δ TMS = 0 ppm. Elméletileg a 1 H kémiai eltolódási skálának a TMS-re történt beállítása után számítható a heteroatom rezonanciája, és kalibrálható az arra vonatkozó kémiai eltolódás skála. Egy (másodlagos) referenciastandard frekvenciája δ X = 0 ppm-nél (ν X, referencia ) a TMS 1 H frekvenciájából (ν H,TMS ) és a heteroatom izotóp-specifikus frekvenciájának és a TMS 1 H frekvenciának a táblázatban feltüntetett arányából (Ξ X, referencia) számítható: (5) X, referencia H, TMS X, referencia
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-7 következőkben láthatók a referenciastandardok δ X = 0 ppm-nél és a megfelelő Ξ X, referencia értékek: Mag Víz a Ξ X, referencia Más oldószerek Ξ X, referencia 1 H DSS b 1,00000000 TMS 1,00000000 13 C DSS b 0,25144953 TMS 0,25145020 15 N NH 3 0,10132912 CH 3 NO 2 0,10136767 19 F CF 3 COOH nem ismert CCl 3 F 0,94094011 31 P H 3 PO 4 (85%) 0,40480742 (CH 3 O) 3 PO 0,40480864 a a kémiai eltolódás ph-függő b DSS = nátrium-2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonát gyakorlatban a kémiai eltolódásokat közvetlenül egy megfelelő standardhoz viszonyítják. 1 H és 13 C NMR esetében általában belső standardot használnak, vagyis a referenciaanyagot közvetlenül a vizsgálandó mintához adják. 15 N, 19 F és 31 P NMR esetében gyakran a külső standard alkalmazása a megfelelő, ebben az esetben a mintát és a referenciastandardot két különböző, párhuzamosan elhelyezett hengeres mintatartó cső tartalmazza. Frekvencia stabilizálás ( Lock ). spektrum csúszásának elkerülése érdekében stabilizáló eljárást végzünk, ezt nevezzük frekvencia lock -olásnak. Erre a célra deuterált oldószerektől származó 2 H (deutérium) jelet alkalmazunk, kivéve amennyiben a cikkely másként rendelkezik. KVLITTÍV NLÍZIS kvalitatív analízis céljára felvett NMR-spektrumokat főleg azonosításra használják, aminek során egy minta 1 H vagy 13 C spektrumát egy referenciaminta spektrumával vagy ritkábban egy közzétett referenciaspektrummal hasonlítják össze. referencia- és a vizsgált minta spektrumát azonos eljárással, azonos mérési körülményeket alkalmazva kell felvenni. jelek vagy karakterisztikus régiók helye, intenzitása és multiplicitása egyezzék meg a két spektrum esetében. izonyos esetekben az összehasonlításhoz matematikai módszerek, például korrelációs koefficiens számítása alkalmazhatók. Elérhető referenciastandard hiányában saját készítésű referenciaanyag is alkalmazható, amelynek azonosságát alternatív módszerekkel igazolták, vagy pedig igazolt, hogy az NMR-spektrum teljesen megfelel az anyag deklarált szerkezetének. KVNTITTÍV NLÍZIS z NMR-jelek intenzitása alapvetően a görbe alatti területtel mérhető. jelmagasság kizárólag abban az esetben alkalmazható az intenzitás jellemzésére, amennyiben két jel esetében egyaránt azonos a félértékszélességük a multiplicitásuk. bban az esetben, ha az egymást követő felvételek között teljes
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-8 relaxáció történik, a jelintenzitással (I ) mérhető az adott jelet adó magok száma (N ): I K N (6) S K S állandó alapvető állandókat, illetve a minta és a detektor tulajdonságait foglalja magában; az állandó elhagyható, amennyiben jelintenzitásokat hasonlítunk össze, ezzel megadva az összehasonlított és szerkezeti elemben lévő megfelelő magok számának arányát: I N (7) I N Egy adott molekula különböző funkciós csoportjaihoz tartozó magok száma (N i ) kis egész szám. mért értékeket a legközelebbi egész számra kerekítjük. spektrométer adatgyűjtésének és -feldolgozásának megfelelősége könnyen ellenőrizhető ismert szerkezetű szerves vegyület spektrumában látható jelek pontos intenzitásának összehasonlításával. Egy keverék esetében azonkívül, hogy az egyes komponensek esetében a jelintenzitások egymás egész számú többszörösei, a komponensek mólaránya is mérhető a különböző komponensektől származó jelek normalizált intenzitásainak összehasonlításával. Egy keverékben található két komponens mólaránya a következő egyenlet alapján számítható: n n (8) I I N N meghatározás csak abban az esetben értékelhető, amennyiben a molekulák szerkezete, amelyeknél az I -t és I -t meghatározzuk, ismert (vagy legalább az N értékek ismertek a vizsgált csoportok esetében). meghatározások belső standardot használva vagy normalizációs eljárással egyaránt végezhetők. első standard módszer. Egy minta () tömege (m ) meghatározható, amennyiben egy anyag () ismert tömegét (m ) ismert százalékos koncentrációban (P ) intenzitásstandardként az oldathoz adjuk. (8) egyenletet ebben az esetben a következőképpen alakíthatjuk át: m I N M P m (9) I N M 100 Itt az M i molekulatömegeket jelent. z intenzitásstandardot körültekintően kell megválasztani: teljesen fel kell oldódnia a minta oldásához használt oldószerben, kevés jelet kell adnia, és a számításhoz használt jelnek a spektrum olyan tartományában kell lennie, ahol nincs
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-9 más jel. Nagytisztaságú és relatíve nagy molekulatömegű vegyület alkalmazása ajánlott e célra. Normalizációs eljárás. Egy keverék komponenseinek aránya, egy szerkezetileg módosított polimer szubsztitúciós foka vagy egy szennyező mennyisége meghatározható a relatív intenzitások összehasonlításával. mérési módszert validálni kell annak biztosítására, hogy az adott jelek esetében nincs más jelekkel történő átlapolás. mennyiben a szennyező szerkezete vagy molekulatömege rosszul definiálható, az adott anyag ismert mennyiségeit az NMRcsőbe adagolva kalibrációs egyenest kell felvenni. MÓDSZER Mintaelőkészítés. mintát feloldjuk az oldószerben, amelyhez megfelelő referenciaanyag is adható, a kémiai eltolódás kalibrálására, a cikkely előírásai szerint. Mennyiségi analízis esetén az oldatoknak szilárd részecskéktől mentesnek kell lenniük. Egyes mennyiségi meghatározások esetében belső standard használata szükséges, így a vizsgált minta és a referenciaanyag megfelelő jelének intenzitása hasonlítható össze. z egyedi cikkelyek előírják a megfelelő referenciaanyagokat és az alkalmazandó koncentrációkat. Más esetekben az eredményt a vizsgálati minta két vagy több relatív intenzitásának összehasonlításával nyerjük. mintát betöltjük az NMR-csőbe, bedugaszoljuk, belehelyezzük az NMR-mágnes belsejébe, beállítjuk a mérési paramétereket és végrehajtjuk a mérést. legfontosabb mérési paramétereket a cikkely előírásai tartalmazzák. mérési eljárás. Miután a minta a mérőfejben egyensúlyi állapotba került, optimalizáljuk a készülék beállításait a legjobb rezonanciafeltételek elérése és a jel/zaj viszony maximalizálása céljából a mérőfej hangolása és illesztése által, illetve olyan beállításokat végzünk, hogy a mágneses tér homogén legyen a minta körül ( shimmelés ). paraméterek beállításait feljegyezzük vagy a számítógépben elmentjük. Egy mérés állhat több impulzus-adatgyűjtés-késleltetés sorozatból; az egyedi FID-ek a számítógép memóriájában összegezhetők, ezáltal a véletlen zaj kiátlagolódik. mennyiben a megfelelő jel/zaj viszony elérésre került, a FID tárolódik, és az összegzett FID Fourier-transzformációjával generálódik a frekvencia-domíniumú spektrum. SZILÁRD FÁZISÚ NMR Szilárd fázisú minták speciálisan erre a célra tervezett NMR-készülékekkel vizsgálhatók. izonyos műszaki eljárások segítségével megfigyelhetővé válnak az
2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-10 egyes atomoknak megfelelő vonalak, ami az NMR alkalmazhatóságát szervetlen anyagokra is kiterjeszti. z egyik ilyen eljárás az elporított minta gyors forgatása (4-30 khz) egy (kb. 4 mm külső átmérőjű) rotorban, amely 54,7 -kal ( mágikus szög ) meg van döntve a 0 mágneses tér irányához képest. z eljárást magic angle spinning -nek (MS) nevezik. További hasznos módszer a nagy teljesítményű lecsatolás, illetve egy harmadik eljárás a polarizáció-átvitel egy könnyen gerjeszthető magról egy kevésbé polarizálható magra, vagyis kereszt-polarizáció (cross polarisation, CP). z említett technikák kombinációja segítségével nagy felbontású spektrumok nyerhetők, amelyek sok információt tartalmaznak a kerámia, polimer vagy ásványi eredetű, üvegszerű, amorf és kristályos szilárd anyagok kémiai és szerkezeti adatairól. mennyiben szilárd anyag NMR-vizsgálatát írja elő a Gyógyszerkönyv, az adott cikkelyben megtalálható az eljárás részletes leírása.