Terápiarezisztencia-fehérjéket kódoló mrns kvantitatív kimutatása PCRtechnikával lymphomás kutyák nyirokcsomójában Sunyál Orsolya V. évfolyam Témavezetık: Dr. Vajdovich Péter Szabó Bernadett SZIE-ÁOTK Kari TDK Konferencia, 2008.november 26.
A kutyák lymphomájáról általában bármely fajtában és ivarban, bármely életkorban, de többnyire 9 év feletti kutyákat érint kezelése szinte kizárólag kemoterápiával a kutyákban elıforduló lymphoma az emberek közepes vagy nagy malignitású (medium ill. high-grade) ún. non-hodgkintípusú lymphomájával mutat hasonlóságot
Lymphomás megbetegedések gyógyítása kemoterápia multidrog rezisztencia az idegen anyagok sejtbıl való kijuttatásáért különbözı fehérjék felelısek, ide tartoznak pl. az ABCtranszporterek - felesleges és testidegen anyagok
MDR1 (Pgp= P-glycoprotein) MDR1 által transzportált daganatellenes szerek: aktiomicin D mitomicin-c metotrexát mitoxantron taxánok (paclitaxel, docetaxel) vinka-alkaloidok (vinkrisztin, vinblasztin) podofillotoxinok (etoposzid, teniposzid) antraciklinek (doxorubicin, daunorubicin, epirubicin) Fiziológiai szerepe: toxikus vagy sejtidegen transzportja molekulák www.csc.mrc.ac.uk/researchgroups/membranetransportproteinsanddisease Szöveti lokalizáció: bél, máj, vese,vér-agy gát here, placenta
MRP1 (multidrug resistance associated protein 1) Fiziológiai szerepe: a tüdıben és a bélrendszerben mőködve a toxikus anyagokat visszapumpálja a lumenbe megakadályozza a toxinok felhalmozódását az agyban és a gerincvelıben kipumpálva azokat a vérbe Szöveti lokalizáció: tüdı, here,vese, placenta, szívizom, gyomor, lép, vastagbél, pajzsmirigy Szubsztrátjai: antraciklinek, metotrexát, camptotecinek Schaub et al.; J. Am. Soc. Nephrol. 6 1159-1169, (1999)
MRP2 (multidrug resistance associated protein 2) MRP2 által transzportált gyógyszerek: Daganat elles szerek: Fiziológiás szerepe: a bilirubin-glukuronidok, az epesavas sók és a leukotriének transzportja ciszplatin metotrexát vinka-alkaloidok (vinkrisztin, vinblasztin) antraciklinek (doxorubicin) podofillotoxinok (etoposzid) Egyéb citotoxikus anyagok: kolchicin nehézfémek Jedlitschky et al.,; Expert Opinion Drug Metabol. Toxicol. 2. 351-366. (2006) Szöveti lokalizáció: tüdı, bél, máj, vese,vér-agy gát, here, placenta
BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) Fiziológiai szerepe: védi a magzatot a toxikus hatásoktól az ıssejteket védi a hypoxiás sejthaláltól prooxidáns hemszármazékok transzportja Szöveti lokalizáció: Tüdı, bél, máj, endometrium, placenta, emlı, KIR (vér-agy gát), petefészek, here, érfal Szubsztrátjai: antraciklinek, kampotecinek Gottesman et al.; Nature Reviews Cancer 2, 48-58. (2002)
Célkitőzés Vannak-e különbségek az általunk kialakított csoportok között a transzporterek mennyiségét illetıen mrns szinten? Található-e összefüggés az mrns-expresszió mértéke és a lymphomás betegek klinikailag is megfigyelhetı terápiás válasza között? Van-e az általunk vizsgált paramétereknek prognosztikai értéke?
Anyag és módszer 44 lymphomás kutya, III., IV., V. stádium, és kontroll COPA kombinációs kemoterápiás protokoll (ciklofoszfamid, vinkrisztin, doxorubicin, prednizolon) 4 csoport: elsıdleges (n=33), recidívált (n=7), szepszises (n=3) és kontroll (n=7)
Laboratóriumi analízis nyirokcsomók mőtéti kimetszése minták homogenizálása RNS-izolálás, DN-ázos emésztés cdns írás, RT-q PCR
Csoportok közti vizsgálatok- MRP1, BCRP mrp1 normalizált mrp1 normalizált mennyiség mennyiség / µg total [ g] RNS 5E+00 5E-01 5E-02 5E-03 5E-04 p<0,05 Median 25%-75% Min-Max kontroll elsıdleges recidivált szepszis MRP1-et vizsgálva jelentıs eltérés látható a kontroll és a szepszises csoport között bcrp normalizált bcrp normalizált mennyiség mennyiség / µg total [ g] RNS BCRP esetében szignifikáns különbség a kontroll és a szepszises, illetve a kontroll és a recidívált csoport között adódott 5E+00 5E-01 5E-02 5E-03 5E-04 5E-05 5E-06 Median 25%-75% Min-Max p<0,05 p<0,05 kontroll elsıdleges recidivált szepszis
Csoportok közti vizsgálatok- MDR1 mdr1 normalizált mdr1 mennyiség normalizált mennyiség / µg total [ RNS g] 5E+00 5E-01 5E-02 5E-03 5E-04 5E-05 p<0,05 Median 25%-75% Min-Max p<0,05 p<0,05 p<0,05 kontroll elsıdleges recidivált szepszis MDR1: a kontroll csoport transzporter mennyisége minden csoportéhoz képest nagyobb Az elsıdleges és a recidívált csoportot összehasonlítva, utóbbiban szignifikánsan magasabb MDR1 transzporter mennyiséget mértünk. mdr1 normalizált mennyiség / µg total RNS 4E-02 2E-02 8E-03 6E-03 4E-03 2E-03 8E-04 6E-04 4E-04 Median 25%-75% Min-Max elsıdleges p<0,05 recidivált
A Spearman-teszt eredményei (p<0,05) a teljes túlélési idı (TTI) szoros összefüggést mutatott az MDR1 és a BCRP mennyiségével (-0,72; -0,65) a recidívamentes túlélési idı (RTI) szintén szignifikáns összefüggést mutatott az MDR1 és a BCRP mennyiségével(-0,59, -0,59) a kor és az MDR1 mennyisége közt korrelációt találtunk (0,43) Normalizált mennyiség [ g] 5,0000 0,5000 0,0500 mdr1 bcrp BCRP MDR1 Normalizált mennyiség [ g] 5,0000 0,5000 0,0500 mdr1 bcrp BCRP MDR1 Normalizált mennyiség [ g] 5,0000 0,5000 0,0500 mdr1 MDR1 0,0050 0,0050 0,0050 0,0005 0,0005 0,0005 0 10 20 30 40 50 60 TTI RTI Kor recidivamentes túlélési idı [hét] kor [év] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Teljes túlélési idı [hét] 3 4 5 6 7 8 9 10
Többszörös lineáris regressziós modell által meghatározott TTI értékek az ismert TTI-k függvényében MDR1 MDR 1 Pareto diagram 5,135259 R² = 82% BCRP 3,051104 160 1 MRP1 1,129041 140 120 tréning teszt 2 MRP2,9999422 100 p=,05 jelzett 80 a modellel megállapítható, hogy a TTI elıre jelezhetı az MDR1 és a BCRP 60 40 20 alapján 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 mért
Összefoglalás az MDR1 fehérje fontos élettani szerepét bizonyítja a kontrollokban mért magasabb expressziós szint a szepszis kialakulásának hátterében a csökkent rezisztencia állhat a terápia-rezisztencia megjelenése csökkenti az állat túlélési esélyeit vizsgálataink alapján a recidívált tumor már kevésbé érzékeny a kezelésre, ennek ismeretében lehet csak a rezisztencia ellen tenni: pl. új protokoll a TTI-re 82%-os biztonsággal lehet elıre jelezni az MDR1 illetve BCRP mennyisége alapján a módszer elınye: gyors információ, kis mennyiségő minta is elegendı
Köszönetnyilvánítás Témavezetıim és Dr. Szécsényi Dóra Jakus Judit, PhD Dr. Gálfi Péter Szekér Krisztina, PhD Csizinszky Rita
Köszönöm a figyelmet!