!HU00000980T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 980 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 734312 (22) A bejelentés napja: 200. 04. 18. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 2000734312 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1737488 A1 200. 11. 03. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1737488 B1 2009. 03. 11. (1) Int. Cl.: A61K 39/39 (2006.01) A61K 31/496 (2006.01) A61K 31/06 (2006.01) A61P 31/10 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0102386 PCT/GB 0/001478 () Elsõbbségi adatok: 09077 2004. 04. 23. GB (72) Feltalálók: BURNIE, James Peter, Cheshire SK9 7PY (GB); MATTHEWS, Ruth Christine, Cheshire SK9 7PY (GB) (73) Jogosult: NeuTec Pharma Limited, Camberley, Surrey GU16 7SR (GB) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Gombás fertõzések kezelése (7) Kivonat Összetétel, amely olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz az itraconazolt és a voriconazolt magában foglaló csoportból. HU 00 980 T2 A leírás terjedelme 10 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A találmány ismertetése A találmány tárgyát képezik új összetételek és készítmények, amelyek hatásos gombaellenes hatóanyagokat tartalmaznak egy olyan antitesttel együttesen, amely a összetételekbe és készítményekbe beépíthetõ. A betegek elhalálozásában fõ oknak számítanak a gombás fertõzések az intenzív osztályokon, illetve nagyobb általánosságban az immunhiányos és legyengült betegek körében [Gold, J.W.M., Am. J. Med. 76, 48 463 (1984); Klein, R. S. et al, N. Engl. J. Med. 311, 34 37 (1984); Burnie, J. P., Current Anaesthesia & Critical Care 8, 180 183 (1997)]. A gombás fertõzések jelenléte és makacssága a széles spektrumú gombaellenes hatóanyagok szelekciós nyomásának, a betegek gyakran elhúzódó kórházi, például intenzív osztályon történõ kezelésének, a fertõzés diagnosztizálásával kapcsolatos problémáknak, valamint a terápiában alkalmazott gombaellenes hatóanyagok hatástalanságának köszönhetõ. Bár a szigorú higiénés ellenõrzés bizonyos fokig megelõzheti a gombás fertõzéseket a kórházi vagy egyéb környezetekben, a járványok kitörése továbbra is súlyos probléma marad és megoldást igényel. Bár a mikózisok klinikai manifesztálódásának többségét fõleg az Aspergillus fumigatus okozza, más Aspergillus-fajok, így például az A. flavus, az A. terreus és az A. niger esetében is súlyos fertõzéseket írtak le immunhiányos gazdákban [Espinel-Ingroff, A., J. Clin. Microbiol. 41, 3 9 (2003)]. A fertõzésért felelõs gombás kórokozó kimutatása és diagnosztizálása kritikus fontosságú a további terápia szempontjából, mivel a gombaellenes hatóanyagok bizonyos törzsekkel szemben hatásosabbak lehetnek. A GB22979 és az EP06029 számú irat gombás kórokozók kimutatásra alkalmas, érzékeny és nagy specifitású tesztekben felhasználható, gombaeredetû stresszfehérjét és arra specifikus antitestet ismertet. Az Aspergillus- és Candida-fajok által okozott gombás fertõzéseket hagyományosan az amphotericin¹b elnevezésû gombaellenes hatóanyaggal kezelik, amelyet a szisztémás gombaellenes terápia aranystandardjaként tartanak számon (Burnie, J. P., 1997, supra). Az amphotericin¹b sajnos önmagában erõsen mérgezõ és különféle mellékhatásai, például a hidegrázás, a láz, az izomfájdalmak vagy a thrombophlebitis is korlátozzák alkalmazását. További gombaellenes hatóanyagok az orális azolösszetételek (miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, voriconazol) és az ¹fluor-citozin. Sok gombafaj azonban rezisztenssé válik az olyan gombaellenes hatóanyagokra, mint például a fluconazol, és az ilyen fajok gyakran fordulnak elõ olyan betegekben, akik megelõzõ céllal ezt a hatóanyagot szedték. A gombaellenes hatóanyagokra rezisztens törzsek fokozódó gyakorisága vonatkozásában és a terápiás összetételek fejlesztése terén elért legújabb eredmények, így például a fluconazol, az itraconazol és az amphotericin¹b szisztémás liposzómás változatai (Burnie, J. P., 1997, supra) ellenére, a gombás fertõzések kezelésére alkalmazható hatékony összetételek iránti igény továbbra is akut marad. 10 1 20 2 3 4 0 60 A fent említett igényre kínál megoldást a WO 01/76627 számú irat is, amely emberek vagy állatok gombás fertõzéseinek kezelésére alkalmas összetételt ismertet. A összetétel a hsp90 nevû gombaeredetû stresszfehérje egyik konzerválódott epitópjára specifikus antitestet tartalmaz, és az antitest ismert polién típusú gombaellenes hatóanyagokkal, különösen amphotericin-b-vel van kombinálva. Az antitest [a továbbiakban Mycograb (RTM) ] közelebbrõl az 1. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ peptidben bemutatott epitópot ismeri fel, amely sok gombafajban konzerválódott. Meglepõ módon kiderült, hogy az amphotericin¹b különféle, patológiásan fontos gombatörzsekkel (pl. Candida-fajokkal) szembeni hatásosságát az antitest jelenléte jelentõs mértékben felerõsítette és így lehetõvé tette, hogy vagy alacsonyabbak legyenek a kezelési dózisok vagy azonos dózis melletti hatásosabb legyen a kezelés, ami pedig lehetõvé tette a nem kívánt mellékhatások csökkentését. A WO01/76627 számú iratban ismertetett összetétel emellett olyan gombás fertõzéseknél is lehetõvé teszi a hatásos kezelést, amelyek inherensen rezisztensek a összetételben alkalmazott gombaellenes hatóanyagra. Fontos, hogy a fluconazol (egy orális azol típusú gombaellenes hatóanyag) a Mycograb (RTM) antitesttel kombinálva csak kisfokú szinergiát mutat a Candida-törzsekkel szemben. Minden más azol típusú gombaellenes hatóanyagnak közös a hatásmechanizmusa: a gombaeredetû citokróm-p-függõ enzim, a lanoszterin 14¹ -demetiláz inhibíciója révén meggátolják az ergoszterin a gomba plazmamembránjának fõ szterin összetevõje szintézisét. Az ebbõl következõ ergoszterinhiány és a 14¹ -metilált prekurzorok ezzel párhuzamos felhalmozódása zavarja az ergoszterin mûködését a gomba membránjának belsejében és megváltoztatja a membrán fluiditását, valamint sok membránkötött enzim aktivitását. A nettó hatás a gomba növekedésének és szaporodásának gátlódása [Maertens, J. A., Clin. Microbiol. Infect. 10 (Suppl. 1). 1 10 (2004)]. Mivel a fluconazol a Mycograb (RTM) antitesttel kombinálva kisfokú szinergiát mutatott a Candida-törzsekkel szemben és az orális gombaellenes hatóanyagok hatásmechanizmusa közös, logikus volt, hogy más orális azol típusú gombaellenes hatóanyagok, így például a miconazol, a ketoconazol, az itraconazol és a voriconazol sem mutat majd szinergiát a Mycograb (RTM) antitesttel. A szerzõk felismerték, hogy a korábbi eredmények ellenére, melyek szerint az azol típusú gombaellenes hatóanyagok nem, vagy csak kismértékben mutattak szinergiát a WO 01/76627 számú iratban ismertetett Mycograb (RTM) antitesttel az Aspergillus- vagy a Candida-törzsek által okozott fertõzések kezelésében, az itraconazolt és a voriconazolt a Mycograb (RTM) antitesttel kombinálva jelentkezik terápiás szinergia. A kísérletek (lásd lent) azt mutatták, hogy ez a szinergia eddig csak az itraconazolra és a voriconazolra korlátozódott, bár lehetséges, hogy még nem tesztelt vagy jelenleg fejlesztés alatt álló, más orális gombaellenes ha- 2
tóanyagok is mutathatnak szinergiát a Mycograb (RTM) antitesttel. A találmány tárgyát képezi összetétel, amely olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz az itraconazolt és a voriconazolt magában foglaló csoportból. A találmány tárgyát képezi továbbá kombinált készítmény, pl. gyógyászati csomag, amely olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz az itraconazolt és voriconazolt magában foglaló csoportból, gombás fertõzések kezelésében történõ egyidejû, külön vagy egymás utáni alkalmazásra. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás emberek vagy állatok gombás fertõzéseinek kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, azzal jellemezve, hogy olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét alkalmazzuk, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint legalább egy gombaellenes hatóanyagot is alkalmazunk az itraconazolt és voriconazolt magában foglaló csoportból. A találmány tárgyát képezi továbbá valamely összetétel alkalmazása gombás fertõzések kezelésére alkalmazható gyógyszer elõállítására szolgáló eljárásban, amely olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz, amely legalább egy gombaellenes hatóanyagot tartalmaz az itraconazolt és voriconazolt magában foglaló csoportból. Az antitest vagy annak antigénkötõ fragmense az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó peptidben bemutatott epitópra lehet specifikus. Az antitest vagy annak antigénkötõ fragmense az 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó peptidben bemutatott epitópra lehet specifikus. Az antitestek, elõállításuk és alkalmazásaik jól ismertek, például az alábbi publikációból: Harlow, E. és Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Az antitesteket a technikában ismert, standard eljárások alkalmazásával lehet elõállítani. Az antitestek lehetnek (többek között) poliklonálisak, monoklonálisak, kimérák vagy egyláncúak, valamint Fab fragmensek, valamely Fab expressziós könyvtárral elõállított fragmensek, továbbá antitestek antigénkötõ fragmensei. Antitestek sokféle gazdaszervezetben elõállíthatók, így például kecskékben, nyulakban, patkányokban, egerekben, emberekben és másokban. Immunizálásuk 10 1 20 2 3 4 0 60 történhet a gombaeredetû stresszfehérje vagy immunogén tulajdonságokkal rendelkezõ bármely fragmense vagy oligopeptidje beinjekciózásával. Az immunválasz fokozása érdekében a gazdafajtól függõen különféle adjuvánsok alkalmazhatók. Ilyen adjuvánsok lehetnek például többek között a következõk: Freund-féle adjuváns, ásványi gélek, így például alumínium-hidroxid, valamint felületaktív anyagok, így például lizolecithin, Pluronic típusú poliolok, polianionok, olajemulziók, kulcslyukcsiga-eredetû hemocianin vagy dinitro-fenol. Az emberben alkalmazható adjuvánsok közül különösen hasznos a BCG (Bacillus Calmette-Guérin) és a Corynebacterium parvum. A gombaeredetû stresszfehérjékre specifikus monoklonális antitestek, illetve fragmensei vagy oligopeptidjei bármilyen módszerrel elõállíthatók, amelynél az antitestmolekulák termelése tenyésztett, folyamatos sejtvonalakban történik. Ilyen többek között a hibridóma módszer, a humán B¹sejt-hibridóma módszer, és az EBV-hibridóma módszer [Koehler et al., Nature, 26, 49 497 (197); Kosbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983); Cote et al., PNAS USA, 80, 2026 20 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, 77 96. o. (198)]. Alkalmazhatók emellett kiméra antitestek termelésére kifejlesztett módszerek is, amelyekben egéreredetû antitestgéneket humán antitestgénekhez illesztünk, hogy a megfelelõ antigénspecificitással és biológiai aktivitással rendelkezõ molekulához jussunk [Morrison et al., PNAS USA 81, 681 68 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 602 608 (1984); Takeda et al., Nature, 314, 42 44 (198)]. A technikában ismert eljárások alkalmazásával ezenkívül egyláncú antitestek termelésére leírt módszerek is adaptálhatók gombaeredetû stresszfehérjére specifikus egyláncú antitestek elõállításához. Rokon specificitású, de eltérõ idiotípus-összetételt mutató antitestek random kombinatorikus immunglobulin-könyvtárakból állíthatók elõ, lánckeveréssel [Burton, D. R., PNAS USA 88, 11 120 11 123 (1991)]. Antitestek elõállíthatók emellett limfocitapopulációkban való termelés in vivo indukálásával vagy rekombináns immunglobulin-könyvtárak vagy nagyon specifikus kötõreagensekbõl álló panelek szûrésével is [Orlandi et al., PNAS USA 86, 3833 3837 (1989); Winter, G., et al., Nature 349, 239 299 (1991)]. Antigénkötõ fragmensek is elõállíthatók: például F(ab )2 fragmensek, amelyek az antitestmolekula pepszines emésztésével állíthatók elõ, illetve Fab fragmensek, amelyek az F(ab )2 fragmensek diszulfidhídjainak redukálásával állíthatók elõ. Ezenkívül Fab expressziós könyvtárak is készíthetõk, amelyekkel gyorsan és egyszerûen azonosítani lehet a kívánt specificitással rendelkezõ monoklonális Fab fragmenseket [Huse et al., Science 26, 127 1281 (1989)]. A kívánt specificitású antitestek azonosítása érdekében különféle immunológiai vizsgálati eljárások alkalmazhatók a szûréshez. A technikában számos olyan kompetitív kötõdési protokoll vagy radiometriai vizsgálati eljárás ismeretes, amelyben meghatározott 3
specificitású poliklonális vagy monoklonális antitestet alkalmaznak. Az ilyenfajta immunológiai vizsgálati eljárások általában magukban foglalják a gombaeredetû stresszfehérje vagy bármely fragmense vagy oligopeptidje és a rá specifikus antitest közötti komplex kialakulásának mérését. Kétpontos ( two-site ), monoklonális alapú immunológiai vizsgálati eljárás is alkalmazható, amelyben a felhasznált monoklonális antitestek két, gombaeredetû stresszfehérjébõl származó, zavaró hatással nem rendelkezõ epitópra specifikusak, de kompetitív vizsgálati eljárás is alkalmazható [Maddox et al., J. Exp. Med. 18, 1211 1216 (1983)]. Az összetételben vagy kombinált készítményben felhasznált antitest tartalmazhatja például a 3. azonosító számú szekvenciát. Az összetétel vagy kombinált készítmény gombás fertõzések kezelésére alkalmazható. A gombás fertõzést az Aspergillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmus okozhatja. A gombás fertõzés rezisztens lehet a gombaellenes hatóanyagra, ha önmagában adják. Az összetétel vagy kombinált készítmény emberek vagy állatok gombás fertõzéseinek kezelésére szolgáló eljárásban alkalmazható. Az összetétel vagy kombinált készítmény emellett tartalmazhat még gyógyszerészetileg elfogadható hordozót, hígítószert vagy excipienst. Hasonló módon a találmány szerinti bármely elõállítási eljárás vagy abban történõ alkalmazás is magában foglalhatja gyógyszerészetileg elfogadható hordozó, hígítószer vagy excipiens alkalmazását. A gyógyszerészetileg elfogadható hordozók, hígítószerek és excipiensek a technikában jól ismertek; lásd például: Remington s Pharmaceutical Sciences és az Amerikai Egyesült Államok Gyógyszerkönyve (1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA). Az összetétel vagy kombinált készítmény orálisan adagolható. A találmány tárgyát képezi továbbá reagenskészlet, amely olyan antitestet vagy annak egy olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely az Aspergillus nemzetségbe tartozó valamely mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz az itraconazolt és a voriconazolt magában foglaló csoportból. A reagenskészlet gombás fertõzések kezelésére alkalmazható. A találmány szerinti antitest vagy annak antigénkötõ fragmense ellátható detektálható jelöléssel vagy hagyományos eljárások alkalmazásával effektormolekulával, például valamilyen szerrel, pl. egy gombaellenes hatóanyaggal, így például itraconazollal vagy voriconazollal vagy egy toxinnal, így például ricinnel vagy egy enzimmel is konjugálható, és a találmány oltalmi köre az ilyen megjelölt antitestekre vagy antitestkonjugátumokra is kiterjed. Ha kívánatos, antitestek keverékei is alkalmazhatók diagnosztizálás vagy kezelés céljából: például valamely találmány szerinti gombaeredetû stresszfehérje 10 1 20 2 3 4 0 60 eltérõ epitópjait felismerõ, két vagy több antitest keverékei, és/vagy különbözõ osztályokba tartozó antitestek keverékei, pl. ugyanazt vagy eltérõ epitópot felismerõ, találmány szerinti IgG és IgM antitestek keverékei. A találmányt még érthetõbb válik az alábbi leírás révén, amely kizárólag példaként konkrét megvalósítási módokat ismertet az összetételre és az azzal való kísérletezésre. Kísérletek Az alábbiakban ismertetett kísérletekben az amphotericin¹b, caspofungin, voriconazol és itraconazol nevû gombaellenes hatóanyagokkal kombinálva vizsgáltuk a Mycograb (RTM) antitest gombaellenes hatását. A Mycograb (RTM) antitest az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó peptidekben bemutatott epitópokat ismeri fel. Az eredmények azt mutatják, hogy a Mycograb (RTM) antitesttel kombinálva a voriconazol és az itraconazol esetében meglepõen erõteljes szinergiahatás jelentkezik sokféle, klinikailag fontos Aspergillus-fajjal szemben. Ez a szinergiahatás jelentõs horderejû a gombás fertõzések klinikai kezelésében. Anyagok és módszerek Gombaellenes hatóanyagok Az amphotericin¹b (AMB, Sigma), caspofungin (Caspo), voriconazol (VOR) és itraconazol (ITZ) törzsoldatokat a Nemzeti Klinikai Laboratóriumi Szabványosítási Bizottság (M38¹A) elõírása szerint készítettük el, glutamint tartalmazó RPMI 16 táplevesben, amelynek ph¹ját 0,16 mmol/liter morfolino-propánszulfonsavval (MOPS) állítottuk be 7,0¹re. Az AMB törzsoldatokat 100-szoros hígítási sor formájában készítettük el 100%¹os dimetil-szulfoxidban (DMSO), majd tápközegben 0,0312 és 16 g/ml közötti koncentrációkra hígítottuk. A caspofungint, a voriconazolt és az itraconazolt 0,0312 és 1024 g/ml közötti koncentrációkban teszteltük, a Mycograb (RTM) antitestet (NeuTec Pharma Plc.) pedig 0,2 és 1024 g/ml közötti koncentrációkban. Tesztizolátumok Az Aspergillus fumigatus (2), A. flavus (1), A. terreus (1) és A. niger (1) klinikai izolátumait a Manchesteri Királyi Kórház Mikrobiológiai Osztályától (Manchester, Egyesült Királyság) kaptuk. Az antitest A Mycograb (RTM) antitest ami egy gombaeredetû hsp90 stresszfehérje 1. azonosító számú szekvenciával (lásd GB22979 és EP06029) rendelkezõ epitópjára specifikus antitest DNS-szekvenciáját kodonoptimalizálással genetikailag úgy módosítottuk, hogy Escherichia coliban (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) expresszáltatható legyen, majd egy E. coli expressziós vektorba ültettük be. A találmány szerinti Mycograb (RTM) antitest aminosavszekvenciája a 3. azonosító számú szekvenciát tartalmazza (nehéz és könnyû láncok, valamint távtartó domének). 4
A Mycograb (RTM) antitestet egy Escherichia coli gazdában expresszáltattuk és imidazolcserélõ oszlopon affinitáskromatográfiával tisztítottuk, standard molekuláris biológiai protokollok alkalmazásával [ld. például: Harlow és Lane, supra; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Sambrook, J. és Russel, D., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)]. A Mycograb (RTM) antitestet 9%¹os tisztaságig izoláltuk. A Mycograb (RTM) antitest összetételeket az alábbiak szerint állítottuk elõ: fiola, benne 10 mg tiszta Mycograb (RTM) antitest, 10 mg gyógyszerészeti minõségû (Ph Eur) urea és 174 mg L¹arginin (Ph Eur), ml vízben rekonstituált formában. A Mycograb (RTM) antitest keresztreakciója Aspergillus sp.¹bõl származó hsp90-nel Korábban is alkalmaztak immunblotolást az Aspergillus fumigatusra adott antitestes válasz elemzése céljából olyan betegekben, akik allergiás bronchopulmonáris aszpergillózisban, aszpergillómában vagy invazív aszpergillózisban szenvednek. Ennek során számos, 18 és 92 kda közötti molekulatömegû antigént azonosítottak. Az egyik 88 kda¹os antigént a Mycograb (RTM) antitesttel való keresztreakciója alapján hsp90 homológként azonosították [Burnie, J. P., és R. C. Matthews, J. Clin. Microbiol. 29, 2009 106 (1991)]. Az epitóptérképezés alapján kiderült, hogy a Mycograb (RTM) antitest reaktív a 2. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ peptidben bemutatott, az A. fumigatusban és az A. nigerben is konzerválódott epitóppal szemben. 10 1 20 2 3 Gombaellenes szuszceptibilitási teszt Az amphotericin¹b, a caspofungin, a voriconazol és itraconazol, valamint a Mycograb (RTM) antitest minimális gátlókoncentrációját (MIC) táplevesben történõ mikrohígítással határoztuk meg a Nemzeti Klinikai Laboratóriumi Szabványosítási Bizottság M38¹A számú elõírása szerint. Röviden, a következõképpen jártunk el: önmagukban vagy a MIC végpontok és sakktábla ( checkerboard ) titrálások szerint kombináltan, különbözõ koncentrációkban teszteltük az AMB¹t (0,0312 16 g/ml), a caspofungint, a voriconazolt és itraconazolt (0,0312 1024 g/ml) és a Mycograb (RTM) antitestet (0,2 1024 g/ml). Az inokulumszuszpenziókat pufferelt, glutaminos RPMI tápközegben készítettük el oly módon, hogy 7 napos Sabouraud-lemezrõl kolóniákat vizsgáltunk. A szuszpenziót 0,09 0,11¹re (80 82%¹os transzmittancia) állítottuk az Aspergillus-fajokhoz, 0,01 0,17¹re (68 70%¹os transzmittancia). Az inokulumokat ezután 1:2 arányban tovább hígítottuk, amikor a tesztben a gombaellenes hatóanyagokhoz adtuk õket (az inokulumok végsõ koncentrációja: 0,4 10 4 és 0, 10 4 között). Az AMB és a Mycograb (RTM) antitest esetében akár önmagukban, akár kombináltan alkalmazva a végpontot abban a koncentrációban határoztuk meg, ahol nincs növekedés (MIC 0). A mikrotitrálólemezeket az Aspergillus-fajok esetében rázatás nélkül, 48 órán át, 37 C¹on inkubáltuk. A caspofungin, a voriconazol és az itraconazol antitest esetében akár önmagukban, akár a Mycograb (RTM) antitesttel kombináltan alkalmazva az MIC végpontot abban a koncentrációban határoztuk meg, amelynek eredményeként a növekedési kontrollhoz képest jelentõs mértékben csökken a turbiditás (a növekedés legalább 0%¹os gátlása, MIC 2) [Keele et al., (2001); Espinel Ingroff, 2003]. A végsõ gátlókoncentrációt (FIC) minden szer esetében úgy számítottuk, hogy elosztottuk a második szer jelenlétében mért MlC¹t a szer nélkül mért MlC-vel. Mindegyik kombinációnál két frakciót vettünk, amelyeket összegezve kaptuk a frakcionális végsõ gátlókoncentrációt. Definíciónk szerint a legfeljebb 0,¹es értékek jelentettek szinergiát, a 0, és 4,0 közöttiek közömbös hatást, a 4,0 felettiek pedig antagonizmust (Matthews et al., 2003). Eredmények A Mycograb (RTM) antitest az 1. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ peptidben bemutatott epitóp mellett az Aspergillus-fajokban konzerválódott, 2. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ peptidben bemutatott epitópot is felismeri. A Mycograb (RTM) antitest és különféle gombaellenes hatóanyagok kombinálásának hatásait vizsgáló in vitro kísérleteket az 1 4. táblázatokban mutatjuk be. 1. táblázat Az amphotericin¹b és a Mycograb (RTM) antitest sakktáblás vizsgálata különféle Aspergillus-fajokkal Törzs Hatóanyag MIC 0 ( g/ml) mindegyik hatóanyagból FIC ( g/ml) FICI Eredmény önmagában kombináltan A. fumigatus AMB 2 1 0, 0, közömbös Mycograb 12 4 0,01 A. fumigatus AMB 2 1 0, 0,31 közömbös CI2 Mycograb 12 16 0,031
HU 00 980 T2 1. táblázat (folytatás) Törzs Hatóanyag MIC 0 ( g/ml) mindegyik hatóanyagból FIC ( g/ml) FICI Eredmény önmagában kombináltan A. niger AMB 2 1 0, 0, közömbös Mycograb 12 4 0,01 A. flavus AMB 4 4 1 2 közömbös Mycograb 12 12 1 A. terreus AMB 4 4 1 2 közömbös Mycograb 12 12 1 2. táblázat A caspofungin és a Mycograb (RTM) antitest sakktáblás vizsgálata különféle Aspergillus-fajokkal Törzs Hatóanyag MIC 2 ( g/ml) mindegyik hatóanyagból FIC ( g/ml) FICI Eredmény önmagában kombináltan A. fumigatus Caspo 0,12 0,062 0, 0,62 közömbös Mycograb 1024 32 0,062 A. fumigatus Caspo 0,12 0,062 0, 0,62 közömbös CI2 Mycograb 1024 16 0,062 A. niger Caspo 1 0,12 0,12 0,12 szinergia Mycograb 26 0,062 0,0001 A. flavus Caspo 1 0, 0, 0,00 közömbös Mycograb 12 0,062 0,0001 A. terreus Caspo 0,312 0,078 0,2 0,312 szinergia Mycograb 1024 32 0,031 3. táblázat Az itraconazol és a Mycograb (RTM) antitest sakktáblás vizsgálata különféle Aspergillus-fajokkal Törzs Hatóanyag MIC 2 ( g/ml) mindegyik hatóanyagból FIC ( g/ml) FICI Eredmény önmagában kombináltan A. fumigatus ITZ 0, 0,0312 0,062 0,0781 szinergia Mycograb 1024 16 0,016 A. fumigatus ITZ 0, 0,12 0,2 0,278 szinergia CI2 Mycograb 1024 8 0,008 A. niger ITZ 0,12 0,016 0,12 0,37 szinergia Mycograb 16 4 0,2 A. flavus ITZ 0,12 0,0312 0,2 0,2 szinergia Mycograb 12 0,2 0,000 A. terreus ITZ 0,12 0,0312 0,2 0,281 szinergia Mycograb 1024 32 0,031 6
4. táblázat A voriconazol és a Mycograb (RTM) antitest sakktáblás vizsgálata különféle Aspergillus-fajokkal Törzs Hatóanyag MIC 2 ( g/ml) mindegyik hatóanyagból FIC ( g/ml) FICI Eredmény önmagában kombináltan A. fumigatus VOR 0,062 0,0312 0, 0, szinergia Mycograb 1024 0,2 0,0002 A. fumigatus VOR 0,2 0,12 0, 0, szinergia CI2 Mycograb 1024 0,2 0,0002 A. niger VOR 0,12 0,12 1 2 közömbös Mycograb 16 16 1 A. flavus VOR 0,2 0,062 0,2 0,2 szinergia Mycograb 12 0,2 0,000 A. terreus VOR 0,2 0,12 0, 0, szinergia Mycograb 1024 0,2 0,0002 Összefoglalás Az 1 4. táblázatokban bemutatott eredmények alapján kiderül, hogy míg a Mycograb (RTM) antitest önmagában gátolni tudott némely Aspergillus-fajt, itraconazollal kombinálva minden vizsgált fajjal szemben meglepõen nagyfokú gombaellenes aktivitást észleltünk, a voriconazollal kombinálva pedig az A. niger kivételével az összes egyéb vizsgált faj esetében meglepõen nagyfokú gombaellenes aktivitást észleltünk. Nem figyelhetõ meg az antitest és az itraconazol/voriconazol közötti fenti meglepõ hatás, ha az antitestet más orális azol típusú gombaellenes hatóanyagokkal, mint például fluconazollal vagy amphotericin-b-vel vagy caspofunginnak kombináljuk. Következtetések A leírásban bemutatott adatok egyértelmûen igazolják, hogy a Mycograb (RTM) antitest és az itraconazol és voriconazol elnevezésû gombaellenes hatóanyagok között meglepõ szinergia áll fenn, amely hatás igen sokféle, patológiásan fontos Aspergillus-törzzsel szemben fokozta a gombaellenes aktivitást. Az eredmények lehetõvé teszik, hogy emberek és állatok gombás fertõzéseinek kezelésében együttesen alkalmazzunk itraconazolt vagy voriconazolt tartalmazó összetételek és a 2 3 4 Mycograb (RTM) antitestet. A találmány azt is lehetõvé teszi, hogy csökkenthessük a kezelési dózisokat, vagy azonos dózis mellett hatásosabbá teszi a kezelést, ezáltal csökkenti a nemkívánatos mellékhatásokat. A találmánynak számos fontos klinikai következménye van. Elõször is, az Aspergillus fertõzések kezelésében az itraconazol/voriconazol és a Mycograb (RTM) antitest egy szinergisztikus kombinációjának elõállítása kell, hogy a legjobb választássá váljon. Ez pedig majd csökkenti az e fertõzéshez kapcsolódó halálozási és morbiditási arányt. Másodszor, az itraconazol/voriconazol nemkívánatos mellékhatásokat okoz az összetételt szedõ betegekben. A voriconazolhoz például gyakran társul láz, fejfájás, hasfájás, hányinger, hányás, hasmenés, perifériás ödéma, bõrkiütések és látási zavarok. A találmány által biztosított szinergia azt jelenti, hogy az itraconazol/voriconazolból alacsonyabb dózist alkalmazhatunk a hatásosság fenntartása mellett és ezzel párhuzamosan csökkentjük a toxicitást és a káros mellékhatásokat. Harmadszor, a Mycograb (RTM) antitest toxicitáscsökkentõ hatása azt is lehetõvé teszi, hogy feltárhassuk a magasabb dózisban alkalmazott itraconazol/voriconazol klinikai hatásosságát, illetve hozzájárul a klinikai kimenetel javulásához is. Szekvencialista <110> NeuTec Pharma PLC <120> Treatment of fungal infections <1> GDM/JAR-MP101019¹UK <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 7
HU 00 980 T2 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Candida sp. <0> 1 Asn Lys Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val 1 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Aspergillus sp. <0> 2 Lys Ile Met Lys Val Ile 1 <210> 3 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <0> 3 His Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 10 1 Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Cys Ile Ile 20 2 Ser Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 3 4 Glu Trp Met Gly Lys Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Ile Asn Tyr Ser 0 60 Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn 6 70 7 80 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 8 90 9 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Arg Asp Phe Gly Asp Ser Phe Asp Tyr 100 10 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 11 120 12 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln 1 13 1 Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr 14 10 1 160 8
Cys Arg Ala Ser Ser Gly Ile Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 16 170 17 Ala Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu 180 18 190 Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu 19 200 20 Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 210 21 220 Tyr Cys Gln His Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 22 2 23 2 Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Ala 24 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Összetétel, amely olyan antitestet tartalmaz, vagy annak olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely Aspergillus nemzetségbe tartozó organizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint tartalmaz legalább egy gombaellenes hatóanyagot, amely az itraconazolból és a voriconazolból álló csoportból választott. 2. Kombinált készítmény gombás fertõzések kezelésében való egyidejû, külön történõ vagy egymás utáni alkalmazásra, amely készítmény olyan antitestet tartalmaz, vagy annak olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely Aspergillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint tartalmaz legalább egy gombaellenes hatóanyagot, amely az itraconazolból és voriconazolból álló csoportból választott. 3. Az 1. igénypont szerinti összetétel vagy a 2. igénypont szerinti kombinált készítmény, amelyben az antitest vagy annak antigénkötõ fragmense az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó peptidben bemutatott epitópra specifikus. 4. Az 1. vagy a 3. igénypont szerinti összetétel vagy a 2. vagy a 3. igénypont szerinti kombinált készítmény, amelyben az antitest vagy annak antigénkötõ fragmense a 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó peptidben bemutatott epitópra specifikus.. A 3. vagy a 4. igénypont szerinti összetétel vagy kombinált készítmény, amelyben az antitest tartalmazza a 3. azonosító számú szekvenciát. 6. Az 1. vagy a 3. igénypontok bármelyike szerinti összetétel vagy a 2. igénypontok bármelyike szerinti kombinált készítmény gombás fertõzések kezelésében történõ alkalmazásra. 7. A 6. igénypont szerinti összetétel vagy kombinált készítmény, amelyben a gombás fertõzést Aspergillus nemzetségbe tartozó organizmus okozza. 2 3 4 0 60 8. Az. vagy a 6. igénypont szerinti összetétel vagy kombinált készítmény, ahol a gombás fertõzés rezisztens önmagában a gombaellenes hatóanyagra. 9. Az 1. vagy a 3 8. igénypontok bármelyike szerinti összetétel vagy a 2 8. igénypontok bármelyike szerinti kombinált készítmény emberi vagy állati test gombás fertõzéseinek kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra. 10. Eljárás emberek vagy állatok gombás fertõzéseinek kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, azzal jellemezve, hogy olyan antitestet alkalmazunk vagy annak olyan antigénkötõ fragmensét alkalmazzuk, amely Aspergillus nemzetségbe tartozó organizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint az itraconazolból és voriconazolból álló csoportból választott, legalább egy gombaellenes hatóanyagot is alkalmazunk. 11. Összetétel alkalmazása gombás fertõzések kezelésére alkalmazható gyógyszer elõállítására szolgáló eljárásban, amely összetétel olyan antitestet tartalmaz vagy annak olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely Aspergillus nemzetségbe tartozó organizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint itraconazolból és voriconazolból álló csoportból választott, legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz. 12. A 11. igénypont szerinti összetétel alkalmazása, amelyben a gombás fertõzés rezisztens önmagában a gombaellenes hatóanyagra. 13. Reagenskészlet, amely olyan antitestet tartalmaz, vagy annak olyan antigénkötõ fragmensét tartalmazza, amely Aspergillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származó hsp90 legalább egy epitópjára specifikus, valamint itraconazolból és voriconazolból álló csoportból választott, legalább egy gombaellenes hatóanyagot is tartalmaz. 14. A 13. igénypont szerinti reagenskészlet gombás fertõzések kezelésére történõ alkalmazásra. 9
1. Az 1. vagy a 3 8. igénypontok bármelyike szerinti összetétel vagy a 2 8. igénypontok bármelyike szerinti kombinált készítmény, amelyben az antitest vagy antigénkötõ fragmens detektálható jelöléssel van ellátva. 16. Az 1. vagy a 3 8. igénypontok bármelyike szerinti összetétel vagy a 2 8. igénypontok bármelyike szerinti kombinált készítmény, amelyben az antitest vagy antigénkötõ fragmens effektormolekulához van konjugálva. Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest