HASZNÁLATI UTASÍTÁS BINDAZYME Humán Anti-Gliadin IgG EIA kit BINDAZYME Humán Anti-Gliadin IgA EIA kit BINDAZYME Humán Anti-Gliadin IgG/IgA EIA kombi kit In-vitro diagnosztikai alkalmazásra MK035 MK036 MK037 Hungarian A terméket előállítja: The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham, B14 4ZB Magyarországon forgalmazza: Diagnosticum RT. H-1047 Budapest Attila u. 126. Telefon: +36 (01) 369-0739, 369-3684, 380-4500 Fax: +36 (01) 369-4383 www.diagnosticum.hu 1 JAVASOLT ALKALMAZÁS Ez az assay a coeliakia diagnózisának felállításában és kezelésében nyújthat segítséget a gliadin ellenes specifikus IgG vagy IgA antitestek in vitro meghatározásával humán szérumban. A kit elegendő anyagot tartalmaz maximum 41 minta mérésére duplikátumban, vagy 89 mintához mintánként egy mérés esetén, kalibrációs görbe felvételével és 2 kontroll egyidejű meghatározásával. 2 ELMÉLETI HÁTTÉR A coeliakiára jellemző a gluten intolerancia, ami krónikus malabsorptiohoz vezet. Kezeletlen coeliakiás betegekben gliadin (a búza és a rozs glutén alkoholban oldódó frakciója) ellenes IgG és IgA antitesteket mutattak ki 1,2,3. Az IgA antigliadin antitestek (AGA) meghatározása jól használható a betegség aktivitásának követésére, és a gluténmentes diéta megtartásának ellenőrzésére 2. Az IgG AGA érzékenyebb, de kevésbé specifikus markernek tűnik, mint az IgA AGA.. Ajánlott azonban mindkét antitest típus vizsgálata, mivel a coeliakiás betegek között gyakori IgA hiány szerológiailag elfedheti a betegséget. Az IgA hiányos betegek között 10-szer nagyobb a coeliakiában, előfordulásának valószínűsége, mint a normál populációban 4. AGA jelenlétét figyelték meg számos más klinikai állapotban, gastrointestinalis tünetek nélkül. Ilyenek voltak: Down szindróma, szelektív IgA deficiencia, osteoporosis 6, inzulin-dependens diabetes és más autoimmun folyamatok 7. A coeliakiás betegek közül azok, akiknek klinikai tünetei voltak, gyakrabban voltak IgG és IgA AGA pozitívak, mint a tünetmentes páciensek 8. 3 MŰKÖDÉSI ELV A mikrotiter lemez mélyedései gliadin antigénnel vannak bevonva. A kalibrátorokat, kontrollokat és a hígított betegmintákat a mélyedésekbe pipettázzuk. A gliadin antigént felismerő autoantitestek az antigénhez kötődnek az első inkubációs szakaszban. Miután a nem kötődött fehérjéket mosással teljesen eltávolítottuk, peroxidázzal jelölt, tisztított nyúl anti-humán IgG vagy IgA (γ vagy α lánc specifikus) konjugátumot csöppentünk a lyukakba. A konjugátum az előző fázisban rögzült humán autoantitestekhez kötődik, a konjugátum felesleget pedig egy újabb mosással eltávolítjuk. A megkötődött konjugátumot 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) szubsztrát segítségével tesszük láthatóvá, ami kék reakcióterméket ad. A szín intenzitása arányos a mintában lévő autoantitest koncentrációjával. A reakció leállítása céljából minden lyukba foszforsavat adunk. Ez egy sárga színű végterméket eredményez, mely 450 nm-en fotometrálható. 4 FIGYELMEZTETÉS 4.1 VESZÉLYESÉG Valamennyi felhasznált humán szérum donorát kivizsgálták, és negatívnak találták Hepatitis B felszíni antigénekre, és HIV 1 és 2, valamint Hepatitis C vírus elleni antitestekre. Ezek a vizsgálatok azonban nem tudják garantálni, hogy az anyag mentes minden fertőző ágenstől. Megfelelő kezelési és megsemmisítési eljárások bevezetésére van szükség, és csak a potenciálisan fertőző anyagokkal végzett tevékenységre speciális képzettséggel rendelkező személyzetnek szabad engedélyezni a kit használatát. A Na-azid réz és ólom tartalmú vízvezeték csövekkel robbanásveszélyes fémazid komplexet képezhet. Az azid-lerakódás megakadályozása céljából a reagensek maradványainak megsemmisítése során bő vizes öblítést kell alkalmazni. A kitben található pufferek és a szérum különböző enzim-inhibitorokat tartalmaznak, melyek részletes felsorolása az alábbi táblázatban található. Ezek az anyagok óvatosan kezelendők. INHIBITOR Kathon Nátrium Azid Proclin 300 Bromonitrodioxán Methylisothiazon KONCENTRÁCIÓ 0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002% A Proclin bejegyzett (Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA) márkanév A Kathon maró anyag, a bőrrel érintkezve túlérzékenységi reakciót okozhat. A leállító oldat 3M foszforsavat tartalmaz, ami maró anyag. Bőrre, szembe ne kerüljön! A lecsöppenő reagensekkel történt szennyeződést a helyi és környezetvédelmi előírásoknak megfelelően kell megszüntetni. 4.2 ÓVATOSSÁGI SZABÁLYOK A terméket kizárólag megfelelően képzett személy használhatja. Az előírások szigorú betartása ajánlott. Bármely eltérés ettől az assay működését és az eredményeket hátrányosan befolyásolhatja. Figyeljen a jelen használati utasítás figyelmeztetéseire és speciális megjegyzéseire! A különböző gyártási számú (batch number) kitekhez tartozó kalibrátor, kontroll, konjugátum és a lemezek nem felcserélhetőek. Ezeknek az összetevőknek a helyettesítése az adott kittől eltérő gyártási számú termékekkel, nem következetes és nem valós eredményekhez vezethet. Minden egyes mikrotiter csíkot, ami egy adott vizsgálati sorban felhasználásra kerül, ugyanabból a fóliatasakból kell elővenni. A reagensek beszennyeződésének elkerülése céljából kizárólag új, vagy tiszta műanyag illetve üveg edényeket használjon. Soha ne töltse vissza a megmaradt reagenst az eredeti üvegbe. Ne hagyja a reagenstartókat fedetlenül; az emiatt fellépő párolgási veszteség és szennyeződés az eredmény megbízhatóságát csökkenti. A TMB szubsztrátot fénytől és nedvességtől óvni kell. A mikrobiológiai szempontból szennyezett, hemolizált vagy lipémiás szérum, valamint csapadékos, zavaros minták nem használhatók. A pontatlan mintahígítást a teszt kivitelezése közben nem lehet ellenőrizni, mivel a kit kontrolljai használatra kész állapotban kerülnek forgalomba. Kalibrált pipetták és alkalmas belső minőségi kontroll minták használata ajánlatos. Automatizált rendszerek, mintahígítók és más automatizált eszközök használata a manuális módszerrel összehasonlítva kissé eltérő eredményekhez vezethet. Minden laboratórium saját felelőssége az általa használt rendszer teljeskörű validálása, és annak biztosítása, hogy az eredmények a jelen útmutatóban foglalt határokon belül legyenek, és a csatolt QC igazolásnak megfeleljenek. Fontos valamennyi használt készülék kalibrálása és karbantartása a gyártó előírásainak megfelelően. 4.3 TÁROLÁS ÉS STABILITÁS A kit 2-8 C közötti hőmérsékleten tárolandó, fagyasztani tilos. A nem megfelelő tárolási hőmérséklet az eredményeket befolyásolja. A hígított mosópuffer tárolható 2-8 C között, maximum négy hétig, és használható hidegen, a hűtőből közvetlenül elővéve, anélkül, hogy ez a teszt eredményét károsan befolyásolná. A kit lejárati dátuma a külső címkén van feltüntetve. 5 A MINTA VÉTELE ÉS KEZELÉSE A vér vétele vénapunkcióval történik, a természetes alvadási folyamat után a szérumot a sejtes elemektől el kell választani. A szérum a vizsgálat elvégzése előtt 2-8 C között 7 napig tárolható 9, vagy hosszabb tárolás céljából kisebb részletekben lefagyasztható és tárolható -20 C vagy ez alatti hőmérsékleten. Kerülendő a minták ismételt kiolvasztása és visszafagyasztása. A szérum mintákat nem szabad hővel inaktiválni, mivel ez téves pozitív reakciót eredményezhet. 6 ANYAGOK 6.1 A KITBEN MEGTALÁLHATÓ ANYAGOK valamennyi kitben azonosak Instruction Leaflet (Használati utasítás): Az assay részletes leírása. QC Certificate (QC bizonylat): Az adott gyártási sorozathoz tartozó kitek elvárható működési jellemzőit mutatja be. Gliadin Coated Wells (Gliadinnal bevont mérőedények): 12 db, egyenként 8 gliadinnal bevont mérőhelyet tartalmazó, bontható mikrotiter-lemez csík. Minden lemez 2 szárítóbetéttel ellátott, visszazárható fóliatasakba van csomagolva. Type III Sample Diluent (Mintahígító, III-as típus): 2 db 50mL puffert tartalmazó üveg, a minták hígítására. Sárga színű, használatra kész. Type III Wash Buffer (Mosópuffer, III-as típus): 1 flakonban 50mL 20-szoros koncentrációjú puffer a mérőlyukak mosására. TMB Substrate (Szubsztrát): 1 üvegben 14mL TMB szubsztrát. Használatra kész. Stop Solution (Leállító oldat): 1 üvegben 14mL 3M-os foszforsav. Használatra kész. 6.2 TERMÉKSPECIFIKUS ANYAGOK A KITBEN 6.2.1 BINDAZYME (MK035) Gliadin IgG Calibrators (Gliadin IgG kalibrátorok): 5 üveg, mindegyikben 1mL hígított humán szérum, a következő antigliadin IgG autoantitest Gliadin IgG Positive Control (Gliadin IgG pozitív kontroll): 1 üveg, 1mL hígított humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található. Használatra kész humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található Használatra kész Gliadin IgG Conjugate (Gliadin IgG konjugátum): 1 üvegben 12mL tisztított, peroxidázzal jelölt anti-humán IgG. Piros színű, használatra kész. 6.2.2 BINDAZYME (MK036) Gliadin IgA Calibrators (Gliadin IgA kalibrátorok): 5 üveg, mindegyikben 1mL hígított humán szérum, a következő antigliadin IgA autoantitest Gliadin IgA Positive Control (Gliadin IgA pozitív kontroll): 1 üveg, 1mL hígított humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található. Használatra kész humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található Használatra kész Gliadin IgA Conjugate (Gliadin IgA konjugátum): 1 üvegben 12mL tisztított, peroxidázzal jelölt anti-humán IgA. Zöld színű, használatra kész. 6.2.3 BINDAZYME /IgA Kombi kit (MK037) Insert Code: E035.H, Version: 28 March 2006, Page 1 of 5
Gliadin IgG Calibrators (Gliadin IgG kalibrátorok): 5 üveg, mindegyikben 1mL hígított humán szérum, a következő antigliadin IgG autoantitest koncentrációkkal: 100, 33.3, 11,1, 3,7, 1,23 U/mL. Használatra kész. Gliadin IgA Calibrators (Gliadin IgA kalibrátorok): 5 üveg, mindegyikben 1mL hígított humán szérum, a következő antigliadin IgA autoantitest Gliadin IgG Positive Control (Gliadin IgG pozitív kontroll): 1 üveg, 1mL hígított humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található. Használatra kész. Gliadin IgA Positive Control (Gliadin IgA pozitív kontroll): 1 üveg, 1mL hígított humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található. Használatra kész Gliadin IgG Conjugate (Gliadin IgG konjugátum): 1 üvegben 12mL tisztított, peroxidázzal jelölt anti-humán IgG. Piros színű, használatra kész. Gliadin IgA Conjugate (Gliadin IgA konjugátum): 1 üvegben 12mL tisztított, peroxidázzal jelölt anti-humán IgA. Zöld színű, használatra kész. humán szérum. A várható érték a QC bizonylatban található Használatra kész. 6.3 TOVÁBBI SZÜKSÉGES ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK a kit nem tartalmazza Automatikus mikrotiter-lemez mosó berendezés: Használata ajánlott, de a lemezek mosása manuálisan is elvégezhető. Mikrotiter-lemez leolvasó: Legyen képes 450nm-en az optikai denzitás meghatározására, levegőre nullázva. Desztillált vagy ionmentesített víz: Az elérhető legjobb minőségben. Kalibrált mikropipetták: 1000, 100 & 10µL kimérésére legyen alkalmas. Többcsatornás pipetta: Javasolt a 100µL konjugátum, szubsztrát és a leállító oldat gyors bemérésére. Üveg/műanyag csövek: Mintahígításhoz. 7 MÓDSZER 7.1 VIZSGÁLAT ELŐKÉSZÍTŐ LÉPÉSEI 1. A kit szobahőmérsékletűre melegítése A kitet szobahőmérsékleten való felhasználásra tervezték (20-24 C). Vegye elő a kitet a raktározás helyéről és hagyja szobahőn állni kb 60 percig. A mérőedénykéket nem szabad a fóliatasakból kivenni, amíg el nem érték a kívánt hőmérsékletet. MEGJEGYZÉS: A kitet egy hétig szobahőn is lehet tartani. 2. A kit összetevői Használat előtt mindegyik összetevőt óvatosan keverje meg. 3. A mosópuffer hígítása Adjon 50mL mosópuffer koncentrátumot 950mL desztillált vízhez (1/20-as hígítás) egy tiszta edénybe, és keverje össze. Az igénynek megfelelően hígíthat kisebb mennyiségeket is. MEGJEGYZÉS: A hígított mosópuffer legfeljebb négy hétig tárolható 2-8 C között, ezért célszerű csak a szükséges mennyiséget hígítani. Ha a pufferben a mikrobiális szennyeződés legkisebb jele mutatkozik, vagy az oldat befelhősödik, ki kell önteni és friss pufferhígítást kell készíteni. 4. A minták hígítása Hígítson minden egyes mintából 10µL-t 1000µL mintahígítóval (1:100) és jól keverje meg. MEGJEGYZÉS: A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. 5. A csíkok és a keret kezelése Helyezze a szükséges számú mérőedénykét a keretbe. Az A1-es pozíciótól kiindulva töltse be az oszlopokat balról jobbra haladva a lemezen. A lemezzel végzett munka közben tartsa enyhe nyomással a hosszabb oldalakat, hogy a mérőedénykék ki ne potyogjanak. MEGJEGYZÉS: A fel nem használt mérőedényeket azonnal helyezze vissza a fóliatasakba, a szárítóbetétekkel együtt, és szorosan zárja le a tasakokat, hogy csak minimálisan legyenek kitéve nedvességnek. Vigyázzon, hogy a tasakot ne szúrja át vagy szakítsa el, az alábbi okok miatt. FIGYELMEZTETÉS: Ha a mérőedények nedvességnek vannak kitéve, porral vagy egyéb szilárd anyaggal szennyeződnek, ennek eredményeképpen az antigén tönkremegy, és a teszt preciitásának romlásához és téves eredményekhez vezethet. 7.2 A VIZSGÁLAT KIVITELEZÉSE 1. A minták bemérése Pipettázzon 100µL kalibrátort, kontrollt és hígított (1:100) mintát a megfelelő mérőlyukakba. MEGJEGYZÉS: A mintákat célszerű a lehető leggyorsabb tempóban bemérni, az eredmények torzulásának ( drift ) minimalizálása érdekében. A stoppert az utolsó minta bemérése után kell indítani. Inkubálja a lemezeket szobahőmérsékleten 30 percig. 2. Mosás A mosás kritikus része a vizsgálatnak, ezért különleges figyelmet igényel. A nem megfelelően mosott lemez pontatlan eredményt fog adni, gyenge reprodukálhatósággal és magas háttérrel. Az inkubáció után vegye ki a lemezt és mossa lyukanként 250-350µL mosópufferrel 3-szor. A mosás végezhető automatikus lemezmosó segítségével, vagy manuálisan, az alább részletezett módon. Az utolsó automatikus mosási ciklus után fordítsa a lemezt a nyílásokkal lefelé, helyezze egy nedvszívó papírra, és könnyedén ütögetve cseppmentesítse. A lemezek manuális mosása: a. Gyors mozdulattal rázza ki a lyukak tartalmát egy kiöntőbe, b. Cseppmentesítse a lemezt finoman ütögetve szűrőpapíron. c. Töltsön meg minden lyukat 250-350µL mosópufferrel, többcsatornás pipetta segítségével. d. Lapos felületen finoman rázogassa a lemezt. e. Ismételje a folyamatot a-tól d-ig kétszer. f. Ismételje meg az a és a b lépést. 3. A konjugátum felvitele Pipettázzon 100µL konjugátumot minden mérőlyukba, itassa fel az edénykék peremét egy alkalmas anyaggal, hogy az esetleg kifröccsent konjugátumot eltávolítsa. Megjegyzés: A szennyeződés megelőzése érdekében soha nem szabad a megmaradt konjugátumot az eredeti üvegbe visszatölteni. Inkubálja a lemezeket szobahőn 30 percig. 4. Mosás Ismételje a 2. pontban leírt lépéseket. 5. A szubsztrát (TMB) bemérése Pipettázzon 100µL TMB szubsztrátot minden egyes lyukba, itassa fel a lyukak szélét az esetlegesen kifröccsent szubsztrát eltávolítására. Megjegyzés: A szennyeződés megelőzése érdekében kerülje a maradék szubsztrát visszatöltését a reagensüvegbe. Inkubálja a lemezeket szobahőn, sötét helyen 30 percig. 6. A reakció leállítása Pipettázzon 100µL leállító oldatot minden lyukba. Ekkor a reakcióelegy színe kékről sárgára változik. 7. Az optikai denzitás mérése Olvassa le minden egyes lyuk tartalmának optikai denzitását (OD) 450nm-en alkalmas lemezleolvasóval, a reakció leállítása után 30 percen belül. 8 EREDMÉNYEK ÉS MINŐSÉGELLENŐRZÉS 1. Minőségi kontroll Annak érdekében, hogy egy meghatározás érvényes legyen, a következő kritériumok mindegyikének teljesülése szükséges: Minden mérési sorozathoz kalibrátorokat, valamint pozitív és negatív kontrollt kell alkalmazni. A pozitív és negatív kontroll mért értékének a QC bizonylatban megadott határokon belül kell lenni. A kalibrációs görbe alakja a QC bizonylatban bemutatott mintához hasonló kell legyen. Amennyiben a fenti kritériumok valamelyike nem teljesül, az assay nem értékelhető, a vizsgálatot meg kell ismételni. 2. Az Optikai Denzitások átlagainak kiszámítása: (Csak duplikátumban végzett meghatározások esetén) Minden egyes kalibrátor, kontroll és minta-pár esetén számítsa ki a párhuzamos mérések OD átlagát. A párhuzamosok %-os variációs koefficiense (% CV) 15%-nál kisebb kell legyen. 3. Készítse el a kalibrációs görbét A kalibrációs görbe készülhet automatikusan, vagy manuálisan a következő eljárással: ábrázolja minden egyes kalibrátorra vonatkozóan az antigliadin autoantitest koncentrációját logaritmikus skálán, a lineáris skálán jelölt OD értékkel szemben. Automatikus kiértékeléshez használjon megfelelően validált programot, és olyan görbeillesztési módszert, amelyik legjobban megfelel a mért adatoknak. Manuális eljárásnál - log/lin beosztású papíron, rajzoljon sima görbét, ami legjobban illeszkedik a pontokhoz (ne húzzon ferde vonalat a pontok közé, és ne alkalmazzon pontról-pontra szakaszos ábrázolást). 4. Az eltérő pontok kezelése Ha bármelyik pont nem illeszkedik a görbéhez, ki lehet hagyni. Ha azonban a kérdéses pont kihagyása következtében a görbe alakja a mintául adott kalibrációs görbétől eltér, vagy egynél több pont nem illeszkedik, az egész mérést meg kell ismételni. 5. A kontrollok értékeinek kiszámítása Olvassa le a kontrollok antigliadin autoantitest koncentrációját közvetlenül a kalibrációs görbéről. Az értékeknek a QC bizonylatban feltüntetett határokon belül kell esniük. 6. A hígított minták autoantitest tartalmának kiszámítása Olvassa le a hígított minták antigliadin autoantitest koncentrációit közvetlenül a kalibrációs görbéről. MEGJEGYZÉS: A kalibrátor értékek úgy vannak megadva, hogy egy 100-as faktorral a minták 1:100-as hígítását számításba vették. Semmilyen további korrekcióra nincs szükség. 7. Az assay kalibrálása Magát az assay-t U/mL egységben egy használati referens anyaggal kalibrálták, mivel jelenleg nincs nemzetközileg elfogadott referens preparátum. Konverziós (átszámítási) faktor Az eredmények mg/l egységben való megadásához használja az alábbi konverziós faktorokat: IgG 1U/mL = 6mg/L IgA 1U/mL = 3,5mg/L 8. Korlátozások Ez a kit csak kiegészítő információt nyújt a diagnózis felállításához. A pozitív eredmény bizonyos betegségek fennállására utalhat, de ezt klinikai adatokkal és más szerológiai tesztekkel meg kell erősíteni. Ezzel a módszerrel kapott eredmények nem tekinthetők a diagnosztikai bizonyítéknak valamely betegség meglétére vagy hiányára vonatkozóan. Az assay alkalmazhatósága gyermekgyógyászati mintákra nincs kidolgozva. 9 VÁRHATÓ ÉRTÉKEK A referencia tartományt 200 normál véradó szérumának vizsgálata alapján állapították meg. Közülük három megerősítő vizsgálattal is pozitív lett gliadin IgA-ra, három pedig gliadin IgG autoantitestekre nézve (10.4 szakasz). Az itt közölt referens tartományok csak tájékoztatásra szolgálnak. Az ELISA módszerek nagyon érzékenyek, és képesek a minta-populációban jelen lévő igen kis különbségeket is kimutatni. Minden laboratóriumnak ajánlott a saját referencia tartomány meghatározása, ami a vizsgált populációt jellemzi az alkalmazott módszerrel és eszközökkel. Negatív eredmény <10 U/mL <5 U/mL Pozitív eredmény 10 U/mL 5 U/mL Az antigliadin autoantitestek szakirodalomban közölt %-os incidenciája különböző vizsgálati csoportokban az alábbi táblázatban látható 10. Normál kontrollok (n=52) 13 4 Coeliakiás betegek (n=57) 19 5 Kezeletlen coeliakiások (n=100) 78 92 Insert Code: E035.H, Version: 28 March 2006, Page 2 of 5
A kezeletlen felnőttek csoportjában 29 férfi és 71 nőbeteg volt, életkoruk 14-79 év között változott. 10 MŰKÖDÉSI JELLEMZŐK 10.1 PONTOSSÁG INTRA-ASSAY PRECIZITÁS Az intra-assay precizitást hat olyan minta vizsgálatával állapították meg, amelyek antitest tartalma az assay kalibrációs tartományán belül volt. Az egyes minták esetében kapott C.V. % értékek az alábbiak voltak: n=20 Koncentráció (U/mL) % C.V. 1. minta 2,43 6,35 2. minta 9,25 4,79 3. minta 10,04 4,91 4. minta 24,31 3,44 5. minta 30,37 2,80 6. minta 58,42 5,47 n=20 Koncentráció (U/mL) % C.V. 1. minta 4,26 4,54 2. minta 5,53 4,61 3. minta 15,45 5,80 4. minta 29,28 1,51 5. minta 41,08 3,91 6. minta 61,23 3,77 INTER-ASSAY PRECIZITÁS Az inter-assay precizitást hat minta mérésével határozták meg. Három napon keresztül hatszor, alkalmanként két párhuzamos mérést végeztek. Az egyes mintákra kapott C.V. % értékek az alábbiak voltak: n=6 Koncentráció (U/mL) % C.V. 1. minta 2,43 14,59 2. minta 9,56 6,37 3. minta 10,54 10,93 4. minta 23,22 5,18 5. minta 33,35 6,23 6. minta 58,97 7,47 n=6 Koncentráció (U/mL) % C.V. 1. minta 3,22 6,36 2. minta 5,94 6,16 3. minta 18,0 3,99 4. minta 26,56 7,56 5. minta 38,31 9,27 6. minta 57,34 12,48 10.2 ANALITIKAI ÉRZÉKENYSÉG A módszer analitikai érzékenysége 1,23 U/mL, amit két minta többszöri ismételt mérésével állapítottak meg. A minták értéke a legkisebb kalibrációs pont (1,23 U/mL) 1,4-, illetve 1,9-szerese volt (Gliadin IgA) vagy 1,5-, illetve 2,0-szerese volt (Gliadin IgG). A Student t teszttel végzett statisztikai analízis igazolta, hogy ezek a minták egymástól szignifikánsan különböztek (p< 0,0001). 10.3 MÉRÉSI TARTOMÁNY A tesztek mérési tartománya 1,23-100 U/mL. 10.4 REFERENS TARTOMÁNY Anti-gliadin IgA és IgG autoantitest szinteket mértek 200 normál felnőtt véradó szérumában. Az eredmények interpretálására vonatkozó útmutató alapján 1,5% (3/200) lett pozitív gliadin IgA és IgG autoantitestekre nézve. A gliadin IgA pozitív minták közül 2/3 lett pozitív egy alternatív ELISA kittel vizsgálva, míg a gliadin IgG pozitív minták mindegyike az alternatív ELISA teszttel is pozitív lett. Minták száma 200 200 Átlag 1,95 U/mL 1,31 U/mL Standard deviáció 2,19 U/mL 4,57 U/mL Normál felső határa 10 U/mL 5 U/mL Ezen felül, 52 egyéb autoimmun pozitív minta, amelyekben autoantitestek voltak; dsdna, thyreoglobulin, thyreoid microsoma, cardiolipin, ENA és antineutrophil cytoplasma antigénekkel szemben, szintén tesztelésre került ELISA módszerrel, és mindegyiket negytívnak találták gliadin IgA és IgG autoantitestek vonatkozásában. Ugyancsak megvizsgáltak 40 mintát, amelyek Crohn betegségben szenvedő páciensektől (n=21) és colitis ulcerosaban szenvedő betegektől (n=19) származtak. Mind a három gliadin IgG pozitív minta pozitív lett egy alternatív ELISA teszttel is, míg 2/3 gliadin IgA pozitív minta bizonyult csak pozitívnak egy alternatív ELISA kittel vizsgálva. 10.5 RELATÍV SPECIFICITÁS, SZENZITIVITÁS, ÖSSZEHASONLÍTHATÓSÁG A kit relatív specificitását, szenzitivitását és az eredmény egyezését egy alternatív antigliadin IgG és IgA EIA kit segítségével határozták meg. A vizsgálathoz 71 illetve 77 teszt mintát használtak fel. BINDAZYME Alternatív EIA + - + 31 2* - 11** 27 Relatív szenzitivitás 73,8% Relatív specificitás 93,1% Relatív egyezés 81,7% * Pozitív egy másik alternativ EIA kittel. **10/11 minta negatív egy másik alternativ EIA kittel. BINDAZYME Alternatív EIA + - + 33 2-0 42 Relatív szenzitivitás 100,0% Relatív specificitás 95,6% Relatív egyezés 97,4% 10.6 INTERFERÁLÓ ANYAGOK Anti-gliadin IgA és IgG pozitív és negatív mintákhoz adtak egy sor interferáló anyagot, majd az így módosított mintákat tesztelték a gliadin IgA és IgG kitek használatával. Az interferencia vizsgálata az Interference Check A Plus TM Kokusai, Japan módszer alapján történt. Interferáló anyag Bilrubin F (szabad) Bilrubin C (konjugált) Haemoglobin (haemolízisből) Nyirok Rheumatoid faktor Koncentráció 19,3 mg/dl 19,9 mg/dl 485 mg/dl 1550 Unit 45 IU/mL Nem észleltek interferenciát egyik vizsgált mintában sem. 10.7 AZ ASSAY LINEARITÁSA Három mintával ellenőrizték a módszer linearitását, a teljes kalibrációs tartományban, a regressziós együttható R 2 nagyobb volt, mint 0,997 (Gliadin IgA) illetve 0,992 (Gliadin IgG), amikor az aktuálisan mért értékeket az elméletileg várható értékekhez hasonlították U/mL egységben, 96% illetve 97%-os átlagos visszanyeréssel. 10.8 PROZÓNA JELENSÉG VIZSGÁLATA Három pozitív mintát hígítottak 1:6,25 arányban mintahígítóval, (a normál hígítási arány 1:100) az esetleges prozóna effektus felismerésére. A gliadin IgA és IgG assay vizsgálata során valamennyi minta hígítási eredménye megfelelő volt. Nem találtak tévesen negatív értékeket még a legkisebb mértékű hígítás esetében sem, tehát nem észleltek prozóna effektust. FDA (USA) Információ - lásd az angol nyelvű melléklet első oldalán" 11 IRODALOM 1. Jerry S. Trier. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24: 1709-1719. 2. A Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947. 3. Grodzinsky E et al. Anti-endomysium and anti-gliadin antibodies as serological markers for coeliac disease in childhood: a clinical study to develop a practical routine. Acta Peadiatr 1995; 84: 294-298. 4. Chartrand L T et al. Effectiveness of antigliadin antibodies as a screening test for coeliac disease in children. Canadian Med Assoc J. 1997; 157 (5): 527-553. 5. Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease in children. Scand J Gastroenterol. 1997; 27: 367 371. 6. E Lindh et al. Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 1992; 231: 403-406. 7. Cornelius C Cronin, Fergus Shanahan. Insulin-dependent diabetes mellitus and coeliac disease. The Lancet. 1997; 349: 1096-1097. 8. Grodzinsky E et al. High prevalence of celiac disease in healthy adults revealed by antigliadin antibodies. Annals of Allergy. 1992; 69: 66-70. 9. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 10. Sategna-Guidetti C et al. Comparison of Serum Anti Gliadin, Anti- Endomysium and Anti-Jejunum Antibodies in Adult Celiac Sprue. J Clin Gastroenterol 1995; 20 (1): 17-21. 12 A LEMEZ BEOSZTÁSA Lásd a melléklet utolsó oldalán. 0 Insert Code: E035.H, Version: 28 March 2006, Page 3 of 5
ÖSSZEFOGLALÁS 1. Adjon 100µL kalibrátort, kontrollt és 1:100 arányban hígított mintát a megfelelő mérőlyukakba. Mosás. 2. Adjon 100µL konjugátumot minden egyes lyukba. Mosás. 3. Adjon 100µL szubsztrátot minden egyes lyukba. 4. Adjon 100µL leállító (stop) oldatot minden lyukba. Mérje az abszorbanciát 450nm-en. A BINDAZYME márkanév a The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, England tulajdona Insert Code: E035.H, Version: 28 March 2006, Page 4 of 5
A lemez beosztása A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B C D E F + G H Insert Code: E038.H, Version: 28 November 2003, Page 5 of 5