2.2.45. Szuperkriikus fluid kromaográfia Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 2.2.45. SZUPEKITIKUS FLUID KOATOGÁFIA A szuperkriikus fluid kromaográfia (SFC) olyan kromaográfiás elválaszási módszer, melyben a mozgófázis szuperkriikus vagy szubkriikus állapoú fluidum. Az oszlopban alálhaó állófázis vagy kis méreű, szilárd szemcsékből áll, min a folyadékkromaográfiában is használ szilikagél, porózus grafi és kémiailag módosío állófázisok, vagy kapilláris oszlopok eseében lehe érhálós folyadékfilm, mely egyenlees filmbevonao képez a oszlop falán. A szuperkriikus fluid kromaográfiás elválaszás főleg adszorpciós és megoszlásos folyamaokon alapul. KÉSZÜLÉK A készülék rendszerin hűö pumparendszerből, injekorból, ermoszában elhelyeze kromaográfiás oszlopból, deekorból, nyomásszabályzóból és adagyűjő egységből (vagy inegráorból, illeve rekorderből) áll. Pumparendszer A mozgófázis egyenlees áramlási sebességének bizosíása érdekében pumparendszerre van szükség. A nyomásingadozás csökkeneni kell, például úgy, hogy a nyomás alá helyeze oldószer pulzáláscsökkenő egységen áramolajuk kereszül. A csöveknek és a csalakozásoknak ki kell bírniuk a pumparendszer álal lérehozo nyomás. A mikroprocesszorral szabályzo rendszerek az előre meghaározo program szerin képesek ponosan ovábbíani a mozgófázis mind állandó, mind válozó eluensösszeéel eseén. A gradiens elúcióhoz endelkezésre állnak olyan pumparendszerek is, melyek öbb oldószerarályból képesek az oldószerek szállíására. Az oldószerek keverése a pumpa(ák) kis- és nagynyomású oldalán is megoldhaó. Injekorok Szelep segíségével közvelenül injekálhaunk a oszlop elejére. Állófázisok Az SFC-ben alkalmazhaó oszlopba ölö állófázisoka részben a Folyadékkromaográfia (2.2.29.) című fejeze (ölö oszlopok), részben a Gázkromaográfia (2.2.28) című fejeze (kapilláris oszlopok) írja le. A kapilláris oszlopok belső ámérője (#) legfeljebb 100 µm lehe. VIZSGÁLAT Elkészíjük a vizsgálai és az összehasonlíó oldao/oka. Az oldaok szilárd szemcséke nem aralmazhanak. A rendszer alkalmasságának érékeléséhez szükséges kriériumoka a Kromaográfiás elválaszási echnikák (2.2.46) fejeze írja elő. Ugyancsak ez a fejeze írja elő, hogy a rendszeralkalmassági kriériumok eljesíéséhez a kromaográfiás rendszer paraméereinek milyen mérékű válozaása engedheő meg. 2.2.46. KOATOGÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI TECHNIKÁK A kromaográfiás elválaszási echnikák soklépéses elválaszási módszerek, melyeknél a mina komponensei ké fázis, az álló- és a mozgófázis közö oszlanak meg. Az állófázis lehe szilárd vagy folyadék, mely uóbbi szilárd vagy géles hordozóra viszik fel. Az állófázis lehe oszlopba ölve, lemezre kenve vagy filmkén széeríve sb. A mozgófázis lehe gáz vagy folyadék, vagy szuperkriikus fluid halmazállapoú. Az elválaszás adszorpciós, megoszlásos, ioncserés sb. folyamaokon vagy a molekulák közi egyéb fizikai-kémiai különbségeken, min például a mére, a ömeg vagy a érfoga sb. különbözőségén alapul. E fejeze a közös kromaográfiás jellemzők és az álalánosan használhaó rendszeralkalmassági köveelmények definíciói és kiszámíásuk módjá aralmazza. Az elválaszások elvé, a készülékek és a vizsgálaok leírásá a kövekező álalános fejezeek aralmazzák: Papírkromaográfia (2.2.26) Vékonyréeg-kromaográfia (2.2.27) Gázkromaográfia (2.2.28) Folyadékkromaográfia (2.2.29) érekizárásos kromaográfia (2.2.30) Szuperkriikus fluid kromaográfia (2.2.45) DEFINÍCIÓK A cikkelyben foglal haárérékek megállapíásához az alábbi definícióka veék figyelembe. ozgófázisok A mozgófázis rendszerin szén-dioxid, amely poláris módosíó, min például meanol, 2-propanol vagy aceoniril is aralmazha. Az előír mozgófázis összeéele, nyomása (sűrűsége), hőmérséklee és áramlási sebessége vagy az egész kromaográfiás eljárás során állandó (izokraikus, izodenz, izoermikus elúció), vagy egy ado program szerin válozha (a módosíó mennyisége, a nyomás (sűrűség), a hőmérsékle vagy az áramlási sebesség szerini gradiens elúció). Deekorok A legelerjedebben alkalmazo deekorok az ulraibolya/láhaó (UV/Vis) spekrofooméerek és a lángionizációs deekorok. Ezenkívül alkalmazhaók fényszóráson alapuló deekorok, infravörös abszorpciós spekrofooméerek, hővezeőképességi deekorok, illeve egyéb deekorípusok is. 1 Kérjük, figyeljen az álalános cikkelyekre vonakozó ájékozaásra (belső boríó)
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 2.2.46. Kromaográfiás elválaszási echnikák Néhány készülék eseében bizonyos jellemzők, min például a jel/zaj viszony számíása a gyáró álal bizosío szofverrel is megoldhaó. A felhasználó felelőssége annak bizosíása, hogy a szofver álal alkalmazo számíási módszerek összhangban legyenek az Európai Gyógyszerkönyv álal megado köveelményekkel. Amennyiben ez nem eljesül, a szükséges módosíásoka el kell végezni. Kromao gram A kromaogram a deekorválasz vagy a oszlopról jövő eluensben (efluens) mér koncenráció, illeve más, a koncenrációval arányos mennyiség grafikus vagy más módon örénő megjeleníése, az idő, a érfoga vagy a ávolság függvényében. Ideális eseben kromaogramo az alapvonalon egymás köveő Gauss-görbe alakú csúcsok alkoják. reenciós idő (érfoga) vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk, holidő (holérfoga): az az idő (érfoga) vagy ávolság, amelye az alapvonalon, az injekálási pon és a vissza nem aro komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk. egoszlási hányados A mérekizárásos kromaográfiában a komponens elúciós ulajdonsága egy ado oszlopon a megoszlási hányadossal (K0) is jellemezheő, melye a kövekező összefüggéssel számíhaunk: K O ETENCIÓS ADATOK eenciós idő és érfoga Az elúciós kromaográfiában a reenciós idő () a csúcsmaximum helyzeének megadásával a kromaogramról közvelenül meghaározhaó. A reenciós időből a reenciós érfoga (V) az alábbi képleel számíhaó. V ~ v reenciós idő vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk, v a mozgófázis áramlási sebessége. Tömegmegoszlási arány A ömegmegoszlási arány (Dm), más néven kapaciásfakor vagy reenciós fakor, illeve visszaarás (k') definíciója: D m az anyag mennyisége az allófázisban az anyag mennyisége a mozgófázisban V K S c V KC egyensúlyi megoszlási hányados (más néven megoszlási állandó), VS az állófázis érfogaa, V a mozgófázis érfogaa. Egy komponens ömegmegoszlási aránya (kapaciásfakora) a kromaogramról a kövekező összefüggéssel haározhaó meg: m Dm vagy k' reenciós idő (érfoga) vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk, (vagy 0) holidő (holérfoga): az az idő (érfoga) vagy ávolság, amelye az alapvonalon, az injekálási pon és a vissza nem aro komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk. reenciós idő (érfoga) vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a öle pórusaiba eljes mérékben bejuó komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk. Visszaarási fakor A planáris kromaográfiában használ visszaarási fakor F (vagy más néven reenciós fakor (f)) a felviel helyéől a fol közepéig mér ávolság és a felviel helyéől az oldószerfron álal mege ávolság hányadosa. b f a b a vizsgál komponens álal mege ú, a az oldószerfron álal mege ú. KOATOGÁFIÁS ADATOK A csúcso definiálhajuk a csúcs erüleével (A) vagy a csúcs magasságával (h) és a csúcs félérékszélességével (wh), illeve a csúcs magasságával és a csúcs ké inflexiós ponja közö mér szélességgel (wi). Az Alapelvek (1) előírásai minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell 2
2. 2. 46. Kromaográfiás elválaszási echnikák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 Gauss-görbe alakú csúcsok (normális eloszlás, lásd 2.2.46.-1. ábra) eseén az alábbi összefüggés érvényes: w h 1,18w i vagy izodenz körülmények közö nyer kromaogramok alapján az alábbi összefüggés szerin - és wh-e azonos egységben (idő, érfoga vagy ávolság) behelyeesíve számíhajuk ki: N 5,54 wh 2 reenciós idő (érfoga) vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk, wh a csúcsmagasság felénél mér csúcsszélesség (félérékszélesség). 2.2.46.-1. ábra A lászólagos elmélei ányérszám a komponensől, az oszlopól és a reenciós időől függően válozik. Szimmeriafakor Egy csúcs szimmeriafakorá (As) (lásd 2.2.46.-2. ábra) az alábbi összefüggés alapján számíhajuk ki: A 5 w 0,05 2d W 0,05 a csúcsmagasság huszadánál mér csúcsszélesség, d a csúcsmaximumból az alapvonalra bocsáo merőleges és a csúcs felszálló ága közö, a magasság huszadánál mér ávolság. Az 1,0 érék szimmerikus (ideális) csúcso jelez. 2.2.46. -2. ábra Oszlopeljesímény és lászólagos elmélei ányérszám Az oszlop eljesíményére (lászólagos haékonyságára) jellemző lászólagos elmélei ányérszámo (N) az alkalmazo echnikáól függően izoerm, izokraikus ELVÁLASZTÁSIADATOK Felbonás Ké csúcs közöi felbonás (s) az alábbi képle alapján számíhajuk ki: S, 18 ( ) 1 2 wh 1 + w 2 > 1 1 és 2 reenciós idők vagy ávolságok, melyeke az alapvonalon, az injekálási pon és a ké szomszédos komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőlegesek közö mérünk, wh1 és wh2 a csúcsmagasságok felénél mér csúcsszélességek (félérékszélességek). Az 1,5-nél nagyobb felbonás alapvonalon elváló csúcsoka jelen. A fen megado összefüggés nem alapvonalon elváló csúcsok eseében nem felélenül alkalmazhaó. Planáris kromaogram kvaniaív kiérékelésénél a reenciós idők helye a migrációs ávolságoka vesszük alapul, és a felbonás a kövekezőképpen számíjuk ki: S 1,18 a F2 w + w h1 h2 1 ( ) h2 F1 F1 és F2 a felviel helyéől a folok közepéig mér ávolságok és a felviel helyéől az oldószerfron álal mege ávolság hányadosai (visszaarási fakorok), wh1 és wh2 a csúcsmagasságok felénél mér csúcsszélességek (félérékszélességek), a az oldószerfron migrációs ávolsága.
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 2.2.46. Kromaográfiás elválaszási echnikák Hegy völgy arány (Peak-o-valley raio) A hegy völgy arány (p/v) abban az eseben alkalmazhaó rendszeralkalmassági köveelménykén a rokon vegyüleek vizsgálaa során, ha az alapvonalon örénő elválaszás ké csúcs közö nem valósul meg (2.2.46.-3. ábra). p / v H H Hp a kisebbik csúcs magassága a meghosszabbío alapvonalól számíva, Hv a kisebbik és a nagyobbik csúcso elválaszó görbeszakasz minimuma és a meghosszabbío alapvonal közö mérheő ávolság. p v r G 2 Ha nincs más előírás, a ckkelyben megado relaív reenció a módosíalan relaív reenciónak felel meg. Planáris kromaográfiában 2 és 1 helye az F2 és az F1 visszaarási fakorokkal számolunk. 1 A ENNYISÉGI EGHATÁOZÁS PONTOSSÁGA Jel/zaj viszony A jel/zaj viszony (S/N), mely haással van a mennyiségi meghaározás ponosságára, az alábbi összefüggés szerin számíhaó: 2.2.46.-3. ábra 2H S / N h H az előír összehasonlíó olda kromaogramján a vonakozó csúcs magassága (lásd 2.2.46.-4. ábra), melye a csúcs maximuma és az exrapolál alapvonal közö mérünk. Az alapvonal meghaározásához a deekorjele a csúcs félérékszélességének húszszorosáig kövejük. h a háérzaj sávszélessége a vak felvielével vagy injekálásával nyer kromaogram azon részén mérve, a csúcs az előír összehasonlíó olda kromaogramján megjelenne. A sávszélesség meghaározásához a deekorjele az előír összehasonlíó olda kromaogramján kapo csúcs félérékszélességének hússzorosáig kövejük, a csúcs elmélei megjelenési helye elő és uán amennyiben leheséges azonos ideig. elaív reenció A relaív reenció (r) az alábbi összefüggés szerin becsülhejük meg: r 2 1 2 az érine csúcs reenciós ideje, 1 a referenciacsúcs (álalában a vizsgálandó anyag csúcsának) reenciós ideje, holidő (holérfoga): az az idő vagy ávolság, melye az alapvonalon, az injekálási pon és a vissza nem aro komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsáo merőleges közö mérünk. A módosíalan (korrigálalan) relaív reenció (r G ) az alábbi összefüggés szerin számíjuk: 2.2.46.-4. ábra Isméelheőség A válasz isméelheőségé egy összehasonlíó olda egy-
2. 2. 46. Kromaográfiás elválaszási echnikák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 más köveő injekálásával vagy felvielével nyer mérési eredmények százalékban kifejeze relaív szórásával (SD%) jellemezzük, és az alábbi összefüggéssel számíjuk: SD % ( y y) 100 i y n 1 yi az egyes mérési eredmények (csúcs alai erüle, csúcsmagasság, vagy belső sandard alkalmazása eseén erülearány), y a mérési eredmények álaga, n a mérési eredmények száma. 2 A rendszeralkalmassági vizsgála a módszer szerves része, segíségével győződheünk meg a kromaográfiás rendszer megfelelő haékonyságáról. Az oszlop haékonyságának megállapíására alkalmazo paraméerek rendszerin a lászólagos haékonyság, a ömegmegoszlási hányados, a felbonás, a relaív reenció és a szimmeria fakor. A kromaográfiás viselkedés öbbek közö a kövekező ényezők befolyásolhaják: a mozgófázis összeéele, ionerőssége, hőmérséklee, lászólagos ph -ja és áramlási sebessége, az oszlop hossza, a hőmérsékle és a nyomás, és az állófázis ulajdonságai, úgy, min poroziás, szemcsemére, szemcseípus, fajlagos felüle és a fordío fázisú öleek eseében a kémiai módosíás méréke az uókezeléssel (end capping) vagy a szénaralommal sb. kifejezve. Az alkalmazo készülék egyes részeinek alkalmasaknak kell lenniük a iszasági vizsgálaban vagy a aralmi meghaározás során megköveel ponosság elérésére. Ha a cikkely másképp nem rendelkezik, az alábbi köveelményeke kell eljesíeni: A főcsúcs szimmeriafakora ha a cikkely másképp nem rendelkezik 0,8 és 1,5 közö legyen. E köveelmény álalánosan érvényes mind a cikkelyben leír iszasági vizsgálaokra, mind a aralmi meghaározásokra. Az előír összehasonlíó olda isméel injekálásaiból számío relaív szórás nem haladhaja meg a 2.2.46.-1. áblázaban a maximális megengede relaív szórásra Az összehasonlíó olda egymás köveő injekálásaira vonakozó maximális megengede relaív szórás (SDmax) ado haóanyagaralom köveelmény eseén az alábbi összefüggés szerin számíjuk: K SD max KB n 90%, n 1 0,6 90%,5 konsans (0,349), a K 2 6 0,6 kifejezésből számíva, a 6 injekálás és 2 B1,0 eseén szükséges SD érék B 90%, n 1 az egyedi cikkely Definíció ponjában a haóanyag-aralomra megado felső haár és 100% különbsége, n az összehasonlíó olda isméel injekálásainak száma (3 < n < 6), a Suden-féle fakor, 90%-os valószínűségi szinen (ké oldali) és n 1 szabadságfok eseén. ENDSZEALKALASSÁG
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 2.2.46. Kromaográfiás elválaszási echnikák B(%) 2.2.46.-1. ábláza Isméelheőségi köveelmények Az egyes injekálások száma 3 4 5 6 aximális megengede relaív szórás 2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 3,0 0,62 0,89 1,10 1,27 megado érékeke. Ez a köveelmény csak a aralmi meghaározásokra érvényes és a rokon vegyüleek vizsgálaára nem vonakozik. A csúcsra vonakozó kimuaási haár (amely az S/N 3-hoz arozó anyagmennyiség) legyen kisebb, min a rokon vegyüleek vizsgálaa során előír érékelési (elhanyagolási) haár. A csúcsra vonakozó mennyiségi meghaározás haára (amely az S/N 10-hez arozó anyagmennyiség) legyen ugyanakkora vagy kisebb, min a rokon vegyüleek vizsgálaa során előír érékelési (elhanyagolási) haár. A KOATOGÁFIÁS KÖÜLÉNYEK ÓDOSÍTHATÓSÁGA Az alábbiakban ájékozaásul közöljük, hogy a rendszeralkalmassági köveelmények eljesíheősége érdekében milyen mérékben módosíhaók a kromaográfiás vizsgálaok különböző paraméerei anélkül, hogy a módosíás a módszer alapveően megválozaná. Az előír kromaográfiás körülményeke a cikkely kidolgozása során validálák. A iszasági vizsgálahoz vagy a aralmi meghaározáshoz arozó rendszeralkalmassági vizsgálaokkal győződheünk meg arról, hogy az elválaszás haékonysága kielégíi-e a köveelményeke. ivel a kereskedelemben igen sokféle, kromaográfiás ulajdonságaiban különböző, ugyanakkor csak álalánosságban jellemze állófázis kaphaó, az előír rendszeralkalmassági köveelmények bizosíására szükség eseén a kromaográfiás körülményeke kismérékben módosíani kell. Különösen a fordío fázisú folyadékkromaográfiás módszereknél fordulha elő az, hogy az egyes paraméerek módosíása sem eredményez minden eseben kielégíő kromaográfiás meghaározás. Ilyen eseben szükségessé válha az oszlop cseréje egy másik, ugyanolyan ípusú (pl. okadecilszilileze), oszlopra, amely már a megfelelő kromaográfiás viselkedés muaja. A kriikus paraméereknek a rendszeralkalmasság bizosíása érdekében örénő módosíhaóságá a cikkely egyérelműen meghaározza. Több paraméer módosíása, a rendszer haékonyságára gyakorol eseleges kumulaív haás mia, kerülendő. Vékonyréeg- és papírkromaográfia A kifejleszőszer összeéele: a minor oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illeve ±2 abszolú %-kal (százalékponal) módosíhaó aszerin, hogy melyik a nagyobb. Például egy, a mozgófázisban/kifejleszőszerben 10 % mennyiségben jelen lévő minor komponens eseében az összeéel 30 (relaív) %-os módosíása mennyiségének 7 és 13 % közi válozaásá eszi leheővé, míg a 2 abszolú %-os (azaz százalékponos) módosíás a komponens mennyiségének 8 és 12 % közöi módosíásá engedi meg, ezér ebben az eseben a relaív százalékos módosíás a nagyobb; egy, a mozgófázisban 5 % mennyiségben jelen lévő minor komponens eseében a 30 (relaív) %-os módosíás 3,5 6,5 % közi válozaás, míg a 2 abszolú %-os módosíás 3 7 % közi válozaás enged meg, ehá ebben az eseben az abszolú százalékos módosíás nagyobb. A öbbi komponens mennyisége ±10 százalékponnál nagyobb mérékben nem válozahaó. A kifejleszőszer vizes komponensének ph -ja: ha a cikkely másképp nem rendelkezik, ±0,2 ph-egységgel, semleges kémhaású vizsgálandó anyag eseében ±1,0 phegységgel módosíhaó. A kifejleszőszer ompíóolda-komponensének sókoncenrációja: ±10%-kal módosíhaó. A felvi mennyiség: finom szemcseméreű réeg alkalmazása eseén az előír érfoga 10 20%-ára csökkenheő. Az oldószerfron álal mege ú nem lehe kevesebb, min 50 nm, illeve nagy haékonyságú lemezek eseén, min 30 nm. Folyadékkromaográfia A mozgófázis összeéele: a minor oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illeve ±2 százalékponal módosíhaó aszerin, hogy melyik a nagyobb. A öbbi komponens mennyisége ±10 százalékponnál nagyobb mérékben nem válozahaó (lásd a feni példá). A mozgófázis vizes komponensének ph -ja: ha a cikkely másképp nem rendelkezik, ±0,2 ph-egységgel, semleges kémhaású vizsgálandó anyag eseében ±1,0 ph-egységgel módosíhaó. A mozgófázis ompíóolda -komponensének sókoncenrációja: ±10%-kal módosíhaó. Deekálási hullámhossz: nem módosíhaó. Állófázis: az oszlop hossza: ±70%-kal, az oszlop belső ámérője: ±25%-kal válozahaó, a szemcsemére: legfeljebb ±50%-kal csökkenheő, növelni nem lehe. Áramlási sebesség: ±50%-kal módosíhaó. Amennyiben a cikkely jelzi a főcsúcs reenciós idejé, és az alkalmazo oszlop belső ámérője elérő, az áramlási sebessége módosíani kell. Az áramlási sebesség nem csökkenheő, ha a cikkely megadja a lászólagos elmélei ányérszámo. Hőmérsékle: ±10 %-kal, de legfeljebb 60 ~C-ig módosíhaó. Injekál érfoga: csökkenheő, feléve, hogy a deekálás és a meghaározandó csúcs(ok) isméelheősége kielégíő. Gradiens elúció: az alkalmazo készülék felépíése szignifikánsan megválozahaja a módszerben leír felbonás, reenciós idő és a relaív reenciós időke. Amennyiben ez a helyze áll elő, annak feleheően az az 76 Kérjük, figyeljen az álalános cikkelyekre vonakozó ájékozaásra (belső boríó)
oka, hogy eluensek keveredési helye és az oszlop eleje közöi érfoga (dwell volume) úlságosan nagy. Gázkromaográfia Állófázis: az oszlop hossza: ±70%-kal, az oszlop belső ámérője: ±50%-kal válozahaó, a szemcsemére: legfeljebb ±50%-kal csökkenheő, növelni nem lehe. a filmvasagság: 50 és +100% közö válozahaó. Áramlási sebesség: ±50%-kal módosíhaó. Hőmérsékle: ±50%-kal módosíhaó. Injekál érfoga: csökkenheő, feléve, hogy a deekálás és az isméelheőség kielégíő. Szuperkriikus fluid kromaográfia A mozgófázis összeéele: ölö oszlopok eseén a minor oldószerkomponens mennyisége ±30%-kal, illeve ±2 százalékponal módosíhaó aszerin, hogy melyik a nagyobb. Kapilláris oszlopok eseében nem módosíhaó. Deekálási hullámhossz: nem módosíhaó. Állófázis: az oszlop hossza: ±70 %-kal, az oszlop belső ámérője: ±25%-kal (ölö oszlopok eseén) ±50%-kal (kapilláris oszlopok eseén) válozahaó, a szemcsemére: legfeljebb 50%-kal csökkenheő, növelni nem lehe (ölö oszlopok). Áramlási sebesség: ±50%-kal módosíhaó. Hőmérsékle: ±10%-kal módosíhaó. Injekál érfoga: csökkenheő, feléve, hogy a deekálás és az isméelheőség kielégíő. Deekor válasz. A deekor érzékenysége a mozgófázissal a deekorba belépő anyag koncenrációvagy ömegegységére vonakozao kimenő jel. A relaív deekor válaszfakor amelyre gyakran csak válaszfakorkén hivakozunk a deekor érzékenységé egy sandard anyagra vonakozava fejezi ki. A korrekciós fakor a válaszfakor reciproka. Külső sandard módszer. A vizsgál komponens(ek) koncenrációjá a vizsgálai oldaal nyer válasz(ok) [csúcs(ok)] és az összehasonlíó oldaal nyer válasz(ok) [csúcs(ok)] összehasonlíásával haározzuk meg. Belső sandard módszer. A vizsgálai és az összehasonlíó oldahoz azonos mennyiségű, a vizsgálandó anyagól elváló anyago adunk. A belső sandard a vizsgálandó anyaggal nem reagálha; sabilnak kell lennie, és nem aralmazha olyan szennyező anyagoka, melyek reenciós ideje hasonló a vizsgálandó anyag reenciós idejéhez. A vizsgálandó anyag koncenrációjá úgy haározzuk meg, hogy összehasonlíjuk a vizsgálai olda eseén mér ké csúcs (a vizsgálandó anyagé és a belső sandardé) erüleeinek vagy magasságainak arányá az összehasonlíó olda eseén mér ugyanezen aránnyal. Normalizációs eljárás. A vizsgálandó anyag egy vagy öbb komponensének százalékos mennyiségé úgy haározzuk meg, hogy erüleé/erüleüke a csúcsok összerüleének százalékában fejezzük ki. Az összerüle kiszámíásánál az oldószerből vagy a hozzáado reagensekből eredő csúcsoka, és azoka, melyeknek a erülee kisebb, min a megado érékelési (elhanyagolási) haár, nem vesszük figyelembe. Kalibrációs eljárás. eghaározzuk a mér vagy számío jel (y) és az anyag mennyisége (koncenrációja, ömege sb.; x) közöi összefüggés, és kiszámíjuk a kalibrációs függvény. Az analiikai eredmény úgy kapjuk meg, hogy az inverz függvény segíségével a mér vagy számío jelből kiszámíjuk az anyag mennyiségé. ENNYISÉGI EGHATÁOZÁS Az Alapelvek (1) előírásai minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell 76
2.2.47. Kapilláris elekroforézis Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 4, 4.1 és 4.2 A aralmi meghaározások és más mennyiségi meghaározások eseén a cikkely a külső sandard módszer, a belső sandard módszer vagy a kalibrációs eljárás írja elő, a normalizációs eljárás álalában nem használaos. A rokon vegyüleek vizsgálaa során álalában vagy a külső sandard módszer (egy összehasonlíó oldaal), vagy a normalizációs eljárás használaos. ind a normalizációs eljárásnál, mind a külső sandard módszer eseében, ha összehasonlíáskén a vizsgálai olda valamely hígíása használaos, a rokon vegyüleek válaszának hasonlónak kell lennie az anyagéhoz (a válaszfakor 0,8 és 1,2 közö van), ha ez nem eljesül, a cikkely megadja a korrekciós fakoroka. Amikor a rokon vegyüle vizsgála a szennyezők összegzésé, vagy egy ado szennyező mennyiségi meghaározásá írja elő, nagyon fonos, hogy megfelelő küszöbéréke és megfelelő körülményeke állísunk be a csúcserüleek inegrálásához. Az ilyen vizsgálaokban az érékelési (elhanyagolási) haár, azaz pl. az a erülehaár, mely ala a csúcsoka nem vesszük figyelembe, (a fő csúcs erüleének százalékában megadva) rendszerin 0,05%. Az adagyűjő-rendszeren beállío küszöbérék (hreshold limi) ne legyen nagyobb, min az érékelési (elhanyagolási) haár fele. A főcsúcsól nem eljes mérékben elváló csúcsok erüleének inegrálására leginkább a völgyől völgyig (valleyo-valley) exrapolálás (angenciális simíás) alkalmazhaó. Nem vesszük figyelembe a mina feloldására használ oldószer(ek) csúcsá/csúcsai sem. 2.2.47. KAPILLÁIS ELEKTOFOÉZIS ÁLTALÁNOS ALAPELVEK A kapilláris elekroforézis fizikai vizsgálómódszer, amely elekrolioldaban oldo ölö részecskék egyenáramú elekromos erőér haására bekövekező, kapillárison belüli vándorlásán alapul. A vizsgál anyag vándorlási sebességé E erősségű elekromos erőérben az anyag elekroforeikus mozgékonysága (mobiliása) és a ompíóolda kapillárison belüli elekroozmoikus mozgékonysága szabja meg. Az oldo anyag elekroforeikus mozgékonysága (µep) az oldo anyag ulajdonságaiól (elekromos ölés, molekulamére és alak) és a vándorlás közegéül szolgáló ompíóolda ulajdonságaiól (az elekroli ípusa, az ionerősség, a ph, a viszkoziás és az adalékanyagok) függ. Az oldo anyag elekroforeikus sebessége (vep) feléve, hogy gömb alakú az alábbi egyenleel írhaó le: ~ ~ v E q_ ~ V ~ 6~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ep ep ~ ~ r~ L q az oldo anyag effekív ölése, ~ az elekroliolda viszkoziása, r az oldo anyag Sokes-sugara, V az alkalmazo feszülség, L a kapilláris eljes hossza. Ha egy ompíóoldaal ölö kapillárisban elekromos erőere hozunk lére, a kapilláris belsejében az oldószer áramlásba jön, melye elekroozmoikus áramlásnak nevezünk. Az elekroozmoikus áramlás sebessége függ az elekroozmoikus mozgékonyságól (µeo), mely a kapilláris belső falának öléssűrűségéől és a ompíóolda ulajdonságaiól függ. Az elekroozmoikus sebesség (veo) az alábbi egyenleel írhaó le: v E V ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ eo eo ~ ~ ~ ~ ~ L ~ a ompíóolda dielekromos állandója, a kapilláris felüleének zéa-poenciálja. A meghaározandó anyag elekroforeikus és elekroozmoikus mozgékonysága az oldo anyag öléséől (poziív vagy negaív) függően azonos irányú és ellenées irányú is lehe, ezér az oldo anyag sebessége (v): v v ep ~ v eo Aól függően, hogy a sebességek iránya megegyező vagy ellenées, a ké mennyiség összegével vagy különbségével számolunk. Ha a körülmények olyanok, hogy az elekroozmoikus sebesség nagy az oldo anyagok elekroforeikus sebességéhez képes, negaív és poziív ölésű részecskék egyidejűleg is elválaszhaók. Az az idő (), mely ahhoz szükséges, hogy az oldo anyag a kapillárisban az injekálás helyéől a deekálás helyéig (l, a kapilláris effekív hossza) vándoroljon, az alábbi egyenleel adhajuk meg: ll L v v ep ~ ~eo ep eo V ~ ~ ~ ~ Az elekroforézisben alkalmazo kvarckapillárisok öbbségének belső fala negaív ölésű, mely a kaód felé irányuló elekroozmoikus áramlás hoz lére. Az oldo anyag vándorlási sebességének jó reprodukálhaóságához az elekroozmoikus áramlásnak analízisről analízisre állandónak kell lennie. Néhány alkalmazáshoz szükség lehe az elekroozmoikus áramlás csökkenésére vagy visszaszoríására. Ehhez vagy a kapilláris belső falá módosíják, vagy a ompíóolda ph -já válozaják meg. A mina kapillárisba juaása uán, a mina minden ionja a háér elekroliban, elekroforeikus mozgékonyságának megfelelően, különálló zónákban vándorol. A zónaszélesedés, azaz az oldo anyagok sávjainak kiszélesedése, öbb kü- 76 Kérjük, figyeljen az álalános cikkelyekre vonakozó ájékozaásra (belső boríó)