Folyadékkromatográfiával kapcsolt elektrospray ionizációs tandem tömegspektrometria (HPLC-ESI-MS/MS) alkalmazása analitikai célokra 1 A HPLC-MS/MS a mai nagyműszeres analitika egyik legnépszerűbb és egyre szélesebb körben elterjedt technikája. Elvénél fogva nagyfokú szelektivitása, univerzalitása (a tömegmérés univerzális detektálást tesz lehetővé), szerkezeti információk szolgáltatása és nagy érzékenysége miatt a nyomnyi mennyiségek komplex mátrixokban történő meghatározásában az első számú módszerré lépett elő az utóbbi évtizedben. A folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria összekapcsolása sokáig nem volt megoldott. A gázkromatográfiával ellentétben ahol már az elválasztás is gázfázisban történik nem volt egyszerű megoldani a csatolást. A folyadék formában érkező mintát el kell először párologtatni, az oldószertől meg kell szabadulni, és csak a gázfázisba került töltött részecskéket (ionokat) lehet a nagyvákuum alatt működő analizátorba juttatni. E probléma megoldásáért Nobel-díjban részesült John B. Fenn a ma egyik legelterjedtebb ionizációs mód, az elektrospray ionizáció kifejlesztéséért 2002-ben. 1. A HPLC/MS berendezés A berendezés HPLC és MS készülékek kombinálásának tekinthető, ennek megfelelő részegységekből áll. A mintabevitelt maga a folyadékkromatográf végzi. Az egész tömegspektrométert a HPLC készülék detektorának tekinthetjük, és kromatogramokat (idő függvényében ionintenzitás) vehetünk fel. Lehetőség van a kromatogram minden pontjában tömegspektrumot (egy adott retenciós időnél m/z függvényében az ionintenzitás) is felvenni egyidejűleg, továbbá MS/MS kísérletek esetén adott fragmentációkról kaphatunk információt minden retenciós időnél. Az ionforrás végzi az oldószer-eltávolítást és a semleges molekulákból, töltött gázfázisú ionok előállítását. A HPLC-MS-ben a legelterjedtebb ionizációs módok a légköri nyomáson működő technikák (atmospheric pressure ionisation, API; lásd lejjebb). Az analizátor végzi a töltött ionok tömeg/töltés (m/z) szerinti szétválasztását. Különböző analizátorok terjedtek el, úgymint kvadrupol, repülési idő, ioncsapda, mágneses szektor és ion ciklotron rezonancia típusú. Az analizátort beállíthatjuk úgy, hogy csak a kiválasztott ionokat juttassa a detektorba, vagy úgy is, hogy egy tömegtartományt figyel, és ezáltal abban a tartományban minden képződő ion detektálásra kerül. A detektorok az analizátor felől érkező ionokat felfogják, és sokszorozzák, felerősítik az ionok által keltett elektromos jelet. 1 Az általános bevezető Renkecz Tibor és Dr. Horváth Viola (BME VBK) leírásának adaptációja. http://oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/anal/msc_analkem%28ii+muszerezes%29_gyogyszeranal/hplc- MS-gyakorlati%20felk%E9sz%FCl%E9si%20tananyag.pdf
A tömegspektrométer analizátor és detektor egysége vákuum alatt van, hogy a képzett ionok ne rekombinálódjanak, ne ütközzenek gázmolekulákkal. Az egész rendszer vezérlését számítógéppel végezzük, amely lehetővé teszi az adatok gyűjtését, kiértékelését, visszakeresését. 2. Az ionforrás A legelterjedtebb ionizációs módok a HPLC-MS-ben a légköri nyomáson működő technikák (API). Két fontos folyamat játszódik le az ionforrásban: - a mérendő molekulák deszolvatációja: az oldószer-molekulák eltávolítása, miáltal a mérendő molekula gázfázisba jut - töltött részecskék előállítása: amennyiben a mérendő molekulák eredetileg töltéssel nem rendelkeznek, akkor a megfelelő ionok előállítása szükséges, hogy azok az analizátorba juttathatók legyenek, és ezáltal detektálhatóvá váljanak. Fontos különbség a GC-MS-ben történő ionképzéssel szemben, hogy itt minden esetben egy protonálódási vagy deprotonálódási, esetleg adduktképződési (ekkor pl. nátrium-, kálium vagy ammóniumion társul a molekulához) folyamattal jár az ionizáció. További eltérést jelent még, hogy itt lágy ionizációról beszélhetünk, nincs fragmentálódás az ionforrásban, azaz a molekulák nem tördelődnek szét. Így az itt előállt ionok pszeudo-molekulaionként jelennek meg a tömegspektrumban. Pozitív ionizáció esetén leggyakrabban [M+H] +, negatív ionizáció esetén [M H],vagyis a semleges molekulatömeghez képest mindig egy egységgel odébb kell keresnünk a molekulaiont. Az egyik legelterjedtebb légköri nyomáson működő ionizációs technika az elektrospray ionizáció (electrospray ionization, ESI), melynek vázlatos rajza itt látható: A módszer jellemzői: - A folyadékkromatográf felől érkező eluens egy nagyfeszültségre (3000-5500 V) kapcsolt kapillárison (átmérője ~0,1 mm) érkezik a fűtött ionforrásba. A kapillárist koncentrikusan körülveszi egy másik cső, amelyben porlasztógáz (nebulizing gas) áramlik.
- Így a kapilláris végén finom cseppek formájában, porlasztva lép ki a folyadék, amely már a feszültség hatására töltéssel rendelkezik (elektrospray). - Ezután a forró (200 500 C) szárítógáz (drying gas, desolvation gas) hatására az oldószer párologni kezd, a cseppek zsugorodnak, és elindulnak az ellentétes potenciálra kapcsolt sampling plate irányába (bár a különböző ESI források elve ugyanaz, a pontos felépítés kicsit változhat, egy rokon alkatrész a sampling cone). - Felületi töltéssűrűségük megnő, majd egy kritikus értéket elérve szétrobbannak. Ezt a jelenséget nevezik Coulomb-robbanásnak. A csepp így egyre kisebb és kisebb cseppekre esik szét, míg végül egyetlen ion marad egy cseppben, és ez az oldószer teljes elpárolgása után már a nagyvákuum alatt levő analizátorba juttatható egy nagyon apró lyukon, az orifice-en keresztül. - Az orifice és a sampling plate közötti teret folyamatosan öblítik nitrogén gázzal, ami a sampling plate nyílásán a tömegspektrométerből kifelé áramlik, annak érdekében, hogy az analizátorba csak a töltött ionok jussanak be, egyéb szennyező molekulák ne. A HPLC-MS-ben oldószerként a fordított fázisú folyadékkromatográfiában használt eluensek használhatók, azzal a megkötéssel, hogy csak illékony puffereket használhatunk (pl. ammóniumacetát és -formiát). Foszfátpuffer használata kerülendő, mivel kiválhat a kapillárisban, HPLC-UV módszerek HPLC-MS-re történő átvételénél ezt mindig figyelembe kell venni. Elmondható, hogy ESI ionforrással a poláris, kis molekulatömegű vegyületektől akár a nagy biomolekulákig minden ionizálható. Különösen alkalmas oldatban már eleve egyszeres vagy többszörös töltéssel rendelkező, illetve (de)protonálódásra, kationokkal vagy anionokkal történő adduktképzésre hajlamos anyagok mérésére. Ennek megfelelően a ph, illetve az adduktképzéshez rendelkezésre álló ionok jelenléte nagyban befolyásolja az ionizáció hatásfokát. Kevésbé poláris, vagy apoláris vegyületek esetében egyéb ionizációs technikákhoz kell fordulnunk. 3. Analizátor Az analizátor feladata, hogy az ionforrásban előállított ionokat megszűrje és szétválassza tömeg/töltésszám (m/z) szerint. Az egyik gyakran használt, ún. kvadrupól analizátorban elektromos mezőket alkalmazunk a tömeg/töltés szerinti szétválasztáshoz. A kvadrupól 4 darab, kb. 5-10 cm hosszú párhuzamos fémrúdból áll, ezekre kapcsolunk rá váltó- és egyenfeszültséget. A rudak polaritása folyamatosan változik, emiatt az ionok oszcilláló mozgásra kényszerülnek. Az ionok csak akkor jutnak keresztül a kvadrupól pólusai között, ha a mozgás amplitúdója kisebb a kvadrupól rudak közötti távolságnál. Amennyiben az amplitúdó ezt meghaladja, beleütköznek a rudakba és a vákuum elszívja őket. A kvadrupól analizátor tömegfelbontása egységnyi (ez kifejezés azt jelenti, hogy az analizátor két, egymástól egy tömegegységgel különböző iont tud elválasztani), és a felső tömeghatára általában néhány ezer m/z.
4. Tandem tömegspektrometria Ez a technika lehetővé teszi, hogy szerkezeti információt nyerjünk a vizsgálandó molekulákról. Mint ahogy azt már említettük, a HPLC-MS ionizációs módszerek ún. lágy ionizációt biztosítanak, fragmensek képződése minimális. Ezért a készüléken belül kell létrehozni a molekulaionokból a fragmensionokat, kis nyomású gázzal való ütköztetéssel. A tandem tömegspektrométerek egyik típusa a tripla kvadrupól tömegspektrométer, mely három egymás után kapcsolt kvadrupól (Q) analizátort tartalmaz: - Az első analizátor (Q1) kiválasztja az adott molekulaiont (ezt nevezik anyaionnak is, angolul parent ion). - Majd ezt követi egy ún. ütközési cella (Q2), ahol gázbevezetés hatására bekövetkezik a kiválasztott ion fragmentációja (itt a kvadrupól célja nem a szétválasztás, hanem az ionok mozgási energiájának növelése). - Ezután egy újabb analizátor egységet (Q3) kell kapcsolnunk, hogy a keletkezett új fragmensionokat (nevezik leányionnak is, az angol szaknyelvben product ion vagy daughter ion kifejezés terjedt el) tömeg/töltés szerint szétválogassuk. Kétféle módon használhatjuk az analizátorokat: - Pásztázó (SCAN) módban egy adott tömegtartományt vizsgálhatunk, a kvadrupól által átengedett ion m/z-je egy intervallumot pásztáz végig újra és újra.
- Szelektív ion figyelés (selective ion monitoring, SIM) módban ismerjük a kiválasztani vagy detektálni kívánt ionok tömegét, és ekkor csak a rájuk jellemző potenciálértékeket állítjuk be. A hármas kvadrupolt mindenekelőtt lehet egyszeres kvadrupolként (single quadrupol) üzemeltetni. Ekkor a Q1 végzi a keletkezett molekulaionok szétválasztását, majd ezek jutnak a detektorba, nincs tehát fragmentálás, és a Q3 kvadrupol sem működik. Lehet vele pásztázni (SCAN mód) és lehet csak kiválasztott ionokat is figyelni (SIM mód). Tandem tömegspektrometriában mindig az anyaion leányion viszonyt vizsgáljuk valamilyen módon, és attól függően, hogy milyen módban használjuk a két analizátorcellát, többféle tandem tömegspektrometriás üzemmódot különböztetünk meg. Leányion-analízis (Product ion scan) Ekkor a Q1 kvadrupol egy meghatározott molekulaiont enged át, és a Q2-ben történő fragmentálás után az összes keletkezett fragmens detektálásra kerül a (Q3 SCAN), egy fragmensiontömegspektrumot veszünk fel. Szerkezeti információk nyerhetők. A legintenzívebb fragmensionokat is itt választhatjuk ki a fejlesztendő kvantitatív analitikai módszerhez. Anyaion-analízis (Precursor ion scan) A Q3 kvadrupol csak meghatározott tömegű fragmensionokat enged át. A Q1-ben pedig pásztázás történik, és minden olyan molekulaion azonosítható, amelynek fragmentációja során az adott tömegű leányion (is) képződik. Semlegestömeg-vesztés (Neutral loss scan) Mindkét kvadrupol beállított tömegtartományt pásztáz. A Q3 mindig egy meghatározott semleges tömeggel (pl. 18-víz, 180-glükóz) eltolt kisebb értékre áll be. Ezáltal olyan folyamatok mutathatók ki, ahol egy semleges molekula lép ki az anyaionból. Kiválasztott ionfolyamat követése (Multiple reaction monitoring, MRM, vagy Selected Reaction Monitoring, SRM) Mindkét kvadrupol SIM-módban működik, csak meghatározott anyaiont (Q1) és a hozzátartozó meghatározott fragmensiont (Q3) engednek át. Több adott molekula is figyelhető egyszerre, ha több m/z értékpárt használunk. Nagyon kis koncentrációk mennyiségi meghatározásánál ez a legelterjedtebb üzemmód, mivel nagyfokú szelektivitást és érzékenységet biztosít. A nagyfokú szelektivitás magyarázata a következő: annak valószínűsége, hogy két különböző molekula azonos móltömeggel (azonos molekulaionnal) rendelkezik viszonylag nagy. Például több száz ismert vegyületnek van 250 körüli móltömege. Annak valószínűsége azonban, hogy ezek a fragmentáció során ugyanolyan fragmenseket képeznek, sokkal kisebb. Tehát, ha az anyaion-leányion átmenetet mérjük, sokkal kisebb a valószínűsége, hogy más vegyületet mérünk, mint amelyikre kíváncsiak vagyunk. Ugyanez az oka, hogy a mérés sokkal érzékenyebb, mivel sokkal kisebb a zaj, tehát a jel/zaj viszony, vagyis a kimutatási határ megnő. A hármas kvadrupól single kvadrupóllal szembeni előnyei mennyiségi meghatározásnál tehát a szelektivitás, és a kiemelkedő érzékenység.
5. Analitikai alkalmazás belső standard és standardaddíció A hármas kvadrupól tandem tömegspektrometriát leggyakrabban HPLC-vel kapcsolva mennyiségi meghatározásokra használják MRM módban. Bonyolult mintamátrixokból, például vérből, vizeletből, élelmiszerekből, talajextraktumokból stb. történő nyomnyi mennyiség elemzését teszi lehetővé. Mennyiségi meghatározásokhoz ha van rá mód belső standard módszert használnak, azaz nem közvetlenül a vizsgált molekulára mért intenzitást használják, hanem azt elosztják a mintában eredetileg nem lévő, ahhoz ismert, konstans koncentrációban hozzáadott molekulára mért intenzitással. Ezzel a mintaelőkészítés szórása, valamint a mérőműszer érzékenységének változásából adódó bizonytalanság küszöbölhető ki. Ez utóbbi abból adódik, hogy ha például egy 500 vérmintából álló mérési sorozatunk van, akkor az első injektálásnál és az 500. injektálásnál a készülék nem lesz ugyanolyan érzékeny, mert az ionforrás elkoszolódhat, és csökken az érzékenység. Belső standard használatával ezt figyelembe vesszük, hiszen akkor az arra kapott jel is kisebb lesz az 500. injektálásnál, nemcsak a mérendő komponensé. Természetesen a jelcsökkenésnek ugyanolyan mértékűnek kell lennie a mérendőre és a belső standardre nézve egyaránt. Ez úgy biztosítható, hogy a célvegyülethez nagyon hasonló vegyületet választunk. A meghatározandó anyaghoz legjobban hasonlító anyag annak deuterált változata, amely kémiailag azonosan viselkedik (ugyanott van a retenciós ideje is!), de a tömegkülönbség folytán külön detektálható; amennyiben ez nem áll rendelkezésre, más hasonló kémiai sajátságú vegyület is választható. Ahhoz, hogy a tömegspektrométeren mért intezitásokból koncentrációkat kaphassunk, kalibrációra van szükség. Mivel egy bonyolult mátrix a mérni kívánt komponens ionizációs hatásfokát befolyásolhatja, a szokásos kalibrációs sor készítése helyett gyakori a standardaddíció alkalmazása. Ilyenkor az ismeretlen koncentrációjú (x) mintából olyan oldatsorozatot készítünk, amelynek tagjaihoz egyre nagyobb ismert mennyiségben (a, b, c) adjuk az analizálni kívánt komponenst. Az ionintenzitást a hozzáadott mennyiség függvényében ábrázoljuk, egyenest illesztünk, és annak vízszintes tengellyel vett metszéspontja adja a keresett koncentrációt. 6. Gyakorlati feladat fenolszármazékok mérése borban 2 Bevezetés Mind a vörös-, mind pedig a fehérbor igen gazdag különféle fenolszármazékokban. A borok színének, illatának, ízének meghatározásában nagy szerepe van ezeknek a vegyületeknek. 2 A gyakorlati feladat Jandera et al., J. Sep. Sci. 2005, 28, 1005, Jaitz et al., Food Chem. 2010, 122, 366, illetve Sharma et al., Methods Mol. Biol. 2009, 581, 125 alapján került kidolgozásra.
Különféle molekulák tartoznak ide, mint például polihidroxi-benzoesavak, hidroxi-fahéjsavak, hidroxi-sztilbének, flavonoidok, csersavak. A fenolszármazékok mennyiségei érzékenyen függnek a szőlőfajtától, a bor termőhelyétől, kezelésétől és korától, ezáltal a bor egyfajta ujjlenyomatát adhatják, mely segíthet a borhamisítás kiszűrésében. Továbbá ezek a vegyületek hatékony antioxidánsok, melyek jótékony hatást gyakorolnak az egészségre; mennyiségük ismerete így táplálkozástudományi szempontból is érdekes lehet. A fenolszármazékok sokfélesége miatt akár a HPLC/UV analízis, akár normál MS analízis szelektivitási problémák miatt csak korlátozottan alkalmazható (azonos retenciós idők és azonos tömegek is előfordulnak). A HPLC/MS/MS hatékony megoldást nyújt erre az élelmiszeranalitikai problémára, egyszerre akár 30-40 fenolszármazék is megbízhatóan mérhető. A gyakorlat leírása Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria alkalmazása borminta galluszsav/szalicilsav tartalmának meghatározására, standardaddícióval, vanillin belső standard alkalmazásával. A szereplő vegyületek HO O 152.14g/mol galluszsav szalicilsav vanillin HPLC-MS készülék Waters Acquity UPLC Waters Micromass Quattro micro API triple quadrupole készülékkel (ESI forrással) kapcsolva, az MS detektálással párhuzamosan UV detektálással HPLC módszer Állófázis: Ascentis Express C18-as oszlop (50 mm 2,1 mm 2,7 um) Mozgófázis: A eluens: 99 % víz, 1 % acetonitril, 0,1 % HCOOH; B eluens: 1 % víz, 99 % acetonitril, 0,1 % HCOOH; a beállított gradiens elúció alkalmazásával Mintaelőkészítés A kapott bormintát 0,45 um-es membránszűrőn szűrjük, hozzáadjuk a vanillin belső standardot és 1:4 arányban hígítjuk az A eluenssel. Vizsgált minták: 1. Standard keverék: galluszsavat, szalicilsavat és vanillint adott koncentrációban tartalmazó keverék oldat (oldószer: víz) O
2. Előkészített borminta 3. Előkészített borminta vanilin belső standarddel, addícionált galluszsav és szalicilsav standarddel (egy mérés addíció nélkül + legalább 3 addíciós mintát készítünk) Standard vegyületek retenciós idejének meghatározása A standardokat meghatározott koncentrációban tartalmazó oldatból a beállított gradiens elúció segítségével meghatározzuk a standard vegyületek retenciós idejét. A standardokat tömegspektroszkópiásan detektáljuk negatív ion módban. MS módszerként megnézzük az MS Scant és MRM-et is. A standardok a tömegspektrumban deprotonált molekulaionként jelennek meg. A standardokra alkalmazható fragmentációkat az irodalomból vesszük: galluszsav 169 => 125 (dekarboxileződés), szalicilsav 137 => 93 (dekarboxileződés), vanillin 151 => 136 (CH 3 vesztés). Párhuzamosan UV detektálást is végzünk 280 nm-en, mely az irodalom alapján egyfajta kompromisszumos hullámhossznak tekinthető fenolszármazékok vizsgálatára. Bor galluszsav/szalicilsav tartalmának mennyiségi meghatározása Megmérjük a belső standardes bormintát MS scan és MRM módszerrel is. Elvégezzük az addíciós minták mérését is MRM módszerrel. Meghatározzuk a galuszsav/szalicilsav mennyiségét a belső standardre vonatkoztatva a kromatogramokból. Kalibrációs egyenest készítünk és meghatározzuk a borminta gallusz sav/szalicilsav mennyiségét.