Áramlási citometria elve Olyan műszer, amely szuszpendált egyedi sejtek fluoreszcens és fényszórási paramétereit méri nagy sebességgel (akár több ezer sejt/sec) Áramlási citometria Fluoreszcens mikroszkópia Fluorimetria Sejtek típusa szuszpendált szuszpendált és kitapadt szuszpendált (v. kitapadt) Sejtszintű feloldás egyedi sejtek (nincs szubcelluláris info.) egyedi sejtek szubcelluláris info. populáció Mért paraméter fluoreszcens és fényszórás elsősorban fluoreszcens elsősorban fluoreszcens Sebesség több ezer sejt/sec néhány sejt/perc NA Manipuláció szortírozás egyedi sejtek manipulációja - 1/34
Áramlási citometria működési elve eltérítő kondenzátor lemezek 2/34
köpenyfolyadék mintafolyadék Áramlási rendszer A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja (hidrodinamikai fókuszálás). A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak, ahol a lézer megvilágítja őket. Tintasugár hidrodinamikai fókuszálása köpenyfolyadék lézerfény Az áramlási cella felülnézete 3/34
Sejtszeparálás A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot. A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcens jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel. eltérítő kondenzátor lemezek: állandó feszültség van rajtuk. 4/34
jet-in-air (áramlás a levegőben): áramlási fej Megvilágítás Az áramlási cella felülnézete DETEKTOR kis NA-jú LENCSE lézerfény. küvetta: az emittált fény sokkal nagyobb %- át detektáljuk áramlás a levegőben lézerfény emittált fény nagy NA-jú LENCSE jet-in-air küvetta. áramlási fej DETEKTOR lézerfény 5/34
A fény: A fény és a fluoreszcencia tulajdonságai mind az elektromos, mind a mágneses tér vektor, azaz van irányuk és nagyságuk 630 nm-es sávszűrő: 520 nm-es felüláteresztő (LP): az elektromos tér iránya hullámhossz a mágneses tér iránya fehér fény 620-640 nm 575 nm-es aluláteresztő (SP): fehér fény >520 nm 550 nm-es dikroikus tükör: >550 nm a terjedés iránya Fluoreszcencia: gerjesztett állapot fehér fény <575 nm gerjesztési szűrő fehér fény emissziós szűrő <550 nm gerjesztési alapállapot spektrum A gerjesztést követően a molekula visszajut az első gerjesztett szint legalsó (ún. vibrációs) alszintjére. Minden további folyamat ebből a helyzetből indul. A fluoreszcencia magasabb hullámhosszú, mint a gerjesztő fény. emissziós spektrum hullámhossz 6/34
Detektorok foton Φ elsődleges (foto)-elektron μ sok másodlagos elektron elektronok száma kvantumhatásfok(φ): Φ = 100 fotonok száma erősítés (μ): elektronok végső száma μ = 100 fotoelektronok száma Fotodióda: depléciós zóna - + pl. ha minden dinóda 10 másodlagos elektront bocsát ki, és 8 dinóda van: μ =10 8 bejövő fotonok katód anód ablak dinódák a dinódák egyre pozitívabb feszültségen vannak, és a gyorsuló elektronok a dinódákba ütközve másodlagos elektronokat válatanak ki alacsony kvantumhatásfok magas erősítés felerősített jel magas kvantumhatásfok nulla erősítés p-típusú n-típusú fény indukálta impulzus A kétféle üzemmód: 1. nincs feszültség, 2. záró irányú feszültség - + Fotoelektronsokszorozó (photomultiplier, PMT): Lavina fotodióda (avalanche photodiode): a diódára magas záró irányú feszültséget kapcsolnak, és a fotoelektronok annyira felgyorsulnak, hogy másodlagos elektronokat váltanak ki (μ 0) a fotodióda és a PMT előnyös tulajdonságait kombinálja magas kvantumhatásfok magas erősítés hátrány: magas sötétáram 7/34
Detektorok összehasonlítása 8/34
Azonos helyen történő gerjesztés esetén PMT4 sávszűrők PMT3 575 BP PMT2 525 BP Detektorok elrendezése I. 488 BP PMT1 cells megvilágító lézer A dikroikus tükrökkel a közös sugárból leválasztanak egyet-egyet, amit még egy optikai filterrel tovább szűrnek. 675 BP 600 DL 550 DL dikroikus tükrök 488 DL FSC Térben szétválasztott gerjesztés esetén térben elválasztott lézersugarak tükör detektorok a kék lézer által gerjesztett fotonok számára detektorok a vörös lézer által gerjesztett fotonok számára tükör detektorok a zöld lézer által gerjesztett fotonok számára 9/34
A jel detektálása A detektoron mért jel: terület magasság szélesség 10/34
Detektorok elrendezése II. PMT 5 minta áramlási cella dikroikus tükör PMT 2 PMT 4 PMT 3 fényszórás detektor sávszűrő PMT 1 lézer 11/34
Az adatok tárolása Az adatok elmentése általában ún. FCS (flow cytometry standard) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file header $FIL=pi04.LMD $INST=EPICS DIVISION OF COULTER CORPORATION $CYT=Elite $DATE=04-Jan-80 $BTIM=19:21:30 $SRC=tr110901 $SMNO=1 TESTNAME=Peter FITC/pmt4 lin/log TESTFILE=Pe000093.PRO $BYTEORD=12 $DATATYPE=I $NEXTDATA=0 $MODE=L $P1N=FS $P1S=FS $P1R=1024 $P1B=16 $P1E=0,0 $P2N=PMT1... $TOT=25114 adatok FSC SSC FL1... 1. sejt 674 334 873 2. sejt 898 393 799 3. sejt 648 417 937... 12/34
Egydimenziós ábrázolási mód: hisztogram Count 177 133 89 44 0 logaritmikus skálán 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL4-H Az adatok megjelenítése I. ugyanazon adatok Count 100 75 50 25 lineáris skálán 0 1 501 1001 1500 200 FL4-H A logaritmikus skála előnye: összenyomja a skálát a magas értékeknél sok biológiai paraméter lognormális eloszlást mutat, ez log skálán haranggörbének látszik. Hátránya: nulla és negatív számokat nem tud ábrázolni ún. binning artefaktum Megoldás: olyan skála, amely alacsony értékeknél lineáris, magasaknál logaritmikus: hiperlog skála (Cytometry, 64A, 34) Binning artefaktum: úgy tűnik, hogy az alacsony intenzitású populáció elnyúlik balra, és az első csatornában sok sejt halmozódik fel. r HL = lg 1+ x + b d r d 13/34
Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. dotplot: a két tengelyen egy-egy mért paramétert tüntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg. 10 4 Az adatok megjelenítése II. 2. density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti 10 4 10 3 10 3 FL4-H 10 2 FL4-H 10 2 10 1 10 1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL1-H 3. contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL1-H 4. 3D (surface, felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) 18 10 3 14 FL4-H 10 2 Count 9 10 1 5 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL1-H 0 10 0 10 1 10 2 10E0 10 FL1-H 3 10 4 FL4-H 14/34
1024 Kapuzás 32 SSC-H 768 512 256 lympho Az összes lemért sejt FL4 eloszlása. Count 24 16 8 0 0 256 512 768 1024 FSC-H Csak a piros kapun (limfociták) belül levő sejtek FL4 eloszlása. 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL4-H 16 12 Count 8 4 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL4-H 15/34
Áramlási citométerek Coulter Epics Elite Becton Dickinson FacsVantage DiVa Becton Dickinson FACScan Becton Dickinson FacsArray 16/34
Fluorescence intensity 543 nm-es gerjesztés 488 nm-es gerjesztés 100 A488, exc. A488, em. A546, exc. 80 A546, em 60 40 20 500-560 BP 0 400 450 500 550 600 650 700 wavelength (nm) Kompenzáció I. Ha egyszerre két fluoreszcens festéket (Alexa488, Alexa546) vizsgálunk, a legtöbb esetben a mért fluoreszcencia intenzitás mindkét festék hozzájárulását tartalmazza. A488channel = I + I S A488 A546 A546 A488 A488channel mért fl. int. az A488 csatornában I A488, I A546 az A488 és A546 festékek tiszta fluoreszcencia intenzitása S A546 A488 spektroszkópiai állandó, ami meghatározza, hogy az A546 festék mennyire világít át az A488 csatornába Hasonló egyenlet írható fel az A546 csatornára is: A546channel = I + I S A546 A488 A488 A546 3000 2500 Az S faktorokat egyszeresen (pl. csak A488) jelölt mintákkal határozzuk meg, melyek a kompenzáció után vagy vízszintesen vagy függőlegesen helyezkednek el az ábrán. A546 channel 2000 1500 1000 500 nem kompenzált kompenzált 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 A488 channel 17/34
Kompenzáció II. Kompenzáció során tiszta, átvilágítástól mentes intenzitásokat számítunk ki. Egyszerű eset: egyirányú átvilágítás, tehát pl. S A546 A488 0, S A488 A546 =0 A488channel = I A488 + I A546 S A546 A488 I A488 = A488channel A546channel S 546 A488 A546channe l = A I A546 Bonyolultabb eset: kétirányú átvilágítás, tehát pl. S A546 A488 0, SA488 A546 0 A488channel A546channel = I = I + I S A488 A546 A546 A488 + I S A546 A488 A488 A546 Kétismeretlenes egyenletrendszert kell megoldani. I I A488 A546 A488channel A546channel S = A546 A488 1 S A546 A488 S A488 A546 A546channel A488channel S = A488 A546 1 S A546 A488 S A488 A546 A logaritmikus skála gyakran félrevezető képet mutat a kompenzációról: úgy tűnik, mintha alulkompenzált lenne. 18/34
Quantum dot-ok (qdot, QD) optikai tulajdonságai A kompenzáció elkerülhető, ha olyan fluoreszcens festékeket használunk, melyeknek keskeny az emissziós spektrumuk, ezért csak egy fluoreszcens detektor detektálja őket. Ilyenek pl. a quantum dot-ok. foton vezetési sáv vegyérték sáv lyuk exciton Bohr radius 5.6 nm (CdSe) elektron Széles Széles gerjesztési gerjesztési spektrum spektrum Keskeny Keskeny emissziós emissziós csúcs csúcs Nagy Nagy fotostabilitás fotostabilitás (nincs (nincs photobleaching) photobleaching) A széles gerjesztési spektrum miatt egy, pl. 488 nm-es lézerrel több quantum dot gerjeszthető, és a keskeny emissziós spektrumok miatt a fluoreszcencia átfedés nélkül mérhető. 3 nm 5.5 m 19/34
Immunfenotipizálás áramlási citometriával szuszpenziós ill. könnyen szuszpendálható sejtek vizsgálatára alkalmas sejtfelszíni antigéneket (ill. fixált és permeabilizált sejtek intracelluláris antigénjeit) monoklonális antitesttel megjelöljük. Klinikai alkalmazásokban általában elsődlegesen jelölt antitesteket használnak. A B C sejtszám B A C vörös intenzitás B A C B double negative A single positive C double positive Felhasználás: zöld intenzitás zöld intenzitás leukémiák diagnózisa AIDS diagnosztika (CD4 + limfocita szám) 20/34
Sejtciklus és DNS tartalom analízis sejtmag 1. a sejteket fixáljuk és permeabilizáljuk, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez 2. a DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez 3. a mért fluoreszcencia intenzitás arányos a sejt DNS tartalmával Alkalmazási terület: daganatos sejtek a normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek apoptotikus sejtek sub-g1 DNS tartalommal rendelkeznek G1%=79% S%=16% G2/M%=3% G1 intensity=216 G1%=40% S%=39% G2/M%=20% G1 intensity=309 humán diploid sejt JIMT-1 (humán emlőtumor sejtvonal) 21/34
FRET gerjesztett állapot donor akceptor alapállapot A gerjesztést követően a molekula visszajut az első gerjesztett szint legalsó (ún. vibrációs) alszintjére. Minden további folyamat ebből a helyzetből indul. FRET esetében a donor molekula közelében található egy akceptor molekula, amely sugárzásnélküli energiaátadással átveszi a donor energiáját. a FRET abban nyilvánul meg, hogy a donor gerjesztését követően az akceptor emittálja a fotont A FRET sebességi állandóját a következő egyenlet írja le: k FRET 4 6 = konst Jn k f R 2 κ 22/34
A FRET mérése áramlási citometriával I. Szenzitizált emisszió: az akceptor gerjesztése a donoron keresztül (az akceptor fluoreszkál a donor gerjesztését követően, F AD akceptor fluoreszcencia intenzitás donor jelenlétében; F A akceptor fluoreszcencia intenzitás donor nélkül) E F AD = 1 FA ε Ac ε Dc A D Probléma: nem lehet specifikusan a donort gerjeszteni nem lehet csak az akceptor fluoreszcenciáját detektálni donor gerjesztési donor emissziós akceptor emissziós akceptor gerjesztési akceptor emissziós szűrő Az egyes csatornák közötti átvilágításra korrigálni kell. donor gerjesztési hullámhossz direkt akceptor gerjesztés hullámhossz donor emisszió az akceptor csatornában 23/34
A FRET mérése áramlási citometriával II. ( λ ) = I 1 ex, D,λem, D ( λ ) = I 2 ex, D,λem, A I D ( 1 E) + I D ( 1 S E) 1 I A S 4 + + I A S 2 S I D Eα S + 4 2 I D Eα donor csatorna FRET csatorna S3 3 ( λex, A,λem A )= I D ( 1 E) S3 + I A + I D Eα S1 I, akceptor csatorna donor jel akceptor jel FRET jel S 1 = I I 2, D 1, D S 3 = I I 3, D 1, D S 2 = I I 2, A 3, A S 4 = I I 1, A 3, A α = I I 2 1 ε DL ε L A D A E 1 I1( S1 S2S3) + I2( S3S4 1) + I3( S2 S1S = A = 1 E α I1( S2S3 / S1 1) + I 2( S4 / S2 S3S4 / S1) 4 ) 24/34
A FRET mérése áramlási citometriával III. akceptor FRET donor gerjesztés FRET emisszió Donor (pl. CFP) Akceptor (pl. YFP) antitesttel vagy Fab-vel GFP-vel és spektrális variánsaival jelölt fúziós fehérjékkel 25/34
A FRET alkalmazása intracelluláris enzimaktivitás és ionkoncentráció mérésére Proteáz szenzorok: Kalcium szenzorok: FRET CFP YFP CFP YFP pl. kaszpáz szenzitív linker -Ca 2+ FRET + 4 Ca 2+ YFP CFP CFP nincs FRET YFP Nature, 388, 882. 26/34
FRET-en alapuló szortírozás Cytometry, 67A, 86. Unsorted 1000 A 800 800 600 600 FRET Nem szortírozott gombasejtek populációja, melyben FRET-et mutató és nem mutató sejtek keverednek egymással. 1000 CFP-Kip1 Gomba sejteket YFP-CDK2-vel és CFPKip1-gyel transzfektálunk. 400 200 200 0 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 YFP-Cdk2 1000 CFP-Kip1 Sorted 1000 C 800 800 600 600 FRET CFP-Kip1 volt donor és akceptor nagy volt a FRET csatornában az intenzitás 400 200 Sorted D 400 200 0 0 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 Relative frequency of cells YFP-Cdk2 A szortírozott sejtekben csak FRET-et mutató sejtek voltak. B 400 0 A sejteket az A és B részben feltüntetett kapuknak megfelelően szortíroztuk, és a szortírozást ellenőriztük. Olyan sejteket választottunk ki, ahol Unsorted CFP-Kip1 E Sorted 0.08 Unsorted 0.06 0.04 0.02 0.00 0 20 40 60 FRET (%) 27/34
Ionkoncentrációk, membránpotenciál és intracelluláris enzimaktivitás mérése aspecifikus észteráz oxonol - indikátor indikátor-am MDR1 pumpa 1. Az indikátor hidrofób, acetoximetilészter (AM) formája átjut a sejtmembránon. 2. Intracellulárisan aspecifikus észterázok hidrolizálják. 3. A felszabaduló, hidrofil indikátor nem képes az elő sejtek membránján átjutni, ezért intracellulárisan felhalmozódik. 4. Az indikátorok egy részének fluoreszcenciája a környezet ionkoncentrációjától függ. oxonol - oxonol - indikátor-am 5. multidrog rezisztencia mérése: az MDR pumpák kipumpálják a sejtekből az indikátort és/vagy annak AM formáját. A calcein olyan indikátor, amely nem indikál semmit, tehát csak a felhalmozódását mérjük, ill. annak hiányát MDR-t mutató sejtekben. 6. A negatív töltésű oxonol a membránpotenciálnak (Nernst egyenlet) megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán. Depolarizáció esetén nő a sejtben levő oxonol mennyisége, így nő a sejtek fluoreszcencia intenzitása. Indikátor neve BCECF FURA-2, INDO-1, Fluo-3 SBFI PBFI fluoreszcein-diacetát (FDA) calcein oxonol Mért paraméter ph Ca 2+ Na + K + életképesség, mivel a festék nem (nagyon) érzékeny semmire, csak a felhalmozódását mérjük elő sejteken belül multidrog rezisztencia membránpotenciál 28/34
Multiplex bead analízis bead 1 citokin A bead 2 citokin B bead 3 citokin C bead 4 citokin D Különböző színű bead-ek, melyekhez különböző citokinekre specifikus antitest van kötve. bead 1 citokin A bead 2 citokin B bead 3 citokin C bead 4 citokin D A beadek keverékéhez egy sejt lizátumát adják. A beadekhez a lizátumban levő mennyiséggel arányos mennyiségű citokin kötődik. bead 1 citokin A bead 2 citokin B bead 3 citokin C bead 4 citokin D A mintához a bead-ek színétől eltérű színű fluoreszcens festékkel jelölt, citokin ellenes detektáló antitestet adnak, ami kötődik a bead-hez már kikötött citokinhez. intenzitás 2 3 4 1 2 intenzitás 1 Minden bead populációt külön-külön analizálunk. sejtszám 3 és 2 1 4 antitest fluoreszcencia int. A bead-eket egyszerre lehet az áramlási citométeren futtatni. Előny: egy sejten belül egyszerre sok citokin (vagy más fehérje) szintje mérhető. 29/34
FCB: fluorescent cell barcoding (fluoreszcens sejt vonalkódolás) Nat. Methods, 3, 361 kevés kék, kevés zöld (A) kontroll stimulus 1 sok kék, kevés zöld (B) kevés kék, sok zöld (C) stimulus 2 stimulus 3 sok zöld, sok kék (D) A sejteket összekeverjük, és megjelöljük egy eltérő színnel megjelölt antitesttel. A sejteket fixáljuk, permeabilizáljuk, és megjelöljük különböző színű és koncentrációjú festékekkel. zöld intenzitás C A D B Minden populációt külön-külön analizálunk. sejtszám B D A C Előny: alacsonyabb antitest felhasználás egyszerre sok minta vizsgálható kék intenzitás antitest fluoreszcencia int. 30/34
In vivo áramlási citometria Daganatsejtek követhetők nyomon nyirokerekben in vivo. Cancer Res 67:8223 (2007) In vivo imaging Olympus OV100 Fluoreszcensen jelzett sejtek vizsgálhatók élő állatban, és az áramlási citometriához hasonló ábrák készíthetők. Cancer Res 64:5044 (2004), Nat. Rev. Canc. 3: 921 (2003) 31/34
Átmenet a mikroszkópia és az áramlási citometria között Áramlási citometria: sok szuszpenziós sejt analízise gyorsan, automatikusan szubcelluláris felbontóképesség nélkül Mikroszkópia: kevés kitapadt sejt analízise jelentős felhasználói munka árán szubcelluláris információ Képalkotó áramlási citometria: áramlósejtekről képeket készít a sejtek fluoreszcencia intenzitását az áramlási citométerhez hasonlóan megméri, áramlási citométerhez hasonló hisztogram és dot plot formájában megjeleníti az egy és kétdimenziós hisztogramon kiválasztott sejtek képeit vissza lehet keresni a sejteken kolokalizációs és morfológiai analízist is lehet végezni Lézer scanning citométer (LSC): tárgylemezen levő sejteket vizsgál az egész tárgylemezt (tehát nemcsak egy mikroszkóp látóteret) beszkennel alacsony NA-jú objektívvel a sejteket automatikusan azonosítja a sejteken morfológiai és kolokalizációs vizsgálatokat is lehet végezni a sejtek fluoreszcencia intenzitás adatait az áramlási citométeren megszokott egy- és kétdimenziós hisztogram formájában is meg lehet jeleníteni sok sejt mérése automatikusan szubcelluláris felbontóképességgel 32/34
Képalkotó áramlási citometria (imaging flow cytometry) 1. A sejtek az áramlási citometriában megszokotthoz hasonló áramlási cellában áramlanak. 2. Az áramlási cellában a sejteknek nemcsak az összes (vagy maximális) fluoreszcencia intenzitását mérjük meg, hanem róluk kép is készül. 3. A sejtek képeit a készülék elmenti... 4.... és a sejtek fluoreszcencia adatait az áramlási citométerhez hasonlóan elemezhetjük. 33/34
Laser scanning cytometry (LSC) 1. A mikroszkóp tárgylemezt a lézersugár végigpásztázza. 2. Magfestés alapján a sejtmagokat a szoftver azonosítja, és a magot, ill. a körülötte levő citoplazmát körülrajzolja (szegmentálás). 3. A sejtek fluoreszcencia intenzitás értékeit a gép kiszámolja, és az áramlási citométeren megszokotthoz hasonlóan elemzi. 34/34