FONTOS! a március 14-i előadás március 19-én (szombat) 9 h-kor lesz
2008 Small World contest - 4th Prize - Dr. Matthew Springer (University of California, San Francisco, United States) Specimen: Differentiation of unicellular Dictyostelium discoideum into multicellular slugs (100x) Technique: Stereomicroscopy
Mikroszkóp - mikroszkópia görögül: mikron = kicsi + szkopein = nézni MIKROSZKÓP olyan eszköz, mely megjeleníti az emberi szem számára láthatatlan parányokat MIKROSZKÓPIA a szabad szemmel láthatatlan parányok mikroszkóppal való tanulmányozásának tudománya CÉL 1. NAGYÍTOTT 2. MEGFELELŐ FELBONTÁSÚ 3. KONTRASZTOS kép
A fény (optikai) mikroszkópia felületi módszerek 3D módszerek NSOM TIRF SPR hagyományos konfokális nem-lineáris interferencia dekonvolúciós SRM több foton reverzibilis szaturáció ApoTome HELM I5M 4Pi SHG CARS 2P, 3P SSIM STED Garini és mtsai Current Biology 2005 MMM-4Pi
Geometriai optika - Lencsék Gyűjtőlencsék képalkotása k t t k t k = F F F F F F f f f f f f nevezetes sugármenetek fókuszpont, távolság (f) tárgy-, képtávolság (t, k) valós, látszólagos kép LENCSETÖRVÉNY 1 1 1 f t k NAGYÍTÁS N K T k t
Geometriai optika - Lencsehibák KROMATIKUS ABERRÁCIÓ Diszperzió n( ) SZFERIKUS ABERRÁCIÓ A lencsék gömbszerű geometriája különböző hullámhosszúságú fénysugarak különböző fókuszpont különböző görbületet elérő fénysugarak különböző fókuszpont
Geometriai optika - Fénytörés beeső megtört megtört SNELLIUS-DESCARTES TÖRVÉNY sin sin n n 2 1
A fénymikroszkóp képalkotása - Alapelvek TÁRGY KÉP1 (valódi, nagyított, fordított állású) KÉP2 (látszólagos, nagyított, egyenes állású) TÁRGY KÉP2 (látszólagos, nagyított, fordított állású)
1. NAGYÍTÁS 2. FELBONTÁS 3. KONTRASZT
1. Nagyítás OBJEKTÍV: N objektív = 1 150 OKULÁR: N okulár = 5 30 MIKROSZKÓP: N mikroszkóp = N objektív x N okulár
2. Felbontóképesség az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól RAYLEIGH EGYENLET XY irányban a minta síkjában d x y, 0.61 NA Z irányban optikai tengely mentén d z 2 2 NA d: két pont távolsága λ: a megvilágítás hullámhossza NA: numerikus apertúra 1/d: a mikroszkóp feloldóképessége
2. Felbontóképesség - Hullámhossz d 0.61 NA d z 2 2 NA NA = 1.4 HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm FELBONTÁS - Z nm 360 156 367 400 174 408 450 196 459 500 217 510 550 239 561 600 261 612 650 283 663 700 305 714 növelésével a felbontóképesség csökken
2. Felbontóképesség - Numerikus apertúra egy optikai rendszernek (pl. egy mikroszkóp lencsének) az a legnagyobb nagyító képessége, amellyel még éles képet ad. az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma, mely meghatározza a felbontóképességet és a mélységélességet. NA nsin n: a tárgy és az objektív közötti anyag törésmutatója μ: az objektív félnyílásszöge NA = 0.04 1.45
2. Felbontóképesség - Airy korong a tárgy egyes pontjairól érkező fénysugarak az objektív nyílásán elhajlást szenvednek a képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki Egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG (George Biddel Airy 1801-1892) TÁRGY KÉP erősítés kioltás 3 2 1 0
2. Felbontóképesség - Airy korong d d?? d 0.61 NA d d Airy korong felbontott nem felbontott az egyik maximuma éppen a másik első minimumába esik
2. Felbontóképesség - Airy korong NA NA növelésével a felbontóképesség növekszik
3. Kontraszt A minta optikai inhomogenitása miatt (törésmutató, alak,..) a rajta áthaladó a fénysugarak sajátságai (irány, sebesség, fázis, ) megváltozhatnak KONTRASZT
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia A mintára eső fénysugarak a mintán áthaladva annak törésmutatójától, geometriájától (alakjától), vastagságától függően eltérülhetnek. nem eltérített (S) nem lépett kölcsönhatásba a mintával: HÁTTÉR fáziskésés minta eltérített (D) kölcsönhatásba lépett a mintával: DIFFRAKCIÓ
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia VILÁGOS LÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA AZONOS FÁZIS interferencia AZONOS AMPLITÚDÓ HOMOGÉN KÉP FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA KÜLÖNBÖZŐ FÁZIS interferencia KÜLÖNBÖZŐ AMPLITÚDÓ KONTRASZTOS KÉP
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia kép nincs diffrakció (S) diffrakció (D) objektív minta kondenzor FÁZISGYŰRŰ rápárologtatott réteggel ellátott lemez a hengerpalást mentén jövő (összehasonlító) fénysugarat a hullámhossz negyedrészével fázisban eltolja KÜLÖNBSÉGEK MAXIMALIZÁLÁSA a fénysugár henger- vagy kúppalást mentén halad KONDENZOR MASZK fényzáró réteg gyűrű alakú áteresztő területet gyűrű-diafragma
2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow transgenic mouse hippocampus (40x) Technique: Confocal
Fluoreszcencia mikroszkópia A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcenciáját képezzük le. A képalkotáshoz használt fény fluorofórok emissziójából származik.
Fluorofórok BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák kvantum gyöngy (d = 2-10 nm, 100-100000 atom) fehérje (GFP) (d = 10 nm, 26 kda) kis molekula (d = 1 nm, 20 atom)
Mikroszkóp
Mikroszkóp GERJESZTÉS SZEMLENCSE MINTA DETEKTOR OBJEKTÍV SZŰRŐK TÜKRÖK
Mikroszkóp ÁTESŐFÉNY INVERTÁLT
Gerjesztés: Lámpák, lézerek LÁMPA: xenon ív, higanygőz LÉZER, LED
Szűrők: gerjesztési/emissziós egy meghatározott hullámhossztartomány kiválasztása
Dikroikus tükör egy meghatározott hullámhossztartományban visszaveri a fényt, a többi hullámhossztartományon átenged (NYALÁBOSZTÓ)
Szűrők + tükrök EMISSZIÓ emissziós szűrő dikroikus tükör GERJESZTÉS szűrő kocka gerjesztési szűrő
Objektív nagyítás fedőlemez tárgylemez típus immerzió immerzió típusa típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód munka távolság
Detektorok foton elektromos jel FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ FOTODIÓDA CCD KAMERA (charged coupled device)
Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 1 emisszió m gerjesztés HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!! Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA konfokális technika evaneszcens mező alkalmazása több foton gerjesztés
Konfokális mikroszkópia
Konfokális mikroszkópia - Alapelvek KONJUGÁLT FOKALITÁS : KONFOKÁLIS detektor emisszió fókuszponton kívüli apertúra fókuszpontból gerjesztő lézer gerjesztés apertúra fókuszsíkok
Konfokális mikroszkópia
Konfokális mikroszkópia felbontás XY: 200 nm Z :600 nm
TIRFM Total Internal Reflection Microscopy Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia
TIRFM - Alapelvekc TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS teljes belső visszaverődés sin sin n 2 n 1 n n 2 1 90 kritikus o megtört
TIRFM - Alapelvek EVANESZCENS MEZŐ I( z) I0 exp( z / d) [z], nm I(z) %-ban 0 100 1 99 10 92 100 43 1000 0
TIRFM - Alapelvek nagy NA immerziós olaj (n) a gerjesztő nyaláb tengelyen kívüli helyzete
TIRFM
TIRFM felbontás XY: 200 nm Z :100 nm
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia - Alapelvek Nemlineáris optika E hc Jablonski diagram 1 1 t 2 2 10 18 s LÉZER!! impulzuslézer
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia
Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 2 FELOLDÓKÉPESSÉG RAYLEIGH EGYENLET d 0.61 NA HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm 360 156 400 174 450 196 XY FELBONTÁS JAVÍTÁSA fizikai módon matematikai módon 500 217 550 239 600 261 650 283 700 305
STED Stimulated Emission Depletion Microscopy Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítésén alapuló mikroszkópia
STED - Alapelvek Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítése gerjesztés fluoreszcencia nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens maradék fluoreszcencia
STED - Alapelvek fázislemez gyengítő lézer STED lézer gerjesztés gyengítés red shift dikroikus tükrök gerjesztő lézer objektív minta széleslátóterű STED
STED Aktin filamentumok Elise Stanley, Division of Genetics & Development, Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada
STED felbontás XY: 20-40 nm Z :100 nm
SIM Structured Illumination Microscopy Struktúrált megvilágítás mikroszkópia
SIM - Alapelvek rács forgatása + képkészítés képanalízis fontos: rács geometriája forgatások száma
SIM felbontás XY: 100 nm Z :150-300 nm
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleacing Fluoreszcencia intenzitás visszatérése kioltás után
FRAP Fluoreszcencia intenzitás intenzív lézerimpulzus kioltás kinetikai analízis fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége kioltás visszatérés mobilis 50% immobilis idő (t)
FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FADIM Fluorescence Anisotropy Decay Imaging Microscopy Fluoreszcencia élettartam/anizotrópia mikroszkópia
FLIM - FADIM
További érdekességek 2010 Small World contest - 7th Prize - Mr. Yongli Shan (UTSW - Dallas, Texas, USA) Specimen: Endothelia Cell attached to synthetic microfibers (2500x) Technique: Epifluorescence, Confocal