Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Biofizika szeminárium Tóth Mónika Ágnes PTE ÁOK Biofizikai Intézet 2011.04.11-12-13. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek Fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül). Milyen funkcókra képes egy flow citométer? Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése 10 5-10 6 számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése 1
A mérések alapelvei Technikai felépítés A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting Fényforrás Áramlási rendszer (folyadék) Optikai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés Adat analízis Szorting Az áramlási tér jelentősége, Áramlási citométer cella tulajdonságai: Hidrodinamikai fókuszálás 2
Hidrodinamikai rendszer Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket. Sejtszeparálás - szorting A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot. A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcencia jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel. 3
Technikai komponensek Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Az áramlási citométer optikai felépítése, optikai jelek detektálása Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Régebben 1-2 cső Jelenleg akár 12-15 db. Fotodiódák Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére Előre irányuló szórás (FSC) 4
2D Scatter Plot of Blood 5
SSC=Oldalszórás (sejtgranuláltság) FSC=Előreszórás (sejtméret) Analóg jelek A memóriában megjelenő számok digitális készülékben FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC 6
A számok konvertálása paraméterekké Jelszélesség: Mintavételek száma Csúcsmagasság: A legnagyobb számérték Mérési eredmények tárolása, mentése Terület: A számok összege Nincs holtidő!!! Az adatok tárolása Az adatok megjelenítése Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 4. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) 7
Kapuzás 1-nél több fluoreszcencia jel detektálása (dot plot) Az összes lemért FL4 eloszlása. Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. Felületi marker analízis Fluoreszcens jelölés A fluoreszcencia alapjai A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ A sejtek típusától A sejtek differenciálódási stádiumától A sejtek aktivációjától, inaktivációjától A sejtek egyéb funkcionális állapotától A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcencen jelöljük: direkt, indirekt 8
Fluoreszcens jelölés Single fluoreszcens festékkel Önálló (Single) festékek Tandem festékek Tandem festékkel Akceptor Donor Akceptor Donor Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények: Fluorokrómok Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait 9
Sejtciklus és DNS tartalom analízis Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai 1. A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. 2. A DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek A flow citometria fejlődése Gucker - 1947 Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban A fejlesztés a II. Világháború idején történ, 1947-ben publikálták A cél a levegőben terjedő baktériumok gyors detektálása volt, a biológiai fegyverek kimutatására Készülék: Egy sötét-látóteres mikroszkóp cellájában áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak. 10
Wallace Coulter - Coulter orifice (1956) 1953-ban szabadalmaztatott technika Az elektromos vezetőképesség (ellenállás) változásait detektálta miközben a sóoldatban (pufferban) szuszpendált sejtek áthaladnak egy vékony nyíláson. Photo by J.Paul Robinson A szabadalmi bejelentés kézirata Photo by J.Paul Robinson Az első kereskedelmi forgalomba került számláló (Coulter Counter) Kamentsky (1965) Az első sejt szorter. A fényszórást HeNe lézerrel mérte. A fluoreszcenciát detektáló modell elődje. Mack Fulwyler sorter (1965) A sejtek elválasztása térfogatuk alapján történ, a Coulter counter elv szerint. A kiválasztott sejtek elkülönítése elektrosztatikus eltérítéssel történt (a nagysebességű szorting alapja ma is ez). A felhasznált elv: Tintasugaras nyomtató (Richard Sweet, Stanford, 1965). Neutrofil sejteket és limfocitákat tudtak elválasztani vérből. 11
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET 12