DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI TERMÉSZETES MÁTRIXOK SZERVES ÖSSZETEVİINEK MINİSÉGI - MENNYISÉGI ELEMZÉSE, TRIMETILSZILIL SZÁRMAZÉKOKKÉNT, EGYETLEN OLDATBÓL, GC-MS ELJÁRÁSSAL Papp-Füzfai Zsófia Témavezetı: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémia Tanszék Kémia Doktori Iskola Vezetı: Dr. Inzelt György Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezetı: Dr. Záray Gyula Budapest, 2008
1. Bevezetés, célkitőzések A karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok trimetilszilil(oxim)- éter/észterekkénti, együttes, azaz egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı egyidejő gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) elemzése, mind az alapkutatás szintjén, mind nagyszámú természetes mátrix összetételének meghatározásában sokoldalúan bizonyított. A flavonoidok és az antrakinonok a növényvilágban elterjedt, biológiai/fiziológiai szempontból jelentıs vegyületek, ezért minıségi-mennyiségi elemzésük különbözı természetes mátrixokban, érdeklıdésre tarthat számot. Munkánk célja volt, hogy a meglévı analízisrendszerünket a flavonoidok és az antrakinonok csoportjával bıvítsük. Elsı lépésként modell-vegyületek elemzése útján, részletes fragmentumanalitikai tanulmány készítését terveztük: a flavonoidok és az antrakinonok trimetilszilil- és trimetilszilil (oxim)-származékainak GC-MS elemzése közbeni fragmentációját és a képzıdött fragmentum-ionok mennyiségi elemzésre alkalmasságát vizsgáltuk. Második lépésként, modell-vizsgálataink eredményét felhasználva, optimáltuk - a flavonoidok meghatározását különbözı természetes anyagokból, mint citrusfélék, sárkányfő fajok; és - az antrakinonok elemzését festıbuzér kivonatokban. A különbözı természetes mátrixok vizsgálata során, kevésbé ismert diszacharidok azonosítása vált szükségessé. A diszacharidok elemzésével kapcsolatos korábbi kutatási eredmények tanulmányozása után, célul tőztük ki a glikozidkötést tartalmazó, különbözı polimerizációs fokú szacharidok részletes fragmentumanalitikai vizsgálatát. A Központi Élelmiszeripari Kutatóintézettel közös kutatásunk célja a meggyek és az indiai ber gyümölcs érés- és tárolás közbeni összetétel-változásának követése, így az érésmenet, valamint a tárolás optimalizálása volt. Ennek érdekében módszerünk, azaz, a karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok trimetilszilil (oxim)- éter/észterekkénti, együttes, egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı, egyidejő GC-MS elemzése segítségével a két természetes mátrix, a meggy és a ber gyümölcsök összetételét kívántuk feltérképezni.
2. Alkalmazott módszerek GC-MS rendszer: A méréseket a SATURN II GC-MS jelő, Varian gyártmányú (Walnut Creek, USA) készüléken végeztük, amely ioncsapda rendszerő tömegszelektív detektorral, Varian 8200 automata mintaadagolóval és főthetı injektorral rendelkezik. Az elválasztásokat SGE BPX5 (30 m 0,25 mm, 0,25 µm filmvastagságú) kolonnán végeztük. A vivıgáz hélium volt (1,5 ml/perc). A transfer line hıfoka 280 o C volt. A GC paraméterei (az injektor és a kolonna főtési programja): a.) injektor: 60 o C (2 perc), 60-320 o C (180 o C/perc), 320 o C (5 perc); kolonna: 60 o C (2,00 perc), 60-120 o C (20 o C/perc), 120-155 o C (6 o C/perc), 155 o C (10 perc), 155-250 o C (13 o C/perc), 250 o C (12 perc), 250-330 o C (20 o C/perc), 330 o C (10 perc), összesen: 54,13 perc; b.) injektor: 150 o C (2 perc), 150-330 o C (180 o C/perc), 330 o C (5 perc); kolonna: 150 o C (4,61 perc), 150-330 o C (8 o C/perc), 330 o C (7 perc), összesen: 34,11 perc. Az ioncsapda detektor optimális mérési paramétereit a készülék-szoftver (Saturn) segítségével ellenıriztük: a tömegtartomány: 50-650 amu, Fil/Mul késleltetés: 420 sec. A tömegspektrométer adatfelvételi sebessége egységesen 1,0 sec/scan volt. HPLC-DAD rendszer: A méréseket Agilent 1100 típusú HPLC-DAD/1946A típusú készüléken végeztük. DAD paraméterek: spektrum on-line (200-600 nm). Kromatográfiás oszlop: 150 4 mm MOS Hypersil BDS C18 5 µm RP (Shandon Southern Products, Runcorn, UK). Injektált mennyiség: 20 µl. Grádiens elúció: A eluens: acetonitril/0,02 M ammónium-acetát (ph=4) = 15/85 (v/v); B eluens: acetonitril/0,02m ammónium-acetát (ph=4) = 85/15 (v/v). Lineáris gradienssel, 10% B 90% B 40 perc alatt. Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Az antrakinonok mennyiségét λ=254 nm-en mértük. A reagens oldatok: - Oximmá alakítás reagense: A 2,5% hidroxilamin-hidroklorid oldatot 1,25 g hidroxilaminhidrolkoridnak 50 ml piridinben való oldásával készítettük. - Szilil-származékká alakítás reagense: A hexametil-diszilazán (HMDS), az N,O-bisz (trimetilszilil) trifluoracetamid (BSTFA), az N-tert.-butil-dimetilszilil-N-metil-trifluor-acetamid (MTBSTFA) és trifluorecetsav (TFA) analitikai tisztaságú készítményeket további tisztítás nélkül használtuk.
- Reagens a hidrolízishez: Az analitikailag legtisztább trifluorecetsavból 2 mol/dm 3 oldatot készítettünk (2 M TFA-oldat). A származékképzés: Az elıkészített, vízmentesített minták maradékát piridinben oldott, 500 µl 2,5% hidroxilamin-hidrokloridot tartalmazó oldattal 30 percig 70 o C hıfokon melegítettük. A lehőlt oldatot 900 µl HMDS és 100 µl TFA hozzáadása után 60 percen keresztül 100 o C hıfokon szilileztük. Az így kapott oldatot hőtöttük, s eltérı hígításokból 1 µl-eket elemeztünk. A minták vízmentesítése Büchi Rotavapor (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Schweiz) készüléken, a származékkészítés termosztálható, a kémcsövekkel egyezı mérető fémbetéteket tartalmazó melegítıblokkokban (Kutesz, Magyarország) történt. A minták hidrolízise: - Savas hidrolízis: A citrusalbedók és -pépek, sárkányfő-, festıbuzér-kivonatok, meggylevek, berpépek, analitikai pontossággal mért megfelelı mennyiségeit 12 ml-es szililezı edénybe mértük. A hidrolízist 4 ml 2 M-os trifluor-ecetsav oldattal eltérı ideig folytattuk. Ezután a hidrolizátumot vákuumlepárló-készülékkel vízmentesítettük. - Enzimatikus hidrolízis: A 60 o C hıfokon szárított, majd porított, homogenizált festıbuzérgyökérporból analitikai pontossággal 0,03 g-ot fızıpohárba mértünk, és 5 ml desztillált vizet öntöttünk hozzá, és 40 o C hıfokon, 24 órán át kevertettük. A hidrolizátumot 40 o C-os vízfürdın vákuumlepárló készülékkel vízmentesítettük. A minták elıkészítése az analízishez: - Citrusok: A meghámozott gyümölcsök belsı fehér héját (albedó) eltávolítottuk, szárítószekrényben 80 o C-on tömegállandóságig szárítottuk, majd achátmozsárban elporítottuk. A gyümölcsök belsı, leves részét turmixgépben homogenizáltuk. - Sárkányfő: A Dracocephalum moldavica L. szárított, porított virágának és szárának 0,25 g- ját, továbbá Dracocephalum ruyschiana L. virágának 1g-ját egymást követıen négyszer 25 ml metanol-aceton 1:1 arányú, sósavval savanyított (0,05 m/m %) elegyével, 20 percig ultrahanggal extraháltuk, a maradékot 40 ml-ben, 4 o C-on, 16 óráig áztattuk, majd a kapott kivonatokat egyesítettük, és vákuumlepárló-készülékkel oldószer-mentesítettük.
- Festıbuzér: A Rubia tinctorum L. gyökereit és gyöktörzsét 60 o C-on 5 napig szárítottuk, majd porítottuk. A por analitikai pontossággal mért 0,20 g-os részletét 30 ml 80 %-os (v/v) metanollal vagy etanollal visszafolyó-feltét felhasználásával 1 órán forraltuk. Az oldat szőrése után az oldhatatlan maradékot még egyszer extraháltuk. Az összeöntött szőrletekbıl 100 ml térfogatú törzsoldatot készítettünk. - Meggyek: A vízzel mosott, majd törlıpapírral szárított, magozott meggyhúst kézi burgonyanyomóba terített, háromszoros gézre juttattuk, s a gyümölcs préselését mindaddig folytattuk, amíg abból további préselés hatására lé már nem keletkezett. - Ber: A vízzel mosott, majd törlıpapírral szárított, indiai ber-gyümölcsöt almareszelın lereszeltük. Ezután a reszeléket háromrétegő, kissé nedves gézre juttattuk, és átpréseltük. 3. Összefoglalás; az értekezésben foglalt új kutatási eredmények 3.1. Három antocianidin (pelargonidin, cianidin, malvidin), egy flavonol (kvercetin), két flavon (apigenin, luteolin) és két flavanon (naringenin, heszperetin) TMS (oxim)-származékainak szelektív fragmentációját és e fragmentum ionok mennyiségi meghatározásra való alkalmasságát, valamennyi vizsgált esetben, elsıként bizonyítottuk. i) Megállapítottuk, hogy a származékkészítés során (oximmá alakítás, majd szililezés) az antocianidinek és a flavanonok TMS-oximokat, a flavonolok és flavonok TMS-származékokat képeznek. ii) Az antocianidinek oximmá alakulásának jellemzı reakcióútját, s a folyamatban keletkezı termékeket elsıként azonosítottuk és mértük. 3.2. Négy antrakinon modell-vegyület (antrakinon, kinizarin, alizarin, purpurin) származékkészítését, trimetilszilil- és terc.-butil-dimetilszilil-származékaik fragmentációját, GC-MS módszerrel követtük. i) Bizonyítottuk, hogy a származékká alakítás elınyös és szükséges, s a származékkészítı szerek választékából (BSA, HMDS, MTBSTFA), a HMDS-sel 100 o C hıfokon, 60 percig vezetett származékképzés a legkedvezıbb. ii) Elsıként írtuk le a festıbuzér-mintákban azonosított, a kereskedelemben nem kapható antrakinonok, a pszedopurpurin és lucidin, valamint, a lucidin bomlásterméke, a nordamnakantál TMS-származékainak fragmentációját, s fragmentum ionjaik mennyiségi mérésre való alkalmasságát.
3.3. Felderítettük a nem redukáló és redukáló glikozidkötéső szacharidok TMS- és TMS(oxim)- származékainak egymástól eltérı, jellemzı fragmentációját. i) Nagyszámú, eltérı polimerizációs fokú és mennyiségő glikozid TMS(oxim)-származékainak részletes fragmentum analitikai tanulmánya alapján ii) bizonyítottuk, hogy a redukáló és nem redukáló szacharidok, eltérı és jellemzı fragmentumionjaik alapján, autentikus vegyület hiányában is, azonosíthatók és mennyiségileg mérhetık. 3.4. A 3.1.-3.3. pontokban részletezett alapkutatások analitikai felhasználása sorából, új kutatási eredményünknek tekintjük az alábbi mátrixok összetevıinek, elızetes kivonási és dúsítási lépés nélkül, a mátrix jelenlétében, s kivonatokban, egy oldatból egyetlen gázkromatográfiás felvételbıl való minıségi-mennyiségi azonosítását, nagyságrendileg eltérı mennyiségekben, úgymint i) a citrus gyümölcsök, 33 összetevıjét a 2 10-3 -49,9%, ii) a sárkányfő gyógynövény 33 összetevıjét az 1,3 10-2 -17,5%, iii) a festıgyökér-kivonatok savas/enzimes hidrolizátumai 21 összetevıjét, a 2,0 10-3 -13%, iv) a meggyminták 20 összetevıjét, az 1,9 10-2 -41%, s v) a ber minták 15 összetevıjét, az 1,0 10-3 -66,2% koncentráció tartományokban azonosítottuk és mértük. A felsorolt mátrixok szárazanyag-tartalmaikra számított azonosítottsága, rendre, 26,4-77,5% (i), 35,0-69,2% (ii), 45,2-77,8% (iii), 64,4-101,8% (iv) és 85,5-96,0% (v) között változott.
4. Az értekezés anyagából készült dolgozatok, poszterek és szakmai elıadások Referált tudományos folyóiratokban megjelent közlemények: 1. Zs. Füzfai, E. Kovács, I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of the Main Constituents of Sour Cherries: Simultaneously, as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS Chromatographia, 60 (2004) S143-S151 2. Zs. Füzfai, Zs. F. Katona, E. Kovács, I. Molnár-Perl: Simultaneous identification and quantification of the sugar, polyalcohol, carboxylic and amino acid contents of sour cherry, apple and ber fruits as their trimethylsilyl derivatives, by gas chromatography mass spectrometry J. Agr. Food Chem. 52 (2004) 7444-7452 3. I. Molnár-Perl, Zs. Füzfai: Chromatographic, Capillary electrophoretic and capillary electrochromatographic techniques analysis of flavonoids J. Chromatogr. A 1073 (2005) 201-227 4. A. Kakasy, Zs. Füzfai, L. Kursinszki, I. Molnár-Perl, É. Lemberkovics: Analysis of Nonvolatile Constituents in Dracocephalum Species by HPLC and GC-MS Chromatographia, 63 (2006) S17-S22 5. I. Boldizsár, Z. Szőcs, Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Identification and quantification of the constituents of madder root by gas chromatography and high-performance liquid chromatography J. Chromatogr. A 1133 (2006) 259-274 6. Zs. Füzfai and I. Molnár-Perl: Gas chromatographic mass spectrometric fragmentation study of flavonoids as their trimethylsilyl derivatives: Analysis of flavonoids, sugars, carboxylic and amino acids in model systems and in citrus fruits J. Chromatogr. A 1149 (2007) 88-101
7. Zs. Füzfai, I. Boldizsár, I. Molnár-Perl: Characteristic fragmentation patterns of the trimethylsilyl and trimethylsilyl oxime derivatives of various saccharides as obtained by gas chromatography coupled to ion-trap mass spectrometry J. Chromatogr. A 1177 (2008) 183-189 Konferenciákon megjelent poszterek: 1. Füzfai Zsófia, Perlné Molnár Ibolya: Flavonoidok szililészter/(oxim) éterekkénti elemzése GC-MS eljárással: meggymintákból, szacharidokkal és karbonsavakkal egyidejőleg, egyetlen felvétel alapján Congressus Pharmaceuticus Hungaricus (poszter, 2003. május) 2. Zs. Füzfai, E. Kovács & I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of Various Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS; Determination of the Main Constituents of Sour Cherries 5th Balaton Symposium (poszter, 2003. szeptember) 3. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of Various Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS 8th HTC-Symposium (poszter, 2004. február) 4. Zs. Füzfai, Zs. Bánfalvi & I. Molnár-Perl: Analysis of the Amino and Carboxylic Acids, Sugars, Sugar Alcohols and Flavonoids in Potato Herbs as Their Trimethylsilyl Derivatives by GC/MS International Symposium on Chromatography 2004 (poszter, 2004. október) 5. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Analysis of the Amino and Carboxylic Acids, Sugars, Sugar Alcohols and Flavonoids in Sour Cherries, in Potato Herbs and in Dracocephalum moldavica as Their Trimethylsilyl Derivatives by GC/MS The 4th International Conference on Instrumental Methods of Analysis (Modern Trends and Applications) 2005 (poszter, 2005. október)
6. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: GC-MS Fragmentation Study of Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives: Analysis in Model Solution and in Citrus Fruits International Symposium on Chromatography 2006 (poszter, 2006. augusztus) Szakmai elıadások: 1. Füzfai Zsófia: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel ELTE, Házi TDK Konferencia (elıadás, 2002. december) 2. Füzfai Zsófia: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel Országos TDK Konferencia (elıadás, 2003. április) 3. Füzfai Zsófia, Perlné Molnár Ibolya: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel MKE, Fiatal analitikusok elıadói napja (elıadás, 2003. november) 4. Füzfai Zsófia: Természetes anyagok kromatográfiás vizsgálata ELTE, Vasi kémiatanárok továbbképzése (elıadás, 2006. november)