TERMÉSZETES MÁTRIXOK SZERVES ÖSSZETEVİINEK MINİSÉGI - MENNYISÉGI ELEMZÉSE, TRIMETILSZILIL SZÁRMAZÉKOKKÉNT, EGYETLEN OLDATBÓL, GC-MS ELJÁRÁSSAL

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS TERMÉSZETES MÁTRIXOK SZERVES ÖSSZETEVİINEK MINİSÉGI - MENNYISÉGI ELEMZÉSE, TRIMETILSZILIL SZÁRMAZÉKOKKÉNT, EGYETLEN OLDATBÓL, GC-MS ELJÁRÁSSAL Papp-Füzfai Zsófia Témavezetı: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémia Tanszék Kémia Doktori Iskola Vezetı: Dr. Inzelt György Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezetı: Dr. Záray Gyula Budapest, 2008

2 Köszönetnyilvánítás İszinte köszönettel tartozom mindazoknak, akik disszertációm elkészítésében segítségemre voltak: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanárnak, témavezetımnek, iránymutatásáért, önzetlen segítségéért, bátorításáért és tanácsaiért, Dr. Orbán Miklós és Dr. Záray Gyula egyetemi tanároknak, az Analitikai Kémiai Tanszék egykori és jelenlegi tanszékvezetıinek, hogy kutatómunkámat lehetıvé tették, Dr. Lemberkovics Éva egyetemi tanárnak, aki a sárkányfő mintákat rendelkezésünkre bocsátotta, Dr. Boldizsár Imre tanársegédnek, a festıbuzér-minták elemzésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségéért. 2

3 Tartalomjegyzék: 1. Bevezetés, célkitőzések Rövidítések jegyzéke Irodalmi áttekintés A flavonoidok Flavonoidok általános jellemzése, biológiai jelentıségük A flavonoidok elemzésének kromatográfiás lehetıségei Flavonoidok meghatározása GC módszerrel Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékkészítés nélkül Származékká alakított flavonoidok meghatározása Antrakinonok gázkromatográfiás meghatározásának lehetıségei Glikozidkötéső szacharidok trimetilszilil-származékainak GC-MS vizsgálata Az általunk vizsgált természetes mátrixok elemzési lehetıségei Citrus-gyümölcsök Sárkányfő-fajok Festıbuzér Meggyek és ber gyümölcs Kísérleti rész Kémszerek Minták Eszközök Módszerek A reagens oldatok készítése A származékképzés A modelloldatok készítése A minták elıkészítése az analízishez A minták hidrolízise A kísérleti eredmények értékelése Alapkutatás Flavonoidok TMS-származékokkénti GC-MS elemzése: fragmentációs tanulmány A választott flavonoidok TMS- és TMS (oxim)-származékainak fragmentációja A naringenin és a heszperetin fragmentációjának felhasználása a mennyiségi elemzésben A naringin, a heszperidin és a rutin optimális hidrolízis körülményeinek tanulmánya Antrakinonok szilil-származékká alakításának és fragmentciójának tanulmánya A modell-antrakinonok TMS- és TBDMS-származékainak fragmentációja Különbözı szacharidok TMS- és TMS(oxim)-származékainak fragmentációs tanulmánya Nem redukáló glikozidkötést tartalmazó szacharidok TMS-származékainak elválasztása és fragmentációja A redukáló glikozidos kötést tartalmazó szacharidok TMS(oxim)- származékainak elválasztása és fragmentációja A TMS és TMS(oxim)-származékká alakított szacharidok mennyiségi elemzésének lehetıségei szelektív fragmentum ionjaik alapján Analitikai alkalmazások

4 Modelloldatok válaszjelei A grépfrút, citrom és narancs albedók és préselt levek összetevıinek minıségimennyiségi elemzése Sárkányfő-fajok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése A festıgyökér-kivonatok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése A három hazai meggyfajta és az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségimennyiségi elemzése A három hazai meggyfajta összetevıi Az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése Új tudományos eredmények; Összefoglalás Summary Irodalmi hivatkozások Az értekezés anyagából készült dolgozatok, poszterek és szakmai elıadások

5 1. Bevezetés, célkitőzések A karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok trimetilszilil(oxim)- éter/észterekkénti, együttes, azaz egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı egyidejő gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) elemzése, mind az alapkutatás szintjén, mind nagyszámú természetes mátrix összetételének meghatározásában sokoldalúan bizonyított [1-12]. A flavonoidok és az antrakinonok a növényvilágban elterjedt, biológiai/fiziológiai szempontból jelentıs vegyületek, ezért minıségi-mennyiségi elemzésük különbözı természetes mátrixokban, érdeklıdésre tarthat számot. Munkánk célja volt, hogy a meglévı analízisrendszerünket a flavonoidok és az antrakinonok csoportjával bıvítsük. Elsı lépésként modell-vegyületek elemzése útján, részletes fragmentumanalitikai tanulmány készítését terveztük: a flavonoidok és az antrakinonok trimetilszilil- és trimetilszilil (oxim)-származékainak GC-MS elemzése közbeni fragmentációját és a képzıdött fragmentum-ionok mennyiségi elemzésre alkalmasságát vizsgáltuk. Második lépésként, modell-vizsgálataink eredményét felhasználva, optimáltuk - a flavonoidok meghatározását különbözı természetes anyagokból, mint citrusfélék, sárkányfő fajok; és - az antrakinonok elemzését festıbuzér kivonatokban. A különbözı természetes mátrixok vizsgálata során, kevésbé ismert diszacharidok azonosítása vált szükségessé. A diszacharidok elemzésével kapcsolatos korábbi kutatási eredmények tanulmányozása után, célul tőztük ki a glikozidkötést tartalmazó, különbözı polimerizációs fokú szacharidok részletes fragmentumanalitikai vizsgálatát. A Központi Élelmiszeripari Kutatóintézettel közös kutatásunk célja a meggyek és az indiai ber gyümölcs érés- és tárolás közbeni összetétel-változásának követése, így az érésmenet, valamint a tárolás optimalizálása volt. Ennek érdekében módszerünk, azaz, a karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok trimetilszilil (oxim)- éter/észterekkénti, együttes, egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı, egyidejő GC-MS elemzése segítségével a két természetes mátrix, a meggy és a ber gyümölcsök összetételét kívántuk feltérképezni. 5

6 2. Rövidítések jegyzéke ACN BSA BSTFA CE CEC kapilláris elektrokromatográfia D. Dracocephalum DAD diódasoros detektor DMF dimetil-formamid DMSO dimetil-szulfoxid FID lángionizációs detektor FL fluoreszcencia GC gázkromatográfia GC-MS gázkromatográfia - tömegspektrometria GLC HMDS HPLC LC MS MSD gáz-folyadék kromatográfia hexametil-diszilazán nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia folyadékkromatográfia tömegspektrometria tömegszelektív detektor MTBSTFA N-metil-N-terc.- butildimetilszilil - trifluoracetamid n.a. NMR PTC RSD RTGY SFE SPE SPME SFI TBDMSCl TFA TFAA THF TIC TLC TMAH TMCS TMS TMSI UV acetonitril N,O-bisz(trimetilszilil)- acetamid N,O-bisz(trimetilszilil)- trifluoracetamid kapillárelektroforézis nem azonosított mágneses-magrezonancia spektroszkópia fázis-átviteli katalízis relatív standard deviáció Rubia tinctorum (festıbuzér) gyökér-kivonat szuperkritikus folyadék extrakció szilárdfázisú extrakció szilárdfázisú mikroextrakció szelektív fragmentum ion terc.-butildimetil-klórszilán trifluorecetsav trifluorecetsav-anhidrid tetrahidrofurán összion-áram vékonyréteg-kromatográfia tetrametil-ammóniumhidroxid trimetil-klórszilán trimetilszilil N-trimetilszilil-imidazol ultraibolya 6

7 3. Irodalmi áttekintés A különbözı gyümölcsök, zöldségfélék és egyéb természetes alapú termékek (gomba, méz, gyógyszerhatóanyagot és/vagy ipari terméket szolgáltató növények, fák) összetételének jellemzésekor, a cukor- és polialkohol-tartalom minıségi-mennyiségi meghatározása mellett, ezek karbonsav-, esetenként aminosav-összetétele is fontos kiegészítı információul szolgál. Mindezek alapján, a fenti összetevık egy oldatból, egyetlen felvételbıl való, szelektív, minıségi és mennyiségi meghatározása, az elemzési munka hatásfoka, a feladatra fordított idı és anyagiak igénye szempontjából, kitüntetett jelentıségő. E feladat megoldásában a kromatográfia pótolhatatlan szerepe nem kétséges [13,14]. Az idevonatkozó irodalmi adatok ismeretében ugyancsak egyértelmő, hogy a nagyszámú, egymáshoz viszonyítva nagyságrendekkel eltérı koncentrációban jelenlévı, legkülönbözıbb funkciós csoportú összetevı egyidejő meghatározása azonos származékként, egyetlen elválasztókolonnán és egyetlen detektor alkalmazásával kizárólag a gázkromatográfia (GC), s a legkülönbözıbb funkciós csoportú vegyületek egyidejő trimetilszilil (TMS)-származékokkénti elemzése útján lehetséges [1-12]. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazásakor ugyanis, a nagyszámú, eltérı funkciós csoportú összetevı, egy oldatból való együttes mérése két különbözı detektor sorba kapcsolásával történhet: ilyen körülmények között is, a gázkromatográfiás elemzésekhez viszonyítva, az elválasztás hatásfoka/minısége rosszabb, a mérés szelektivitása és érzékenysége számottevıen kisebb, következésképp, az egy oldatból elemezhetı összetevık száma jelentısen kevesebb. Az elválasztást nehezíti, hogy a gyakorlati feladatok zömében a cukrok, cukoralkoholok és karbonsavak koncentrációja között nagyságrendbeli különbségek vannak [1-12]. A GC-meghatározások során a cukrok, cukoralkoholok, karbonsavak és aminosavak analízise TMS(oxim)-éter/észter származékokként egy oldatból, egyetlen detektorral oldható meg [7,9,13,14]. Amennyiben ez a detektor a tömegdetektor, és az elválás az egyes esetekben nem tökéletes, de az el nem váló összetevık szelektív fragmentum ionjai (SFI) ismertek, a kvantitatív elemzés lehetıségei jelentısen kedvezıbbek [1-12]. Ezt a korábban már sok esetben sikerrel alkalmazott, kedvezı analitikai eljárást kívántuk a flavonoidok és az antrakinonok csoportjával bıvíteni, melyhez elsı lépésként az irodalomban megtalálható gázkromatográfiás meghatározási lehetıségeket tekintettük át. 7

8 3.1. A flavonoidok Flavonoidok általános jellemzése, biológiai jelentıségük A flavonoid elnevezés a szerves vegyületek egy csoportját jelöli, melynek tagjai hasonló alapvázzal rendelkeznek (flavon, flavanon, flavonol, izoflavon, katechin, antocianidin; 1. Ábra), amelyhez általában a 3, 5, 7, 3, 4 szénatomokon hidroxil-, illetve metoxi-csoportok kapcsolódnak. A vegyületek részben szabadon (aglikon), részben glikozidjaik (glikozid) formájában fordulnak elı a különbözı növényekben, azaz egyes hidroxil-csoportokon keresztül valamilyen mono-, di-, vagy triszacharidhoz kapcsolódnak. Ebbıl következik az a nagy szerkezeti változatosság, amely a flavonoidok csoportját jellemzi: elméletileg több mint flavonoid létezhet, mostanáig több mint számút már sikerült azonosítani [15]. Csak a kvercetinnek több mint 179 glikozidja ismeretes [16,17]. 1. Ábra A flavonoid vegyületcsoport alapvetı típusai 3' 7 O + 2' 2 6' 4 5' O O OH OH O Antocianidinek Katechinek Flavonok O O O O OH O O Flavonolok Flavanonok Izoflavonok A flavonoidok a természetben széles körben elterjedt vegyületek. Mikroorganizmusokban és algákban nem találhatók, moszatokból sikerült flavonoidokat izolálni [18]. Magasabbrendő növényekben (harasztok, nyitvatermık, zárvatermık) viszonylag nagy mennyiségben és igen változatos formában vannak jelen [18]. Néhány flavonoid-aglikon, mint a kempferol és kvercetin gyakori a növényvilágban, a zárvatermık mintegy 75%-a tartalmazza e vegyületeket. A harmadik legelterjedtebb a miricetin, mely a 8

9 zárvatermı növények 10%-ában elıfordul. A glikozidok közül a rutin (kvercetin-rutinozid) a leggyakoribb, a vizsgált növények 50%-a tartalmazza. A többi flavonoid kevésbé elterjedt, csupán bizonyos növénycsoportokra jellemzık. Az antocianidinek színes vegyületek, melyek a virágok, gyümölcsök nagy részének színét okozzák [18]. A flavonoidok élettani hatása sokáig ismeretlen volt. Biológiai jelentıségük felismerése magyar kutatók nevéhez főzıdik ban Szent-Györgyi Albert izolálta a rutint, és Rusznyák Istvánnal együtt kimutatta hajszálér-permeabilitást és -törékenységet mérséklı hatását (P-vitamin) [19]. A rutin kémiai szerkezetét ugyancsak magyar kutatók, Zemplén Géza és Gerecs Árpád derítették fel [20]. Manapság a rutint önmagában, vagy C-vitaminnal kiegészítve (Rutascorbin) alkalmazzák gyógyászati célokra. A vegyületcsoport fontossága (azaz, hogy sokoldalú jótékony hatású természetes vegyületek) a felbecsülhetetlen fiziológiai/biológiai és gyakorlati tulajdonságaikból fakad [21-22]. A polifenolos szerkezető és antioxidáns hatású flavonoidok (melyeket majdnem minden növényben, zöldségben és gyümölcsben fıként β-glikozidjaik formájában azonosítottak [22]) az élı szervezetben gyorsan felszívódnak [21]. Epidemiológiai tanulmányok szerint a flavonoid-tartalmú zöldségek és gyümölcsök, antioxidáns hatásuknak köszönhetıen védı hatásúak a rák, a szívinfarktus és a szív-koszorúér betegségek ellen. [22]. Flavonoidok antimutagén hatását bróm-benzollal kezelt patkányokon bizonyították [23] A flavonoidok elemzésének kromatográfiás lehetıségei Az irodalmat áttekintve kitőnik, hogy nagyszámú dolgozat foglalkozik különbözı mátrixok flavonoid-tartalmának minıségi és/vagy mennyiségi elemzésével [25-62]. A flavonoidok teljes körő analízise, ideértve a részletes szerkezetet, a győrők helyzetét, a kettıskötések számát, a szabad és szubsztituált hidroxil-csoportokat és a győrő egyéb szubsztituenseit, az analitikai kémikusok valamint a fejlett elválasztási és azonosítási technikák (kromatográfia, mágneses-magrezonancia spektroszkópia {NMR}, tömegspektrometria {MS}, stb.) szoros összhangját igényli. Természetesen a legmegfelelıbb megoldás erre a feladatra a HPLC-MS-NMR készülék volna, mely ezeket az elvárásokat egyszerre teljesíti [24]. Sajnálatos módon csupán néhány laboratórium rendelkezik ilyen viszonylag új rendszerrel. Az egyszerőbb berendezések, mint HPLC, kapillárelektroforézis (CE), kapilláris elektrokromatográfia (CEC), GC, is hasznos információkat szolgáltathatnak a minıségimennyiségi meghatározás tekintetében. A kromatográfia kiegészítése egyéb, kapcsolt 9

10 detektor-rendszerekkel {HPLC: ultraibolya (UV) - fluoreszcens (FL), diódasoros detektor (DAD) - FL, UV(DAD)-MS; GC: lángionizációs detektor (FID), MS, MS-MS} hatványozottan növeli az analitikai eredmények bizonyosságát [25]. A közlemények áttekintése alapján megállapítható, hogy az elızetes mintaelıkészítési lépések, mint elválasztás/extrakció, az analízis megbízhatósága és reprodukálhatósága tekintetében elsıdleges fontosságúak [25-28]. Flavonoidok különbözı természetes mátrixokból való elkülönítése céljából, számos klasszikus és modern technikát vizsgáltak meg. Az irodalom összegzése alapján elmondható, hogy általánosan optimális körülmények nincsenek, mivel azok függnek a komponensektıl és a mátrixtól: elemzésük kivonatokból történik [25-28]. Mivel a flavonoidok a természetes mátrixokban mind szabad aglikonok, mind glikozidok formájában elıfordulnak, ily módon a szabad és glikozid kötéső flavonoidok egyenkénti meghatározása hidrolízissel követhetı [25]: (i) Az extraktum flavonoid-tartalmának kromatográfiás meghatározása hidrolízis nélkül, annak reményében, hogy a szabad és cukor-tartalmú flavonoidok egymás jelenlétében minıségileg-mennyiségileg meghatározhatók. (ii) A hidrolizált extraktumokból, különös tekintettel a TMS-származékok GC-MS elemzésére, nagyszámú összetevı meghatározása lehetséges. Természetesen, ebben az esetben a szabad aglikonok és a hidrolízis elıtt glikozid formában levı flavonoidok nem különíthetık el: mennyiségük számítható. Nagy molekulatömegük és az aglikonok hidrofób, a glikozidok hidrofil tulajdonságai miatt, a kromatográfiás javaslatok nagy része a HPLC-t és/vagy a kapcsolódó technikákat részesíti elınyben [25-28]. Jóllehet, a GC tömegdetektorral kiegészítve, az aglikonok, fıleg az összes többi összetevı szilil-származékkénti, egyidejő elemzése esetén, mással nem helyettesíthetı technika Flavonoidok meghatározása GC módszerrel Az irodalomban a flavonoidok GC meghatározására két megközelítés általános: (i) Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékképzés nélkül (ii) Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékká (metil- és etilszármazékok; szilil-származékok) alakított formában. 10

11 Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékkészítés nélkül Ez a megközelítés a flavonoidok nagy molekulatömege miatt meglepı. Az irodalomban mégis találhatunk munkákat, melyekben különbözı természetes mátrixok flavonoidjait származékkészítés nélkül, GC-módszerrel elemzik [29-37]. A dolgozatokat az 1. Táblázat foglalja össze. A szerzık a származékká alakítás elhagyásának fı elınyeként, az elemzési idı csökkenését említik, tehát a flavonoidok és egyéb illékony összetevık gyors GC-elemzésére javasolják ezt a módszert [30-33, 35]. Ugyanakkor a kromatográfiás elválasztások perc idıtartamúak, mely átlagosnak nevezhetı, továbbá hosszadalmas mintaelıkészítés elızi meg a méréseket: szuperkritikus-folyadék-extrakciót (SFE) [35], Soxhlet extrakciót [36], vagy egyszerő oldószeres extrakciót [30-37] alkalmaznak, majd a kivonatokat GC-FID [30-33,37] és/vagy GC-MS [29-36] rendszerbe injektálják. Egyetlen dolgozat esetében a szárításon, és az aprításon kívül nincsen mintaelıkészítési lépés, a porított mintát közvetlenül adagolják a pirolízis-tér-ionizációs tömegspektrométerbe [29]. A meghatározások az esetek többségében minıségi elemzésre korlátozódnak [29-33, 35], három esetben találhatunk mennyiségi adatokat [34,36,37]. A minıségi elemzések során különbözı természetes mátrixokban, 3-26 flavonoid-aglikont azonosítottak egyéb összetevık mellett. Céljuk a különbözı növényfajok összetevıinek leírása volt, melyhez a minıségi azonosítás elegendı. A három mennyiségi elemzést tartalmazó dolgozat közül kettı tekinthetı valódi mennyiségi meghatározásnak [36,37], mivel a harmadik [34] esetben az azonosított 14 aglikon közül 12 esetében, csak nyomnyi mennyiséget tudtak megállapítani. 11

12 1. Táblázat Flavonoidok származékképzés nélküli gázkromatográfiás elemzése Mátrix Mintaelıkészítés Elválasztás Det Norvég lucfenyı tőlevelek Propolisz Arnica alpina ssp. attenuata virág/ Arnica angustifolia Vahl subsp. attenuata Thymus vulgaris levél, virág, szár Scutellaria baicalensis gyökér Rezgı nyárfa Kaempferia parviflora rizóma szárítás, aprítás 1g minta+15ml metanol 1h, extr. 3 petróleum, 3 dietiléter; egyesítés, beszárítás; + 100µL aceton, inj.: 1-2 µl metilén-klorid extraktum metanolban oldható frakciója gél-kromatográfia (SephadexLH-20) szárítás, aprítás, diklórmetán-extraktum szárítás, aprítás, 1g minta SFE (10mL cartridge), 70% metanol, 20mL CO 2 (l) 3 15min 3 20mL kül. oldószerek 30min liofilizálás, Soxhlet extr. 8h, 200mL aceton, 4-5 ciklus, frakciók egyesítése, lepárlás, lefúvatás N 2 árammal, maradék ~1mL szárított rizóma-por +95% etanol (4nap, szobahım.) szőrés vákuumban, fagyasztva-szárítás, metanolos törzsoldat pirolízis: (100µg por) o C (12min), kol: 30m 0,25mm DB17-30N / 30m 0,32 DB1-30W; hım.pr.: o C (5 o C/min) o C (10 o C/min) kol: 9m 0,25mm SE- 54; hım.pr.: o C (20 o C/min) o C (2 o C/min) 300 o C (10min) kol: 25m 0,25mm Permabond OV-1; izoterm: 270 o C kol: 30m 0,25mm (5% fenil-metil-szilikon); hım.pr.: 50 o C (0,5min) o C (10 o C/min) kol: 30m 0,25mm HP- 5MS; hım.pr.: 100 o C (2min) o C (10 o C/min) 280 o C (15min) kol: 10m 0,25mm DB- XLBitd; hım.pr.: 50 o (3min) o C (10 o C/min) 340 o C (36min) o C (10 o C/min) kol: 30m 0,32mm HP50+ hım.pr.: 255 C (2min) C (1 C/min) 260 C (15min) C (5 C/min) C (0,5 C/min) 269 C (3min) C (0,5 C/min) 270 C (5min) C (1 C/min) 277 C (10min) MS FID/MS FID/MS Azonosított flavonoidok kempferol, epikatechin, pungenin, izoramnetin krizin, tektokrizin, galangin, pinocembrin 21 aglikon/ 26 aglikon Ref [29] [30] [31-33] MS 14 aglikon [34] MS wogonin, baikalin, baikalein [35] MS 4 aglikon [36] FID 11 aglikon [37] Jelölések: Det = detektálás, Ref = referencia; kol = kolonna; hım.pr. = hımérséklet-program; extr. = extrakció, szobahım. = szobahımérséklet, SFE = szuperkritikus-folyadék-extrakció, FID = lángionizációs detektor; MS = tömegdetektor 12

13 Származékká alakított flavonoidok meghatározása a.) Flavonoidok meghatározása metil- és etil-származékokként A flavonoidok meghatározása metil- és etil-származékokként nem elterjedt módszer, melyet a témában született dolgozatok csekély száma bizonyít [38-40]. A három dolgozat közül a legkorábbi [38], kizárólag elméleti jelentıségő: perdeuterometilezett modell-flavonoidokat vizsgáltak GC-MS módszerrel. A flavonoid-glikozidokat perdeutero-metilezés után, 2 N kénsavoldattal hidrolizálták, majd ezt követıen éterben diazoetánnal etilezték. Így a cukor-egység aglikonhoz kapcsolódási helyét állapították meg (a cukoregységet nem mérték), és felderítették az aglikonok fragmentációját. A módszer gyakorlati alkalmazását nem írták le. A másik két dolgozatban természetes mátrixok fenolos összetevıit elemezték [39,40]. Diazo-metán [39] és metil-jodid [40] alkalmazásával képzett metil-származékok oldatait injektálták a GC-MS rendszerbe. Fázis-átviteli katalízist (PTC) tanulmányoztak a metil-jodid esetében: extrakciót és származék-képzést egyesítı módszert dolgoztak ki [40]. Így, különbözı növényi kivonatok nyolc fenolkarbonsav és négy flavonoid (naringenin, galangin, kempferol, luteolin) összetevıjének minıségét és mennyiségét mérték. A propolisz-kivonat fenolos összetevıit metil-származékként, GC-MS eljárással mérték [39]. A flavonoid származékok kis GC-MS válaszjelei miatt, a mennyiségi meghatározáshoz HPLC-t alkalmaztak UV detektálással. b.) Flavonoidok meghatározása szilil-származékokként A gázkromatográfiás elemzések során a vizsgált anyagok illékonyságának növelésére, a különbözı szilil-származékokká alakítás a legelterjedtebb módszer, melyre a flavonoidok meghatározásában is sok példát találunk [41-62]. A dolgozatokat a 2. Táblázat foglalja össze. Az elemzések során, egy kivétellel [60], TMS-származékokat képeznek, melyeket hexametil-diszilazán (HMDS) [41,43-45], N,O-bisz(trimetilszilil)-acetamid (BSA) [42,52,53] és N,O-bisz(trimetilszilil)-trifluoracetamid (BSTFA) [45-51,54-59,61,62] szililezıszerekkel állítanak elı, és az esetek egy részében trimetil-klórszilán (TMCS) katalizátort alkalmaznak [41-44,55,62]. Az egyetlen kivétel, ahol a származékképzéshez N-metil-N-terc.- butildimetilszilil-trifluoracetamidot (MTBSTFA) alkalmaznak, és ekkor terc.-butil- 13

14 dimetilszilil-származékokat (TBDMS) kapnak [60]. A származékképzési reakciót szobahımérsékleten [41], vagy magasabb hıfokokon ( o C), eltérı ideig vezetik [42-62], a körülmények esetenként különböznek. A származékképzést valamennyi mátrix esetében kivonási lépés elızi meg, mely egyszerő oldószeres extrakció [44-52,54-56,59,61,62], Soxhlet extrakció [42,57] vagy szilárd fázisú extrakció (SPE) [53,60]. Két esetben a kivonást sósavas [52,53] vagy enzimes hidrolízis [52] követte. Modellvizsgálatok során a származékká alakított flavonoidok kromatográfiás és/vagy tömegspektrometriás tulajdonságait kutatták [41,43,58], melyek közül a legkorábbi dolgozat 1966-ban született. A többi vizsgálat célja valamilyen növény, vagy növényi kivonat (Sophora japonica, Alpinia japonica, nyárfa fajok, propolisz, eurázsiai varjúháj, kövirózsa, szentjánoskenyér, Croton hemiargyreus) összetételének minıségi és/vagy mennyiségi leírása [42,44-52,56-57,59], vagy biológiai minták (vérplazma, vizelet, széklet) flavonoidkoncentrációjának idıbeli követése volt [53-55,60-62]. Az elemzések a 2. Táblázat Azonosított flavonoidok oszlopában feltüntetett összetevıkre terjedtek ki, egyéb összetevıket (karbonsavak, cukrok, cukoralkoholok, aminosavak, stb.) nem mértek. Fıként a korai dolgozatokban minıségi elemzéseket találunk [41-50,59], a többi esetben az összetevık mennyiségét is mérték [51-58, 60-62]. Hasonlóképpen, FID detektálásra is a korai cikkek között találunk példát [41,42,51], a többi dolgozatban MS detektálást alkalmaznak [45-50, 53-62], esetenként FID mellett [43,44,52]. A dolgozatok áttekintése után megállapítható, hogy a flavonoidok szililszármazékokként elemzése mindenkor eredményes volt, jóllehet fragmentumanalitikai tanulmányokat, a vizsgált mátrixok esetében, nem tartalmaznak. Ugyanakkor a fenolos összetevık mellett más anyagokat (cukrok, karbonsavak, aminosavak) nem mértek. 14

15 2. Táblázat Flavonoidok minıségi-mennyiségi meghatározása szililszármazékokként, gázkromatográfiás módszerrel Mátrix Mintaelıkészítés Elválasztás Det Azonosított flavonoidok Ref Modellvegyületek, szılılé, burgundi bor, bodzakivonat Sophora japonica (bimbó) Alpinia japonica (mag) Modellvegyületek, Vaccinum myrtillus Nyárfa-fajok Propolisz 6-10mg + 1mL piridin+0,2ml HMDS+0,1mL TMCS (50 C, 10min), majd 30mg minta+0,5ml DMSO+0,2mL HMDS+0,1mL TMCS (melegítés nélkül) Extr.:100mg drog+10ml metanol reflux (2h)+újabb 10mL metanol reflux(4h)-lepárlás +20mg koleszteril-benzoát+2ml piridin+2ml BSA+0,6mL TMCS (60 C, 2h) Közv.: 100mg drog+20mg koleszterilbenzoát+3ml piridin+2ml BSA (120 C, 6h) 1mg modellvegyület+0,1ml TMCS+0,2mL HMDS+100µL DMSO+150µL THF (80 C, teljes oldódásig és elszíntelenedésig) [43] 50g fagyasztott gyümölcs+100ml metanol (5h, szobah.) lepárlás, liofilizálás 50mL metanolban oldás 0,5mL lepárlás +0,2mL TMCS+0,4mL HMDS+0,03mL dioxán+0,015ml THF (60 C, 30min) [44] 4db rügy+1ml dietiléter (10s), lepárlás+50µl piridin+100µl BSTFA(1%TMCS) (100 C, 30min) 1g minta+20ml 70% etanol (éjszaka) lepárlás; Szárm.: 1.5mg extrakt+95µl BSTFA (65 C,30min) kol: töltetes oszlop: 6 láb ¼ inch SE-30 hım.pr.: C (többféle program) kol: töltetes oszlop: 1/1,5/2m 3,0mm OV-1/OV-17/OV-25/OV-210/OV-225 hım.pr.: izoterm: 210 C (flavonoidok)/260 C (flavonoidglikozidok) kol: 0,5m 2mm OV-101 hım.pr.: C (10 C/min) [43] 20m 0,3mm SE-52 hım.pr.: C (1 C/min) [44] kol: 50m 0,3mm OV-1, 25m 0,32mm OV-1, hım.pr.: C (3 C/min) kol: 9m 0,25mm, hım.pr.: C (20 C/min) C (2 C/min) [49], C (40 C/min) C (12 C/min) 390 C (20min) FID FID FID/MS MS FID [51] MS [56] pelargonidin, cianidin, delfinidin, malvidin, petunidin alpinon, izalpinin, 3- acetalpinon, kvercetin, rutin pinocembrin, galangin, kávésav, β-fenil-etil-kaffeát [41] [42] [43] [44] petunidin, petunidin-glükozid, petunidin-di-glükozid, malvidin, malvidin-glükozid, petunidin-di-glükozid, cianidin, cianidin-glükozid, cianidin-xilozilglükozid, cianidin-di-glükozid, cianidinxilozilglükozid-glükozid fenolkarbonsavak, katechin [45], fenolkarbonsavak, pinocembrin, pinostrombin, pinobanksin, tektokrizin, krizin, galangin, naringenin, katechin, luteolin, taxifolin [46-50] [45-50] [51] [56] 15

16 2. Táblázat folytatása Mátrix Mintaelıkészítés Elválasztás Det Azonosított flavonoidok Ref Eurázsiai varjúháj, kövirózsa Gingko biloba flavonoidjai emberi vizeletben Gingko biloba flavonoidjai gyógyszerészeti készítményekben Biológiai folyadékok Szentjánoskenyér rost Modellvegyületek, Croton hemiargyreus levelei Török propolisz 10g szárított levél+40g aceton - centr., felülúszóbepárlás Vizes oldat híg. H 2 O 10 g-ra, mosás; Hidr.: extr.+ 10 ml 2 M HCl (100 C,1h) elpárologtatás, extr. dietiléter (3 ml 15 ml); Szárm.: szárított extrakt+0.5-1ml piridin 100µL+100µL BSA (70 C, éjszaka) hidr.: 1mL vizelet+0.5 ml 3M HCl (80 C, 1h), vagy β-glükuronidáz+1ml puffer (ph 8) SPE; Szárm.: maradék+0.2ml BSA (70 C, 30min) 40mg extrakt+5ml 1M HCl 20%metanol (85 C, 1h); keveréses extr. 5mL EtAc (1min vortex, 5min szonikálás, 10min centr.) Szárm.: 50µL szerves fázis+250µl DMF + 250µL BSTFA cont 1%TMCS(115 C, 45min) 100 µl szérum/vizelet+0.8ml EtAc, majd 0,5mL EtAc centr. (5min, 3500g); EtAc fázis-szőrés. (Na 2 SO 4 ); Szárm.: 100µL EtAC+100µL BSTFA (vortex 30s, 70 C, 1h) - 10g+100ml H 2 O (18h, szobah.) centr. (30min, 5000g)-felülúszó - 10g - Soxhlet extr.: hexán 3h, metanol 3h (ezt alkalmazták nagy mennyiségő mintához) Szárm.: 10µL extrakt+100µl BSTFA (37 C, 30min) 1mg std µL BSTFA (60 C, 30min C, 5min/ 100 C, 72h) +70% etanol (24h), lepárlás 5mg+50 µl piridin+75µl BSTFA (80 C, 20min) kol: 10m 0,32/0,25mm hım.pr.: C (4 C/min) kol: 30m 0,32mm Restek RTX-5 hım.pr.: C (20 C/min) C (5 C/min) kol: 20m 0,20mm HP Ultra 1 hım.pr.: C (25 C/min) 245 C (25,5min) C (60 C/min) 270 C (8min) kol: DB-5I; hım.pr.: 120 C (2min) C (20 C/min) 300 C (6min) kol: 30m 0,25mm HP 5MS hım.pr.: C (4 C/min) 270 C (20min) kol: 17m 0,20mm HP-1 hım.pr.: C (40 C/min) C (12 C/min) 360 C (5min) kol: 23m 0,25mm HP 5MS hım.pr.: C (5 C/min) 270 C (20min) FID/MS kempferol, herbacetin, sezangulaterin, kvercetin, gosszipetin, konikulatuzin, izoramnetin, limocitrin, miricetin, hibiszcetin [52] MS kvercetin, kempferol [53] MS MS MS MS MS bilobalid, ginkgolid A, ginkgolid B, ginkgolid C, kempferol, izoramnetin, kvercetin trans-rezveratrol, katechin, fizetin, kvercetin fenolkarbonsavak, apigenin, krizoeriol, tricetin-glükozid, kempferol-ramnozid, kvercetin-ramnozid, kvercetinarabinozid, miricetinramnozid, miricetin-glükozid, naringenin, genistein heszperidin, krizin, apigenin, kvercetin fenolkarbonsavak, pinocembrin, pinobanksin, krizin, galangin [55] [54] [57] [58] [59] 16

17 2. Táblázat folytatása Mátrix Mintaelıkészítés Elválasztás Det Azonosított flavonoidok Ref Emberi széklet Emberi vérplazma 10 ml fermentum SPE(C18)-lepárlás Szárm.: +50µL acetonitril+20µl TBDMS(1%TBDMSCl) (30min), beszárítás 20µL undekán [60] centr g-felülúszó, szőrés, enzimes kezelés Szárm.: +10µL ACN+50µL BSTFA (1%TMCS) (50 C, 4h) [61] 300µL plazma extr. 3 0,5mL EtAc, vortex (1min) +0,5M HCl (ph 2) EtAc fázis lepárlás Szárm.: +50µL BSTFA+TMCS (70 C, 4h) kol: 15m 0,25mm DB-1701 hım.pr.: 150 C (1min) C (20 C/min) [60] kol: 12m 0,2mm DB-5 hım.pr.: 100 C (1,5min) C (10 C/min) 140 C (2min) C (15 C/min) C (2 C/min) C (15 C/min) C (20 C/min) 262 C (4min) C (10 C/min) 290 C (3min) [61] kol: 30m 0,35mm DB-5 hım.pr.: 80 C (1min) C (10 C/min) C (20 C/min) 310 C (6min) MS MS fenolkarbonsavak, naringin, rutin [60] naringenin, kvercetin, formononetin, (epi)katechin, izoramnetin, apigenin, kempferol, rezveratrol, daidzein, floretin, diozmetin, eriodiktiol, biochanin, genistein, hesperetin [61] fenolkarbonsavak, rezveratrol, (epi)katechin, kvercetin, miricetin Jelölések, mint az 1. Táblázatban, továbbá: hidr. = hidrolízis, szárm. = származékkészítés, centr. = centrifugálás, híg. = hígítás, std. = standard, SPE = szilárd fázisú extrakció, HMDS = hexametil-diszilazán, TMCS = trimetil-klórszilán, BSA = N,O-bisz(trimetilszilil)-acetamid, BSTFA = N,O-bisz(trimetilszilil)-trifluoracetamid, TBDMS = N-metil-N-terc.-butildimetilszilil-trifluoracetamid, TBDMSCl = terc.-butildimetil-klórszilán, DMSO = dimetil-szulfoxid, THF = tertahidrofurán, EtAc = etil-acetát, DMF = dimetil-formamid, ACN = acetonitril [60] [61] [62] 17

18 3.2. Antrakinonok gázkromatográfiás meghatározásának lehetıségei Gázkromatográfiás módszerrel a festıbuzér antrakinonjait eddig nem vizsgálták, ezért a növény- és gombavilágban elıforduló egyéb antrakinon-származékok gázkromatográfiás elemzésével foglalkozó irodalmat tekintettük át (3. Táblázat). A közlemények alapján az antrakinonok származékkészítés nélkül [70-72], vagy származékká alakítás után [63-68,73-75] egyaránt elválaszthatók. A származékkészítéshez számos módszert alkalmaznak, melyeknél a körülmények (reagens, hıfok, idıtartam) különbözıek, és ezeket nem optimálták. Szilil-származékok elıállításához HMDS-t [63,66], BSA-t [64,65,67,68], és BSTFA-t [74,75] használnak. Egy esetben általánosan nem elterjedt szililezési módszert is felhasználtak, reduktív trimetilsziliezést végeztek N-metil-N-trimetilszilil-trifluoracetamiddal ammónium-jodid katalizátor jelenlétében [69]. Az MTBSTFA reagenst az antrakinonok esetében nem alkalmazták. Egyedi módszert, vizes közegben tetrametil-ammónium-hidroxid jelenlétében, pirolízist használtak modell-vegyületek vizsgálatára, mellyel céljuk módszerkidolgozás volt régi mővészi alkotások festékanyagainak vizsgálatához [73]. A meghatározások nagy része modellvizsgálat [63-67,69,73,75], ahol a GC elválasztás körülményeit, illetıleg a vegyületek fragmentációját tanulmányozták [64,66,69]. A fragmentációs vizsgálat, egy esetben [67] a képzıdött fragmentum-ionok, és intenzitásuk felsorolására korlátozódott, s nem terjedt ki a fragmentum-ionok képzıdésének és összetételének magyarázatára. A további két esetben a kutatások [66,69] reduktív szililezés során keletkezett antrakinon-származékokra vonatkoztak. Ekkor az antrakinonok két kettıs kötéső oxigénjéhez is kapcsolódnak TMS-csoportok, emiatt fragmentációjuk eltér az általunk vizsgált termékektıl. A modellvizsgálatok nagy része minıségi elemzés volt [63-67, 73], mennyiségi adatokat két közleményben adtak meg [69, 75]. A többi dolgozatban az antrakinon ipari elıállítását követik [70], kozmetikumokat [68], aloe-tartalmú termékeket [74], környezeti mintákat [71] és egyéb növényi mintákat [72] vizsgálnak. Ezekben az estekben, egyet kivéve [70], mintaelıkészítésként kivonási módszert is alkalmaznak [68,71,72,74]. Valamennyi mátrix vizsgálatában mennyiségi eredményeket közölnek. A detektálás kétféle: FID [63-65,67,70], valamint az informatívabb MS [66,68-69,71-75]. A mért antrakinonok száma 1 és 37 között változott. 18

19 3. Táblázat Antrakinonok minıségi-mennyiségi meghatározása gázkromatográfiás módszerrel Mátrix Mintaelıkészítés Elválasztás Det Azonosított A. Ref Modellvegyületek Szárm.: 1-2 mg minta+0,1 ml piridin+0,1 ml HMDS + kol: töltetes oszlop: 2,25m 4mm 1,5% SE-30 on 0,05 ml TMCS, összerázás 30s 10min állás 25 C Chromosorb W; izoterm: 240 C FID 18 [63] Modellvegyületek Szárm.: 1.: 50 mg minta+10 ml CHCl 3 +1 ml BSA, kol: töltetes oszlopok: OV-101, OV-1,UC-W98, keverés 1min + 3 csepp TFAA; 2.: 50 mg minta+10 ml OV-17 nitrobenzol + 1ml TFAA keverés + 3 csepp piridin FID 9 [64] Szárm.: 1-2 mg minta+100µl BSA/TMCS=5/1, 30s rázás kol: töltetes oszlop: 3% SE-30 on Gas-Chrom Q Modellvegyületek 5min állás 25 C hım.pr.: 225 C (8min) C (5 C/min) FID 13 [65] Modellvegyületek Szárm.: 10 mg minta+1.0 ml piridin+0.2 ml HMDS + kol: 25m SE-54 SCOT 0.1ml TMCS, 80 C(2h)+25 C (8h); red. szil. (10mg Zn) hım.pr.: 70 C (2min) C (8 C/min) MS 9 [66] Modellvegyületek Szárm.: mg minta+tmsi:bsa:tmcs= 3:3:2 kol: 10m 0,32mm 5 CB Kozmetikumok Modellvegyületek A. ipari elıállítás követése Környezeti minták Növényi minták Extr.: 10mL alkoholos oldat lepárlás +20mL víz ODS cartridge eluátum; Szárm.: eluátum lepárlás +200µl ACN + 200µl BSA, 90 C, 60perc Szárm.: minta + MSTFA, ammónium-jodid, 60 C, 60min (reduktív szililezés) Extr.: 5g iszap + 40mL CH 2 Cl 2 -aceton (5:1) 15min 125 C 1mL rész tisztítás 5g szilikán acetonos kivonat; Szárm.: Extr.: homogenizálás, fagyasztva szárítás 1g minta +100mL 0,2% NaHCO 3 ACN (6:4) 40min ultrahangos fürdı szőrés extrakció: CHCl 3 ; Szárm.: Modellvegyületek Szárm.: minta+3 µl TMAH, 10s pirolízis 700 C Aloe tartalmú termékek (ital, gél, por, kapszula) Extr.: 1mL termék +0,5mL etanol+1ml telített NaCl oldat+2ml EtAc-metanol (9:1) vortex (30s)- centr. szerves fázis lepárlás oldás: 0,5mL EtAc-metanol (9:1); Szárm.: kivonat+100 ml BSTFA, 70 C, 15 perc Szárm.: minta+1-3 µl BSTFA, termál deszorpció (In-tube hım.pr.: 200 C (3min) C (5 C/min) kol: töltetes oszlop: 1m 2mm, 2% OV Chromosorb W AW; hım.pr.: 250 C (2min) C (16 C/min) 280 C (4min) kol: 25m 0,2mm OV-1; hım.pr.: 80 C (3min) C (25 C/min) 280 C (10min) kol: töltetes oszlop: 6 láb ⅛ inch 15% OV-17 on Chromosorb W AW; hım.pr.: izoterm 250 C kol: 30m 0,25mm DB-5; hım.pr.: 90 C (0,1min) C (6 C/min) 280 C (1min) C (20 C/min) 300 C (20min) kol: 15m 0,25mm DB5 izoterm: 260 C kol: 30m 0,25mm SPB5; hım.pr.: 50 C (2min) C (5 C/min) kol: 20m 0,18mm DB-1 (majd 10m 0,18mm DB- 1); hım.pr.: 150 C (1min) C (30 C/min) FID/MS 37 [67] MS 1 [68] MS 10 [69] FID 1 [70] MS MS-MS 4 [71] MS 3 [72] MS 3 [73] MS 2 [74] kol: 30m 0,25mm HP-5MS; hım.pr.: 50 C (3min) Modellvegyületek MS 9 [75] szililezés) C (10 C/min) Jelölések, mint az 1-2. Táblázatban, továbbá: A. = antrakinon, red.szil. = reduktív szililezés, CHCl 3 = kloroform, CH 2 Cl 2 = diklórmetán, TFAA = trifluorecetsavanhidrid, TMSI=N-trimetilszilil-imidazol; MSTFA = N-metil-N-trimetilszilil-trifluor-acetamid, TMAH = tetrametil-ammónium-hidroxid 19

20 3.3. Glikozidkötéső szacharidok trimetilszilil-származékainak GC-MS vizsgálata A glikozidkötéső, különbözı polimerizációs fokú szacharidok minıségi-mennyiségi meghatározására jó lehetıséget nyújt a TMS-származékaik GC-MS elválasztása. Az egylépéses szililezés kiváló a nem redukáló cukrok esetében, melyek egyetlen terméket adnak. A redukáló szacharidok szililezése elméletileg 6 termékhez vezethet: a győrős α és β- piranóz/furanóz anomer párok és a két nyílt láncú forma keletkezik. Ez a szükségtelen konformációs információ lehetetlenné teszi több szacharid egymás melletti elválasztását. Amennyiben a kétlépcsıs származékkészítést követjük elsı lépésben oximmá/metoximmá alakítás, második lépésben szililezés sokkal egyszerőbb képet kapunk: szin (Z) és anti (E) oximokat/metoximokat, melyek e cukrok redukáló tulajdonságát jelzik. Az MS detektor nagy segítséget nyújt a különbözı polimerizációs fokú szacharidok minıségi-mennyiségi meghatározásában, fıként abban az esetben, ha egy természetes mátrixban több azonos polimerizációs fokú szacharid található egymás jelenlétében. Mint ismeretes, ezek egymástól a hidroxil-csoportjaik helyzetében különböznek, így SFI szerinti azonosításuk, hasonló fragmentációjuk miatt, nem egyszerő. Korai irodalmi adatok [76-83] jelentısége, hogy megalapozták a mai fragmentációs kutatásokat. A közleményekben a TMS-aldozil- [76], TMS-fruktozil-oligoszacharidokat [77], oligoszacharidok TMS-származékait [78], oligoszacharid alditolokat [78,79], deutériummal jelzett monoszacharidok TMS-származékait [80], 2-ketohexózok TMS-étereit [81], cukrok és hidroxi-savak kromatográfiás elemzését [82], mono- és diszacharidok TMS-metiloximjait [83] vizsgálták. A tanulmányok néhány kivételtıl eltekintve [80,82,83] a vizsgált anyagok közvetlen fragmentációján alapultak, nem hasznosították a kromatográfiás elválasztás elınyeit. A kutatások fı célja oligoszacharidok tagszámának meghatározása, a kérdéses szacharid molekulatömegének megállapítása, a glikozidos kötés helyének megállapítása volt. Napjaink kutatásainak fı célja (4. Táblázat), hogy a szacharidokat TMS- [84-86], TMS-oxim [1-9,87-26] és permetilezett [94-96] származékokként különbözı mátrixokban meghatározzák. A dolgozatokban a fragmentációt kvantitatív célokra csak korlátozottan használták [84,9,88,90], s nem hívták fel a figyelmet a glikozidkötéső, nem redukáló szacharidok TMS-származékainak, s a redukálók TMS-oxim-származékainak eltérı viselkedésére. 20

21 4. Táblázat Legújabb kutatási eredmények a diszacharidok GC-MS elemzésében Mátrix Származékképzés Elválasztás Det Alma, ıszibarack, körte, édesburgonya Streptococcus pneumoniae poliszacharidok Környezeti minták (talaj, üledék) Modellvegyületek, méz, gombapoliszacharidok, kajszibarack, Mesterséges táplálék Modell diszacharidok, méz Festıbuzér, grépfrút, citrom, narancs Szılılé - 0,5mL NH 2 OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75 o C, 30min - 0,5mL BSTFA(1% TMCS): 75 o C, 20min permetilezés, 0,2mL Trisil reagens: 80 o C, 20min 20-25µL BSTFA (1%TMCS) + 10µL piridin 70 o C, 3h - 0,5mL NH 2 OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 70 o C, 30min - 0,9mL HMDS + 0,1mL TFA 100 o C,60min - 0,35mL NH 2 OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75 o C, 30min - 0,35mL HMDS + 35µL TFA: 45 o C,30min - 0,35mL NH 2 OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75 o C, 30min - 0,35mL HMDS + 35µL TFA: 45 o C,30min - 0,5mL NH 2 OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 70 o C, 30min - 0,9mL HMDS + 0,1mL TFA 100 o C,60min 10 µl vizes minta + 0,7mL DMSO + NaOH keverés (szobahım.) + MeI keverés (10min) extr.: CH 2 Cl 2 kol: 15m 0,25mm DB1; hım.pr.: 150 o C (4min) o C (4 o C/min) 192 o C (0,5min) o C (10 o C/min) 240 o C (7min) kol: 30m 0,25mm HP-5; hım.pr.: 50 o C (2min) o C (30 o C/min) o C (3 o C/min) o C (30 o C/min) 300 o C (10min) kol: 30m 0,25mm DB5-MS; hım.pr.: 65 o C (2min) o C (6 o C/min) 300 o C (15min) kol: 30m 0,25mm DB-5; hım.pr.: 60 o C (2min) o C (20 o C/min) o C (6 o C/min) 155 o C (10min) o C (13 o C/min) 250 o C (12min) o C (20 o C/min) 330 o C (10min) kol: 25m 0,25mm OV-101; hım.pr.: o C (2 o C/min) 280 o C (1min) o C (10 o C/min) 290 o C (15min) kol: 30m 0,25mm SPB-1 / 25m 0,25mm Rtx-65TG; hım.pr.: o C (1min) o C (70 o C/min) 170 o C (10min) o C (15 o C/min) o C (2 o C/min) 280 o C (20min) o C (10min) o C (15 o C/min) o C (1 o C/min) o C (5 o C/min) 320 o C (20min) kol: 30m 0,25mm DB-5; hım.pr.: 150 o C (4,5min) o C (10 o C/min) 330 o C (7min) kol: 30m 0,25mm DB-5; hım.pr.: 100 o C (2min) o C (3 o C/min) o C (10 o C/min) 240 o C (10min) Jelölések, mint az 1-3. Táblázatban, továbbá: NH 2 OH.HCl = hidroxilamin-hidroklorid, MeI = metil-jodid, TFA = triflourecetsav MS MS MS MS FID Azonosított vegyületek nem illékony savak, cukrok monoszacharidok mono-, anhidro-, di-, triszacharidok, cukoralkoholok mono-, di-, triszacharidok alifás és aromás karbonsavak, aminosavak mono- és diszacharidok Ref [84] [85, 94,95] [86] [1-9] [87] MS diszacharidok [88-91] MS MS mono-, di-, triszacharidok, alifás és aromás karbonsavak, aminosavak, antrakinonok, flavonoidok mono- és diszacharidok [92,93] [96] 21

22 3.4. Az általunk vizsgált természetes mátrixok elemzési lehetıségei Citrus-gyümölcsök A citrusok elemzésében a gázkromatográfia alkalmazása korlátozott: az illékony összetevıket [97-108] szilárd-fázisú-mikroectrakciót (SPME) követıen [97-100], préselt lébıl [97-99] és narancs-párlatból [100], származékkészítés nélkül mérték. Az illékony illatanyagokat a gyümölcs-levekbıl ioncsere-kromatográfia [101] segítségével, dietiléter/npentán=2/1 elegyével [102], vagy speciális elpárologtatási technikával [103] vonták ki. Az illékony citrus-olaj összetevıket gızdesztillátumokban [104,105], és közvetlenül injektált [ ] mintákban mérték. A narancs és grépfrút keserő olajának nem illékony összetevıit, szintén közvetlen injektálásokból azonosították [109]. Említésre méltó, hogy választott gyümölcsök és zöldségek összes fenol- és flavonoidtartalmának [110], vagy a különbözı citrus-feldolgozási módszerek melléktermékeinek meghatározását, még 2007-ben is, különféle nem-szelektív módszerekkel végezték [111] Sárkányfő-fajok A Dracocephalum növényfaj (Laminaceae család, Nepetoideae alcsalád) egyedei antioxidáns [112] és antimutagén [22] tulajdonságú, jótékony hatású összetevıket tartalmaznak. A Dracocephalum kotschyi (kivonata) immunomoduláns [113] és antihiperlipidémikus [114] hatását említik. A jótékony hatású összetevıikként elsısorban, az esszenciális olaj-tartalmukat tanulmányozták [ ]. Napjainkban figyelmet szenteltek a nem illékony szerves összetevık minıségi-mennyiségi elemzésére, mint terpén-típusú-glikozidok [ ], flavonoidok, és fenolsavak [ ], melyeket a teljes növényekbıl, vagy a növények egyes részeibıl vontak ki. Az esszenciális-olaj tartalmat GC-MS [115,116], GC-FID és HPLC-MS és klasszikus módszerekkel [119] vizsgálták. Különbözı kivonatok flavonoid és fenolsav tartalmának minıségi/mennyiségi meghatározására HPLC-UV [124], HPLC-DAD [118,127,129,130] módszert és 1 H és 13 C NMR spektroszkópiát [125,126,128] alkalmaztak. Az azonos virágzati jellegzetességek [132], 22

23 a fenolos összetevık [133] és elektron-spin-rezonancia spektroszkópiai mérések [133] taxonómiai kutatások alapjául szolgáltak, melyek a Laminaceae család tagjai közti filogenetikai kapcsolatot állapítottak meg. A kémiai összetétel-kutatások fıként a minıségi meghatározásra korlátozódtak Festıbuzér A festıbuzér antrakinonjainak meghatározása során, leggyakrabban nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert alkalmaztak fordított fázisú oszlopon történı elválasztással (RP-HPLC) [ ]. A többi esetben az antrakinonok összmennyiségét spektrofotometriás [142,143], és vékonyréteg-kromatográfiás [144] módszerrel határozták meg. Az antrakinonok mennyiségének meghatározása többféleképpen történt. Egyes esetekben az alizarinra viszonyított összes antrakinon-tartalmat mérték [134,142,143,], vagy HPLC elválasztás után spektrofotométeriásan azonosították az antrakinonokat [135,137,139,141, 145]. A gyökérminták összetételére kapott eredmények összehasonlításakor látható, hogy ugyanannak az antrakinon-származéknak a mennyisége az egyes forrásmunkák között nagy eltéréseket mutat. A lucidin és az alizarin koncentrációjára eltétı adatok találhatók: 0,002 0,09 mg/g és 1,5 1,7 mg/g [137], és 6,3 mg/g és 70,6 mg/g [145]. A nagy eltérések feltehetıen a mérési módszerek különbözıségére vezethetık vissza Meggyek és ber gyümölcs A meggy gyümölcs (Prunus cerasus) és az indiai ber (Zizyphus mauritiana) esetében egyaránt, a cukor-, cukor-alkohol-, karbonsav-, aminosav-összetételére vonatkozóan irodalmi adat nem állt rendelkezésre. Néhány esetben [ ] tanulmányozták a Zizyphus xylopyrus-ban található triterpenoidokat [146], a Zizyphus mauritiana-ban a lektineket [147], és a ciklopeptid típusú alkaloidokat [148], továbbá vizsgálták a Zizyphus jujuba flavonoidjait [ ], nem-édes összetevıit [152], lipid-frakciójának zsírsav-összetételét [153], és sokirányú felhasználhatóságát [154, 155]. A meggy szacharid- és polialkohol-tartalmára vonatkozó mérések eredményei [156] a gyümölcs 80% etilalkohollal készült kivonatának HPLC elemzésébıl származnak. A gyümölcsben oldott anyagok összegét refraktometriásan [157,158], összes savtartalmát 23

24 titrálással, aroma-összetevıit a dietiléter/pentánnal (2/1, v/v) nyert extraktumokban GC-MS eljárással mérték [158]. A teljes, és hámozott meggy karotin-tartalmát friss állapotban és fagyasztva tárolás után, hosszadalmas extrakció utáni oszlopkromatográfiás tisztítást követıen, spektrofotometriásan határozták meg [159]. Az igen kis mennyiségő melatonint, mint értékes antioxidánst, a Montmorency és Balaton fajtákban, munkaigényes, hosszantartó elválasztások után, HPLC módszerrel azonosították és mérték [160]. A legfrissebb irodalomban található, meggyre vonatkozó munkák túlnyomó többsége azok flavonoid-tartalmával kapcsolatos kutatásokra vonatkozik [22, ]. E kutatások idıszerősége a flavonoidok, mint vegyületcsoport felbecsülhetetlen értékő élettani és gyakorlati jellemzıinek köszönhetı [22,161,167,168]. A meggyben található flavonoidokról igazolták, hogy mint antioxidáns tulajdonságú polifenolok, az élı szervezetben rendkívül gyorsan hasznosulnak [161]. Fentiekbıl következik, hogy a meggyfajták flavonoidjainak minısége és mennyisége, a korszerő kromatográfiás módszerek felhasználásával széleskörően kutatott [ ]. Viszonylag nagy tömegő molekulákról lévén szó, az elemzések zöme származékkészítés nélküli, HPLC módszer [ ]: UV [ ], NMR [166,167] és MS/gyorsatombombázásos (FAB) [163] detektálásokkal. Kivétel, amikor a flavonoidok, és ezek bomlástermékeinek elemzése szililszármazékokként, GC-MS eljárással történt [172], valamint amikor a flavonoidok szacharid-összetevıit a hidrolizátumaikban szililszármazékokként, GC- FID módszerrel azonosították [167]. A meggyben lévı flavonoidok stabilitását csökkenı színük alapján spektrofotometriásan, összegük mérésével [ ], illetıleg trisztimulusz koloriméter alkalmazásával követték [176]. A különbözı természetes mátrixok (citrusfélék, sárkányfő, festıbuzér, meggy, ber) összetevıinek elemzésével foglalkozó dolgozatok [97-176] áttekintése után kitőnt, hogy - a fenolok/flavonoidok/antrakinonok biológiailag aktív, értékes összetevık, s - az alkalmazott analitikai módszereket kivétel nélkül, idı- és munkaigényes elıkészítı elválasztások/dúsítások, elızték meg. Így egy közvetlen módszer, mely a flavonoidok, antrakinonok, fenolsavak, karbonsavak, aminosavak, szacharidok szelektív, mennyiségi meghatározását egyidejőleg, egyetlen injektálásból lehetıvé teszi, kétségtelenül fontos technika lehet. 24

25 4. Kísérleti rész 4.1. Kémszerek A felhasznált anyagok és reagensek mindegyike analitikai tisztaságú volt. A Reanaltól (Budapest, Magyarország) vásároltuk a piridint, a hidroxilaminhidrokloridot, a metanolt, az acetonitrilt, az etil-acetátot, az ammónium-acetátot, a benzolt, a glükózt, a fruktózt, a szacharózt, a maltózt, a benzoesavat, az alizarint és az antrakinont. A Sigmától (St. Louis, MO, USA) szereztük be a hexametil-diszilazánt (HMDS), az N,O-bisz(trimetilszilil)trifluoracetamidot (BSTFA), az N-tert.-butil-dimetilszilil-N-metiltrifluoracetamidot (MTBSTFA), a trifluor-ecetsavat, a karbonsavakat, a szacharidokat, a flavonoidokat (naringin, naringenin, heszperidin, heszperetin, rutin, kvercetin). A Roth-tól (Carl Roth GmbH & Co. KG, Németország) vásároltuk az antocianineket: a cianin-kloridot, a cianidin-kloridot, a pelargonidin-kloridot és a malvidin-kloridot. Az ICN-tıl (Aurora, OH, USA) az antrakinonok közül a purpurint és a kinizarint vásároltuk. A többi antrakinon származékot (lucidin-ω-metil-éter, alizarin-2-metil-éter, lucidin-ω-etil-éter, munjistin-etil-észter, pszeudopurpurin és nordamnakantál) a kivonatokban azonosítottuk Minták A citrus-minták: A grépfrútot (Citrus paradisi L.), a citromot (Citrus limon L.), a spanyol és görög narancsot (Citrus aurantium L.) piacon vásároltuk. A sárkányfő-minták: A növények Marosvásárhelyrıl (Erdély, Románia) származnak, augusztusában (Dracocephalum moldavica L.) és június - júliusában (Dracocephalum ruyschiana L.) teljes virágzáskor győjtötték. A virágot (csésze- és sziromlevelek) és szárat levegın szárított sárkányfő gyógynövénybıl különítették el. A festıbuzér minták: A festıbuzér (Rubia tinctorum L.) gyökér és gyöktörzs mintákat az ELTE Botanikus kertjében júniusában győjtöttük. 25

26 A meggyminták: A hazai meggyminták (Prunus cerasus L.) Érdi bıtermı (E), Pándy (P) és Kántorjánosi (K) felirattal, frissen szedve, közvetlenül az Érd Elviramajori Gyümölcskutató Intézetbıl, eltérı idıben (E0: ; P0: ; K0: ), illetıleg, a Központi Élelmiszeripari Kutatóintézetben +4-6 o C hıfokon különbözı ideig vezetett tárolások után (I. kitárolás, E1: ; P1: ; K1: ) érkeztek. A és évi mintákat az évjárat feltüntetésével jelezzük. A ber-minták: A ber-minták (Zizyphus mauritiana L.) Umran és Reshmi Indiából (2002.) származtak, zöld (éretlen) és sárga (szobahımérsékleten 3 napig érlelt) állapotban érkeztek Eszközök A minták vízmentesítése Büchi Rotavapor (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Schweiz) készüléken, a származékkészítés termosztálható, a kémcsövekkel egyezı mérető fémbetéteket tartalmazó melegítıblokkokban (Kutesz, Magyarország) történt. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia diódasoros detektálással (HPLC-DAD): A méréseket Agilent 1100 típusú HPLC-DAD/1946A típusú készüléken végeztük. DAD paraméterek: spektrum on-line ( nm). Kromatográfiás oszlop: mm MOS Hypersil BDS C18 5 µm RP (Shandon Southern Products, Runcorn, UK). Injektált mennyiség: 20 µl. Grádiens elúció: A eluens: acetonitril/0,02 M ammónium-acetát (ph=4) = 15/85 (v/v); B eluens: acetonitril/0,02m ammónium-acetát (ph=4) = 85/15 (v/v). Lineáris gradienssel, 10% B 90% B 40 perc alatt. Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Az antrakinonok mennyiségét λ=254 nm-en mértük. Gázkromatográfia-tömegspetrometria (GC-MS): A méréseket a SATURN II GC-MS jelő, Varian gyártmányú (Walnut Creek, USA) készüléken végeztük, amely ioncsapda rendszerő tömegszelektív detektorral, Varian 8200 automata mintaadagolóval és főthetı injektorral rendelkezik. Az elválasztásokat SGE BPX5 (30 m 0,25 mm, 0,25 µm filmvastagságú) kolonnán végeztük. A vivıgáz hélium volt (1,5 ml/perc). A transfer line hıfoka 280 o C volt. A GC paraméterei (az injektor és a kolonna főtési programja) az 5. Táblázatban láthatók. 26