DNS klónozása DNS klóntárak előállítása és szűrése Lontay Beáta 2016. Klónozás: A genetikai információt az egyik élőlényből (állat, növény, mikroorganizmus) mesterségesen visszük át egy másik organizmusba. angol megfelelője: genetic engineering A klón és a klónozás Genomklónozás: A genom klón csupa azonos genommal rendelkező egyedből áll embriódarabolás maganyag átvitel A DNS vagy génklónozás: egyetlen gén élőlény által több példányban való előállítását jelenti 1
Az embrió fejlődése embriódarabolás: 2 4 felé vághatók egyszerű (de korlátozott számú) valódi klónok, teljesen identikusak Típusai: Nukleáris transzfer (maganyag átvitel) Sejtmagtól megfosztott petesejtbe idegen sejtmagot ültetnek, sejtmag újraprogramozódik hatásfok 1 2% embrionális és újszülöttkori halálozás nő (large offspring syndrome) 1. Trophoblast sejtből petesejtbe 2. Szomatikus sejtből petesejtbe Wilmut 1996 (Dolly), 2
DNS vagy génklónozás In vivo technika, amellyel egy adott DNS fragmentum nagy mennyiségben előállítható. A DNS klónozás fő lépései 1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása 2. A megfelelő vektor kiválasztása 3. Rekombináns vektor konstrukciója 4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása 5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése 6. A rekombináns izolálása és jellemzése A klónozás minden egyes lépése több alternatíva közötti választást jelent, a klónozási stratégiánk ezen alternatívák célszerű kombinációját jelenti. 1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása Genomi DNS DNS, gén forrása: mrns Előnye: Intron nélküli gyakran csak 1 gén Reverz transzkriptázzal Szaporítás PCR rel, lásd később.. 3
2. A megfelelő vektor kiválasztása Klónozó vektor: olyan DNS molekula, amelybe idegen DNS fragmentum (inzert) építhető be. A vektor molekuláris szállítóként működik, a DNS inzertet gazdasejtbe juttatja, ahol az a replikáció révén szaporodik. Rekombináns vektor: idegen DNS inzertet tartalmazó vektor DNS. A vektor és az inzert kovalensen összekapcsolva. Vektorok alapvető komponensei Replikációs origó: A vektor önálló replikációját teszi lehetővé, a genomi DNStől függetlenül (plazmid, cosmid) vagy a genomival együtt (mesterséges kromoszóma) Szelekciós marker: pl antibiotikum rezisztenciáért felelős gén vagy sérült anyagcsereutak esetén a hiányzó fehérje biztosítása pl.: triptofán auxotróf élesztő képessé tétele triptofán bioszintézisre Többszörös klónozó hely: Számos restrikciós enzim hasítási helyét tartalmazza 4
Egy mesterséges plazmid általános szerkezete Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított plazmid létezik. Vektorok A plazmid vektor max 4000 bp túl kicsi inzert és transzformálás Bakteriofág vector: 20 kb fág infekció Kozmid: plazmid és bakteriofág l tulajdonságainak ötvözése : 40 45 kb inzert, fág infekció, de plazmid típusú szaporodás BAC: bacterial artificial chromosome: 100 300 kb inzert YAC: yeast artificial chromosome (0, 1,2 Mb) A nagy inzerteket tartalmazó könyvtár nem stabil: rekombináció/deléció 5
Vectorok Plazmid Bakteriofágok, vírusok Inzert: max 10 kb Cosmid Inzert: max 20 kb Mesterséges kromoszóma Inzert: max 50 kb Inzert: 200 1000 kb Plazmidok A baktériumok citoplazmájában természetesen előfordulnak Kettős szálú, kis méretű (1 20 kb) gyűrűs DNS molekulák Önálló replikációra képesek. Ált. különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak (pl. antibiotikum rezisztenica) Kicsi vagy nagy kópiaszám (néhánytól több százig) A baktériumok egymás között plazmidokat cserélhetnek: Konjugáció 6
Bakteriofágok Vírusfertőzés a baktériumokon Csak genomjukat juttatják a gazdasejtbe Baktérium specificitás Litikus ciklus (fágok összeszerelése, kijutása) Lizogenikus ciklus (beépül a genomba) Bakteriofág lítikus és lizogén infekciós ciklusa Figure 2.19 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 14 7
Bakteriofág Lambda vektorok Lizogén szaporodás: a fág DNS beépül a baktériumkromoszóma egy adott pontjára és a fág DNS a baktérium DNS sel egyidőben, annak részeként replikálódik vagy a kromoszómától függetlenül, a plazmidokhoz hasonlóan replikálódik és így alakít ki lizogén állapotot. Lítikus fágszaporodáskor a fágfertőzés után a fág DNS replikálódik a gazda kromoszómától függetlenül, szintetizálódnak előbb a korai majd a késői fágfehérjék és az elkészült fágrészecskék, általában a baktériumsejt lízise útján, kiszabadulnak a 15 baktériumból. Ezt követően ismételten fetőznek. Klónozás inzerciós vektorral Figure 2.21 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 16 8
DNS fragmentjeinek fág vektorba történő klónozása 17 Kozmid vektor A plazmidok és lambda fág genetikai elemeinek és ezzel tulajdonságainak kombinációjával fejlesztették ki Mint fágok juttathatók be a sejtbe, de ott mint plazmidok replikálódnak. A lambda alapú vektorok nagy előnye, hogy velük viszonylag nagyobb DNS darabok rendkívül hatékonyan sejtbe juttathatók. Lambda alapú vektorokba és cosmidokba épített DNS sejtbe juttatásához a DNS t kémcsőben fág fehérjékbe csomagolják in vitro pakolás és a természetes fágfertőzésnek megfelelően juttatják a sejtekbe. 18 Figure 2.23 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 9
Élesztő mesterséges kromoszóma, YAC Figure 2.25a Genomes 3 ( Garland Science 2007) 19 Figure 2.25b Genomes 3 ( Garland Science 2007) 20 10
Vectorok I. Vektor Gazda Jellemzők Inzert mérete Plazmid Baktérium, élesztő Kisméretű, gyűrűsdns max~10 kb Bakteriofág lambda vagy fág lambda baktérium Lineáris virális DNS max ~20 kb Kozmid baktérium Plasmid és fág hibridje max ~50 kb Élesztő mesterséges kromoszóma, YAC élesztő Élesztő centromert, telomert és replikációs origót tartalmazó DNS ~200 ~1000 kb 21 3. Rekombináns vektor konstrukciója Az idegen DNS t (inzertet), restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd az ugyanezen restrikciós enzimmel linearizált vektor kompatibilis végződéseivel ligáljuk. 22 11
Azonos restrikciós enzimmel létrehozott DNS fragmentumok ligálása A A A A vektor a ligálás lehetséges termékei A A A A Rekombináns Nincs inzert, Inzert Nincs ligálás önligálódás fragmentumok 23 4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása Mesterségesen Mikroinjekciózás Génpuska Természetes(hez közelítő) módon transzformáció elektroporáció fágfertőzés, vírusfertőzés 12
Mikroinjekciózás munkaigényes, drága, lassú, random integráció a genomba (kiküszöbölés: minigénkonstrukciókkal) Fehérjeexpresszió alacsony fokú Génpuska A DNS t mikrométeres átmérőjű arany vagy wolfram szemcsékre kötik, majd nagy nyomású nitrogén vagy hélium gáz segítségével egy csőben felgyorsítják, amit egy vákum kamrába vezetnek. A felgyorsított szemcséket egy stoplemez lelassítja, majd azok szétszóródva becsapódnak az előkészített szövetek sejtjeibe. A DNS elméletileg minden élő szövetbe, sejtbe bejuttatható. A gén bejutásának hatékonysága kicsi: 3 5%. Belövést követően a gén beépülése nem szabályozható. Főleg egyszikűeknél terjedt el. Transzformálás I. (baktériumok, élesztők, növények esetén alkalmazható) Baktérimok példáján bemutatva: AzE. coli baktérium klónozásra igen alkalmas, mert: optimális körülmények között 22 percenként duplázódik. jól ismert genetikai környezetet nyújt. az idegen DNS tsajátjának tekinti 26 13
Transzformálás II. 1. Lépés A baktérium sejtek kompetenssé (transzformálásra alkalmassá) tétele: például sókezeléssel (CaCl 2 ) 2. Lépés Maga a transzformálás: A rekombináns plazmid és a kompetens sejtek elegyének alacsonymagas alacsony (4 42 4C) hőmérsékleten történő inkubálása. (A baktériumok, nem ismert módon, felveszik a plazmidot Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007) A transzformálás lépései Jeges vízben inkubáljuk a kompetens E. coli és a ligált DNS (vektor és inzert) elegyét. Hősokk 42 o C on. A baktériumot gazdag, folyékony táptalajban tenyésztjük. Szilárd táptalajra szélesztünk. Jeges vízben lehűtjük az elegyet. 14
Elektroporáció Lényegileg a transzformációnak egy változata. A baktériumokat egy elektromos sokkal (2,5 kv, 200 ohm) teszik a DNS felvételre képessé. A felvétel pontos mechanizmusa nem ismert. Elektroporációval egy két nagyságrenddel jobb a DNS bejuttatásának hatékonysága. Legfontosabb vektorok Bejuttatási módszerek Prokarióták plazmid, bakteriofág, cosmid, bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC). transzformáció, elektroporáció, fágfertőzés Élesztő plazmidok, élesztő mesterséges kromoszóma (YAC) transzformáció Növényi sejtek plazmid, vírus transzformáció, fertőzés, génpuska Állati, (emlős) sejtek plazmid, DNS és RNS vírusok, mesterséges kromoszóma transzfekció, (kalcium foszfáttal, lipidekkel) vírus fertőzés, elektroporáció, mikroinjektálás 15
5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 ( Garland Science 2007) A transzformálás lehetséges eredményei Baktérium Genomi DNS Plazmid inzerttel Ampicillin rezisztens baktérium Plazmid inzert nélkül Ampicillin rezisztens baktérium Nincs plazmid Nincs ampicillin rezisztencia 32 16
A DNS klónozás fő lépései 1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása 2. A megfelelő vektor kiválasztása 3. Rekombináns vektor konstrukciója 4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása 5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése 6. A rekombináns izolálása és jellemzése 33 Felhasználás Genomot reprezentáló könyvtár készítése klónozott DNS fragmentum szekvenálása a szaporított DNS inzert felhasználása templátként vagy próbaként, fehérje termelés: kutatási céllal gyógyászati, élelmezési céllal 17
A rekombináns DNS terápiás felhasználási lehetőségei inzulin a cukorbetegek számára factor VIII a hemophilia A ban szenvedő férfiaknak factor IX a hemophilia B kezelésére human növekedési hormon (GH) erythropoietin (EPO) az anemia kezelésére Interferonok 3 típusa számos interleukin granulocyta makrophag kolónia stimuláló faktor (GM CSF) a csontvelő transzplantáció után a velő stimulálására szöveti plazminogén aktivátor (TPA) a vérrögök feloldására adenosine deaminase (ADA) a súlyos kombinált immundefektus (SCID) néhány típusának kezelésére angiostatin és endostatin a rákellenes gyógyszerek kísérleteihez mellékpajzsmirigy hormon (parathormon) leptin GMO bioreaktor állatok tiszta formában, aránylag magas (35 g/l) koncentrációban termeltethetők idegen fehérjék a tejben humán antitrombin III (ATIII) α1 antitripszin szöveti plazminogén aktivátor (tpa) α glukozidáz laktoferrin VIII. véralvadási faktor (hfviii) 18
Biosteel: pókháló fehérje 5 g/l protein (űrtechnikai és ipari alkalmazásra 105 J/kg szilárdságú, (hajlítószilárdsága 10 x erősebb az acélnál) Sebzárásra, vérzéscsillapításra is jó DNS klóntárak előállítása és szűrése 19
Mi a DNS könyvtár? Reprezentatív DNS fragmentumok önreplikációra képes vektorba klónozott gyűjteménye, amely megfelelő gazdasejtben szaporítható. Célja: izolálni/klónozni DNS géneket/ szekvenciákat 20
DNS könyvtárak típusai Genomi DNS könyvtár: DNS bank, ami egy specifikus sejt, élőlény, fajgenomját tartalmazza cdns könyvtár: cdns bank, ami egy specifikus sejt mrna állományát reprezentálja linker könyvtárak apcr on alapuló klónozásra Marathon könyvtár A genomi és cdns könyvtárak információ tartalma nem azonos 21
Genomi DNS könyvtár Exont, intront és a szabályozó szekvenciákat is tartalmaz Bármely (szomatikus) szövetből származó genomi DNS könyvtár azonos A kópiák között nincs mennyiségi különbség Humán genom project Egy emlős DNS könyvtár 1 millió bakteriofág vagy 500 ezer kozmid klónja Kereskedelmi forgalomban kapható könyvtárak Genomi DNS könyvtár tulajdonságai Fontos: valamennyi fragment jelen legyen azonos méretű fragmentek a restrikciós enzimmel emésztett genomi DNS méret szerinti frakcionálása Előnye: Egymást átfedő fragmenteket tartalmaz. Az egyik inzert DNS próbaként használható az könyvtárszűréshez Kódoló nem kódoló jelen van Nincs mennyiségbeli különbség a fragmentek számában Problémák: Teljes emésztés: túl kicsi fragmentek egymással ligálódhatnak Részleges emésztés: túl hosszú fragmentek: beépülnek a vektorba gátolva annak szaporodását Szomatikus mutációk 22
cdns könyvtárak Az RNS másolata Csak a kódoló szekvenciát tartalmazza Következtethető belőle a fehérje aminosav szekvenciája Általában 2 4 kb hosszú Az mrns relatív gyakoriságát adja meg (ami nagymértékben gyakori az ~10%) minél gyakoribb egy mrns, annál több klón A könyvtár mérete a transcriptek gyakoriságától függ A cdns könyvtár típusai Oligo dt primerrel Random primer hexamerrel Könyvtár a szűréshez hibridizációval Expressziós könyvtárak a kódoló régió kifejezése Substracted cdna kibraries: az indukált és nem inukált gének azonosítása 23
Reverse Transcriptase 1. RNS függő, DNS szintézis 2. RNS degradáció 3. DNS függő, DNS szintézis. Error Rate: 1 in 20,000 nucleotides. cdna 24
Különböző vektorokba klónozott humán genomi könyvtárak mérete Table 2.4 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 50 25
Könyvtárszűrés lépései A könyvtár ( rekombináns fággal fertőzőtt baktériumtenyészet) szélesztése szilárd hordozón Plakkok, tarfoltok alakulnak ki a baktérium szőnyegen Lenyomat készítése a felületről nitrocellulóz membránra A keresett klónt hibridizációval azonosítjuk Autoradiogram készítése A pozitív jelet adó plakk azonosítása 26
DNS könyvtárszűrés nagyszámú rekombináns klón közül egyetlen, aminket érdeklő klón kiválasztása. 53 27