7. A b-galaktozidáz indukciója Escherichia coliban

Átírás

1 7. A b-galaktozidáz INDUKCIÓJA ESCHERICHIA COLIBAN 7. A b-galaktozidáz indukciója Escherichia coliban dr. Bauer Pál 7.1. Az enzimindukció jelensége Az élõlények valamennyi génjének állandó és folyamatos átírása (transzkripciója), majd az így készített mrns-en a fehérjék szintézise rendkívül nagy energiafogyasztással járna. Azok az élõlények viszont, amelyek csak akkor készítenek el egy fehérjét, ha szükségük is van rá, sokkal gazdaságosabban hasznosítják a rendelkezésükre álló energiát. A gazdaságos energiafelhasználás több komponensû regulációs rendszeren keresztül valósul meg. A reguláció egyik, mind prokariotákban, mind eukariotákban elõforduló módja az enzimindukció es a represszió. Ezt a szabályozó mechanizmust elsõként Jacob és Monod a b-galaktozidáz indukciójának vizsgálata során mutatta ki. Ez az enzim a tápanyagként felvett laktózt hidrolizálja glukózra és galaktózra, és ez által biztosítja a baktérium szénhidrát tápanyagforrását. Viszont a laktóz nélküli táptalajon növekvõ baktérium nem szintetizál b-galaktozidázt. A DNS-nek a laktóz felhasználását irányító, funkcionálisan egységes szakaszát lac operonnak nevezzük. Az operonhoz tartozik a CAP-et és a DNS-függõ RNS-polimerázt kötõ promoter gén, az operátor gén, valamint a b-galaktozidázt, galaktozid permeázt, galaktozid transzacetilázt kódoló struktúrgének. Az operontól elkülönülten elhelyezkedõ regulátor génrõl folyamatosan mrns íródik át, ez biztosítja a represszor fehérje konstitutív szintézisét. A represszor az operátor génhez kötõdve megakadályozza a polimeráz kapcsolódását, így a struktúrgének transzkripcióját. Amikor laktózt adunk az energiaforrásként nem glukózt, hanem pl. glicerint tartalmazó táptalajhoz, a b-galaktozidáz (és a másik két enzim) szintje rendkívül gyorsan megemelkedik. Az indukált állapot addig tart, amíg laktóz, van a táptalajban Az indukció mechanizmusa 1. A laktóz a represszor fehérjéhez kötõdve annak konformációját megváltoztatja, aminek következtében a komplex leválik az operator génrõl, így lehetõvé válik a polimeráz kötõdése a promoterhez és az operátorhoz. 2. Megindul az mrns-ek transzkripciója. 3. A még szintetizálódó RNS 5 -terminálisán már megkezdõdik a fehérjék szintézise. Az induktív enzimszintézis három fázisának tagolódását mutatja az a megfigyelés, miszerint a mrns szintézis blokkolása után a fehérje szintézis a már korábban elkészült mrns-en 5-10 percig tovább folyik. 111

2 II. BIOORGANIKUS KÉMIAI GYAKORLATOK Az indukció kezdetén adott, mrns szintézis gátló rifampicin megakadályozza a mrns szintézisét és az enzimtermelést is. Az indukált enzimszintézist fehérjeszintézis gátlóval, pl. kloramfenikollal is meg lehet akadályozni. A kísérlet során megfigyelhetjük az indukció félidejében adott kloramfenikol, ill. rifampicin hatását az enzimindukcióra. Az indukció mértékét az inkubáció után a b-galaktozidáz aktivitás meghatározásával követjük nyomon A b-galaktozidáz-aktivitás meghatározásának elve A b-galaktozidáz (b-d-galaktozid galaktohidroláz, E.C ) a laktózmolekulát glukózra es galaktózra hasítja. laktóz + H 2 O glukóz + galaktóz Az enzim szintetikus szubsztrátokat is bont, így pl. az ortonitrofenil-b-d-galaktozidot galaktózra és színes orto-nitrofenolra hasitja. A keletkezett sárga orto-nitrofenol mennyisége spektrofotométerrel meghatározható. Az enzim indukcióját tehát a b-galaktozidáz aktivitásának merésével mutatjuk ki. A b-galaktozidáz indukcióját úgy a laktóz, mint egy másik galaktozidszármazék, az izopropil-b-tio-galaktozid (IPTG) képes kiváltani. Az IPTG viszont nem szubsztrátja a b-galaktozidáznak, így mennyisége az indukció során nem csökken Az enzim indukciójára és kimutatására használt oldatok 1. baktérium sejtszuszpenzió (kb / ml) 2. IPTG-oldat (0,5 mg/ml izopropil-b-tio-galaktozid) az induktor 3. toluol, a sejtpermeabilitás fokozására 4. ONPG-oldat (1 mg/ml orto-nitrofenil-b-d-galaktozid deszt. vízben oldva) a b-galaktozidáz szubsztrátja 5. 0,02 M foszfát-puffer, ph 7, M, Na-karbonát oldat 7. 0,5 mg/ml kloramfenikol 8. 2 mg/ml rifampicin 7.5. A gyakorlat kivitelezése Állítsuk össze az alábbi rendszereket: 112

3 7. A b-galaktozidáz INDUKCIÓJA ESCHERICHIA COLIBAN Anyagok / csõ baktériumszuszpenzió víz 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 klóramfenikol 0 perckor 0,1 rifampicin 0 perckor 0,1 0,1 IPTG induktor 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 klóramfenikol 15 perckor 0,1 rifampicin 15 perckor 0,1 inkubálás 37 C 0' 15' 30' 30' 30' 30' 30' 30' 30' Közvetlenül az inkubáció végén adjunk minden csõbe egy csepp (50 µl) toluolt és hûtsük a csöveket jeges vízben. A minták itt várják meg egymást. Feltárás: 15 percig 37 C-on, a vízfürdõben rázatva Enzimaktivitás-mérés Minden kémcsõbõl: toluolos baktériumszuszp. 0,1 ml foszfátpuffer ph 7,4 0,3 ml ONPG szubsztrát 0,1 ml Inkubálás 37 C-on 15 percig Na-karbonát-oldat 1,0 ml A leolvasás 420 nm-en 1-5-ig a 6-os csõvel szemben történik. Mivel a rifampicin maga is színes, a 7-8. rendszert a 9. csõvel, mint vakkal szemben mérjük. Mérési eredmények: Csõszám extrinkció 7.7. A mérési eredmények értékelése 1. A b-galaktozidáz indukálhatósága az enzimaktivitás alapján: az extinkció értékek összehasonlitása az 1.,2.,3. csõben. 2. Az indukció gátlása fehérje szintézis gátlással: a 4., 5. csõ a 3-hoz viszonyítva. 3. Az indukció gátlása mrns szintézis gátlással: 7., 8. csõ a 3-hoz viszonyítva. 4. A kétféle gátlás összehasonlítása: 5. és 8., ill. 4. es 7. csõ. Kérdések: 1. Minek a rövidítése a CAP? 2. Hogyan hat a CAP a lac operonra? 3. Miért nincs indukció glukóz táptalajon növesztett baktériumban? 4. Mi a jelentõsege a pozitív es negatív szabályozásnak? 113

4 II. BIOORGANIKUS KÉMIAI GYAKORLATOK 8. A pgl3-basic vektor restrikciós emésztése és gélelektroforézise dr. Keszler Gergely 8.1. Elméleti háttérismeretek Plazmidok, vektorok biotechnológiai jelentõsége: riporter gének, rekombináns fehérjék termelése Restrikciós endonukleázok mûködése A gélelektroforézis alapelvei 8.2. A kísérlethez elve A pgl3-basic vektor ( a génexpressziós vizsgálatok során gyakran használt luciferáz-riporterrendszer: A luciferáz gén elé 5 -irányban, az bázispárok területén, a feltüntetett restrikciós hasító helyeknek megfelelõen ( multiple cloning site vagy polylinker ) tetszõleges promoter-szekvencia klónozható, amelynek transzkripciós aktivitása a vektor eukarióta 114

5 A pgl3-basic VEKTOR RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉSE ÉS GÉLELEKTROFORÉZISE sejtekbe történõ transzfekciójával, majd a luciferáz-aktivitás meghatározásával mérhetõ. Az erõs poliadenilációs szignál ( bp.) a luciferáz-mrns stabilitását biztosítja; az f1 origin-régió a vektor baktériumokban történõ replikációját teszi lehetõvé, míg az Amp r gén az ampicillinnel szembeni rezisztenciáért (szelekció) felelõs b-laktamáz enzimet kódolja. A gyakorlat során egyrészt a plazmid egyszeres hasítása történik XbaI enzimmel (linearizálás), illetve az XbaI és NheI enzimekkel kettõs emésztést végzünk, ami a luciferáz-cdns plazmidból történõ kimetszését eredményezi. A kettõs emésztést az teszi lehetõvé, hogy a két enzim hõmérséklet-, ionerõsség- és ph-optimuma megegyezik. Mindkét restrikciós endonukleáz ragadós végeket hoz létre 5 -túlnyúlással, amelyek egymással komplementerek, azaz újra összeligálhatók: 5 -G^C TAGC-3 5 -T^C TAG A-3 3 -C GATC^G-5 3 -A GATC^T-5 (NheI) (XbaI) 8.3. A kísérlet leírása A restrikciós emésztéseket 20 ml-es végtérfogatban hajtjuk végre az alábbiak szerint Egyszeres emésztés (linearizálás) 2 ml pgl3-basic vektor (c = 0,1 mg/ml) 2 ml 10x tömény reakciópuffer (összetétele: 330 mm Tris-acetát ph 7,9; 100 mm magnézium-acetát, 660 mm kálium-acetát, 0,1 mg/ml BSA) 1 ml XbaI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 15 ml desztillált víz. A csoportok a vektor, a reakció puffer és a víz keverékét elõre elkészítve kapják (19 ml); az emésztést 1 ml enzim hozzáadásával kell elindítani Kettõs emésztés 2 ml pgl3-basic vektor 2 ml 10x tömény reakció puffer 1 ml NheI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 1 ml XbaI restrikciós endonukleáz (10 U/ml) 14 ml desztillált víz. A vektor, a közös reakció puffer és a víz keverékét elõre elkészítve kapják; az emésztés 1-1 ml NheI és XbaI enzim hozzáadásával indul. 115

6 II. BIOORGANIKUS KÉMIAI GYAKORLATOK A reakcióelegyeket 60 percig inkubáljuk 37 ºC-os vízfürdõben vagy termoblokkban, majd a DNS futtatása következik horizontális szubmerziós módszerrel, az elõre elkészített 1%-os agaróz géleken. A mintákhoz nagy sûrûségû mintapuffert adunk, amely a futtatás nyomon követése miatt kétféle festéket is tartalmaz (60% glicerin ph 7,6; 0,03% brómfenolkék, 0,03% xilén-cianol). Összehasonlításképpen hasítatlan vektort, a molekulatömeg hozzávetõleges megállapítása céljából pedig DNS-markert is futtatunk, amely 14 különbözõ molekulatömegû DNS-fragmentum keveréke (250 bp 10 kbp tartományban) A gél-elektroforetikus vizsgálat Egyszeresen, ill. kétszeresen emésztett minták: A ml reakcióelegyekhez 4-4 ml mintapuffert mérünk; emésztetlen DNS minta: 2 ml pgl3-basic vektor + 14 ml víz keverékéhez (elõre összemérve kapják) 4 ml mintapuffert pipettázunk. Az így elõkészített mintákból ml-t, a készen kapott GeneRuler DNS-markerbõl pedig 6 ml-t pipettázunk a gélzsebekbe. A futtatás 120 V konstans feszültség mellett minimum 45 percet vesz igénybe. Ügyeljünk a polaritásra, a DNS a pozitív pólus felé mozog! Idõnként ellenõrizzük a festékcsíkok helyzetét! A futtatás végeztével a gélt UV-lámpa segítségével átvilágítjuk. A gél GR Safe DNS-festéket tartalmaz, amely a futtatás során megfesti a DNS-sávokat. VIGYÁZAT!! A GR Safe a kettõs spirál bázisai közé interkalálódó festékanyag, ezáltal potenciálisan mutagén. A közismert etídium-bromidnál azonban jóval hidrofilebb molekula, ezért bõrön keresztül sokkal kevésbé szívódik fel. Ennek ellenére a gélt kizárólag gumikesztyûben szabad megfogni. Az UV-fény károsítja a szemet, ezért a lámpát csak akkor szabad bekapcsolni, ha a fényszûrõ plexilappal már leárnyékoltuk az átvilágítót. A gélt megtekintés után az erre a célra kijelölt edénybe dobjuk ki. Figyeljük meg, hogy az emésztetlen vektor (cirkuláris plazmid) szupertekercse gyorsabban fut, mint az egyszeresen emésztett (linearizált) DNS. Az emésztetlen vektor gyakran két sávot ad, közülük a lassabban futó, látszólag sokkal nagyobb molekulatömegû az egyik polinukleotid-láncban nicket tartalmazó, nem szupertekercselt forma. A marker segítségével becsüljük meg az emésztéssel kapott fragmentumok méreteit, és vessük össze a vektortérkép alapján elméletileg várható hasítási termékek hosszúságával! 116

7 A pgl3-basic VEKTOR RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉSE ÉS GÉLELEKTROFORÉZISE 117