BÁLINT András Beszámoló az AGRISAFE által támogatott tanulmányútról 2008 november 2009 február. 1. Az IPK bemutatása 2.

Átírás

1 BÁLINT András Beszámoló az AGRISAFE által támogatott tanulmányútról 2008 november 2009 február 1. Az IPK bemutatása 2. A TILLING módszer

2 Hol található az IPK? Gatersleben

3 Általános adatok az IPK-ról Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (1945) - 87 kutatóintézetből álló hálózat tagja (2006-), részben államilag finanszírozott és ellenőrzött - kb. 500 dolgozó - ca: 180 kutató m 2 laborhely m 2 üvegház - 90 ha terület : családbarát munkahely

4 Szervezeti felépítés Igazgató: Andreas Graner (2007-) IPK osztályok: - 1. Genebank Prof. A. Graner, 3 kutatási program, 8 kutatócsoport - 2. Cytogenetics and Genome analysis Prof. I. Schubert, 8 kutatócsoport - 3. Molecular Genetics Prof. T. Altman, 6 kutatócsoport - 4. Phisiology and Cell Biology Prof. N. von Wirén, 10 kutatócsoport 5. Administration and Central Services: 1. Personnel 2. Finances 3. Technology Transfer and Legal Matters 4. Materials, Management and General Services 5. Buildings and Equipments 6. Experimental Fields and Nurseries

5 A Genebank szervezeti felépítése Characterization and Documentation (A. Graner) 1. Genomediversity (Andreas Graner, Nils Stein, 29 fő) 2. Genbank Documentation (Helmut Knüpffer, 6 fő) 3. Plant Architecture (Thorsten Schnurbusch, 3 fő) Management and Evaluation (A. Börner) 4. Resources Genetics and Reproduction (Andreas Börner, 39 fő) 5. In vitro storage and cryopreservation (Joachim Keller, 9 fő) 6. Satellite Collections North (External Branch North) (Klaus J. Dehmer, 12 fő) Taxonomy and Evolution (F. Blattner) 7. Experimental Taxonomy (Frank Blattner, 13 fő) 8. Taxonomy of Plant Genetic Resources (F. Blattner 8 fő) Összesen: 119 fő dolgozik az osztályon

6 Genomediversity kutatócsoport Genomics Lab (Andreas Graner): genetikai diverzitás megőrzése és felhasználása Diversity Lab (Nils Stein): Triticeae genomok strukturális és funkcionális elemzése Nagyobb témák: - árpa fizikai térképezés, szekvenálás - Árpa TILLING (mutánsok segítségével génfunkciók vizsgálata) - Árpa genomdiverzitás feltárása, kiaknázása agronómiailag fontos jellegek térképezésére, ill. javítására (maláta minőség, abiotikus/biotikus stresszek, stb)

7 Az IPK madártávlatból

8 Ami különösen tetszett az IPK-ban 1. Szervezettség: mindenre kidolgozott protokollok vannak 2. Minőségbiztosítás: Quality Management: laborjegyzőkönyvek (blue book), kutatói munka Kutatócsoportok értékelése (7 évente, nemzetközi szakértők, without heads ) 3. Közösségi élet: klubok, tanfolyamok, szakkörök 4. Tudományos műhely: intenzív kommunikáció az egyes kutatócsoportok között: Institutstag Institute s Day, Vavilov seminar, Gatersleben lecture, Journal Club, Ph.D. konferencia, intézeti kiadványok (éves jelentés) 5. Tudományos eredmények népszerűsítése: Open Day, Tag der offener Tür nyílt napok

9 Targeting (Induced) Local Lesion IN Genomes Mit is jelent a TILLING? - Olyan genetikai technika, mely a tradicionális kémiai mutagenezis segítségével mutáns egyedek ezreit hozza létre, majd ezeket az egyedeket nagy áteresztőképességű technikák felhasználásával mutációk azonosítására használja fel Génfunkció vizsgálata - Adott egy azonosított gén, amelyről feltételezem, hogy egy adott fenotípus pl. szárazságtűrés kialakításában részt vesz hogyan tudom ezt igazolni? - 1. csendesítem a gént (kikapcsolom), - 2. transzformálom egy másik genotípusba/fajba (expresszáltatom/túlexpresszáltatom), vagy - 3. megváltoztatom (mutagenizálom) és megnézem, hogyan változik a fenotípus

10 Árpa TILLING az IPK-ban (Sven Gottwald, Ph.D.) TILLING populáció létrehozása - Barke sörárpa (ez az ún vadtípus) olyan jellegekben jó, ami érdekli a németeket - Magok mutagenizálása EMS-sel, felszaporítás - DNS izolálás a mutáns vonalakból (kb vonal!) - DNS Poolok létrehozása: 8 x Pool (Barke és 7 mutáns), így a vonalból 1430 DNS Mixem lesz csak ennyit kell megvizsgálnom Mutánsok azonosítása heteroduplex képződés felhasználásával: - 1. Az adott génszakaszt (pl bp) a génre specifikus primerekkel felszaporítom, úgy hogy heteroduplex képződjön - 2. CEL I (heteroduplexnél hasít) enzimmel kezelem a PCR terméket. Ha nincs heteroduplex (mutáció a vad típushoz képest), csak 1000 bp hosszú fragmentjeim lesznek, ha van, akkor rövidebbek is, de olyanok, amelyek együttes hossza 1000 bp (pl. 830 és 170) - 3. Azonosítom, hogy melyik mutáns vonal hordozz a mutációt, majd szekvenálással is megnézem, hogy pontosan hol van a mutáció. Tiszta mutáns vonalak előállítása - 1. Mivel a mutáns vonalak több pontmutációt is tartalmazhatnak, ezért visszakeresztezéssel (vadtípushoz) olyan vonalakat állítok elő, melyek csak az engem érdeklő génben különböznek a vadtípustól ez után jöhet a fenotipizálás

11 Feladatom az IPK-ban Olyan gén vizsgálata, mely agronómiai jellegeket és/vagy abiotikus stressztűrést befolyásol - Első jelölt: árpa: Yrg1 gén, yield related gene encoding protein (Törjék Ottó) EXON P1: P2: P3: 1856 P4: 1391 POtto: 489 INTRON P1: 167 P2: 415 P3: 160 P4: 113 POtto: Accession: EU333863, Yrg1 mrna, yield-related gene encoding protein, Hordeum vulgare, 1275 bp

12 Második jelölt: árpa Nud gén Mi is az a nud gén? - Nud: pelyvás és pelyvátlan (csupasz) karakter kialakításáért felelős (többek között) - ERF géncsaládba tartozó transzkripciós faktor, mely a lipid bioszintézisben játszik szerepet - Új gén, 2008-ban írták le (PNAS, 105: ), - Egyszerű a szerkezete: kb bp, 2 exonból és 1 intronból áll Miért nagyon izgalmas számunkra a nud gén (lókusz)..? szemtömeget is befolyásolja - Hatással van a sótűrésre (A. Weidner) - Befolyásolja az aratás előtti csírázást (preharvest-sprouting) (U. Lohwasser) - Hatással van az ozmotikus stressz és szárazságtűrésre is

13 Munka a Nud génnel Módszerbelövés - Szekvencia ismeretében több primerpár tervezése, megrendelése, tesztelése (PCR program belövése, termék ellenőrzése) - Működő primerpár kiválasztása (NudF1R1, termék 1036 bp), jelölt primerek rendelése TILLING munkafolyamat - 1. PCR reakció a mutáns pool-okat tartalmazó plate-tel - 2. PCR termék ellenőrzése agaróz gélen - 3. Emésztés CEL 1 enzimmel - 4. Kicsapás (az enzimes emésztés utáni tisztitási lépés) - 5. Denaturálást követő fragment analízis LICOR 4300 készülékkel - 6. Mutánsok azonosítása GelBuddy programmal - 7. Igazolás szekvenálással Eredmény mutáns vonalat teszteltem - 9 mutánst sikerült azonosítani

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32 Köszönöm a figyelmet!