Baktérium- és fággenetika

Átírás

1 Baktérium- és fággenetika

2 Baktériumok A prokarióták egysejtű organizmusok haploid, cirkuláris dsdns genom 70 S riboszóma plazmamembrán, citoplazma nincs mag, ER, Golgi, mitokondrium aszexuális szaporodás Szinte mindenütt előfordulnak: óceán, mélytengeri vulkánok, sarki jég, édesvíz, a földkéreg mélye, élő szervezetek, szerves anyag nagyobb biomassza, mint a növények vagy az állatok Az élőlényekkel együttélő baktériumok: szimbionták, kommenzálisok, mutualisták, paraziták probiotikus, patogén vagy opportunista size: μm range

3 Változó genomok Két E. coli törzs genomja akár %-kal különbözhet egymástól Ember bonobó/ csimpánz: 1-2 %, ember-egér: % különbség Prokariótákban új gének jelennek meg, anyagcsere utak vesznek el pár hét alatt Két, genetikailag nagyon különböző baktérium genomjában a gének %- ának homológja megtalálható! A faj fogalom, mint taxonomiai egység értelmezhetetlen

4 Változó genom, konzervált rdns OTU = operational taxonomic unit, a 16S rrna gén szekvenciáján alapuló rendszertani egység Vertikális és horizontális gén forgalom: DNS a környezetből, más sejtekből A szelekciós előnyt biztosító gének gyorsan elterjednek az adott élőhelyen a haszontalan gének gyorsan elvesznek Mindenféle baktériumra jellemző a géncsere: ez a képesség nagyon korán kialakult 1542 nucleotides

5 Az élet fája a 16S rrns szekvenciája alapján Még a kihalt fajok is beilleszthetők ebbe a rendszerbe A prokarióta Archeák egyértelműen elkülönülnek a Baktériumoktól (Woese) A feltételezett közös őshöz közelálló szervezetek magas hőmérsékletet kedvelnek Carl Woese

6 A prokarióta sejt: 0, 37 és 130 C fokon 130 C

7 Bacteria Color code: Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Cyanobacteria Spirochaetes Bacteroidetes Chlamydiae Chlorobi Acidobacteria Chloroflexi Aquificae Fusobacteria Planctomycetes Thermotogales Deinococcus-Thermus

8 Proteobacteria Color code: Enterobacteriales Alteromonadales Pseudomonadales Pasteurellales Xanthomonadales Thiotrichales Vibrionales Legionellales Oceanospirillales Chromatiales Aeromonadales sulfur-oxidizing symbionts Baumannia Carsonella Cardiobacteriales Methylococcales

9 Gének és géntérképek a Salmonella génjei A baktériumok cirkuláris, kétszálú DNS genommal rendelkeznek, haploidok A genomiális DNS-en kívül gyakran rendelkeznek szintén cirkuláris dsdns-ből álló extrakromoszómális plazmidokkal Évente 20 millióan fertőződnek meg és kb. 220 ezren bele is halnak a Salmonella typhi fertőzésbe. A S. typhi Ty2 genetikai térképén piros színnel jelölték a 356 életfontosságú gént; világos kékkel a többi gént (4162 gén) A Chlamidiák csak 400 génnel rendelkeznek

10 Baktériumok markerei Genetikai markerek baktériumokban: prototróf - "vad típusú" baktérium, minimál táptalajon nő, C, N-forrás, sók, víz. A minimális tápigény fajonként eltérő lehet (nitrogénkötés, fotoszintézis, aerob, anaerob, stb.) A kórokozó fajok általában igen igényesek. auxotróf - mutáns baktérium, melynek külön tápigénye van a vad típushoz képest. rezisztencia markerek antibiotikum rezisztencia környezeti tényezőkkel szembeni tolerancia: ozmózis, ph, nehézfém, UV, hő, detergensek, fág egyéb markerek: szín, motilitás, telepmorfológia

13 Baktériumok markerei látható markerek a vad vagy mutáns allélt hordozó egyed növekedésében nincs különbség, de az eltérő genotípusú baktérium kimutatható a többi között (festés) szelektálható markerek a vad vagy a mutáns allél előnyt vagy hátrányt jelent a baktériumnak, így megfelelő szelekciós körülményeket biztosítva ki lehet válogatni az egyik allélt tartalmazó baktériumokat permisszív és restriktív körülmények

14 Baktériumok markerei látható markerek a vad vagy mutáns allélt hordozó egyed növekedésében nincs különbség, de az eltérő genotípusú baktérium kimutatható a többi között (festés) szelektálható markerek a vad vagy a mutáns allél előnyt vagy hátrányt jelent a baktériumnak, így megfelelő szelekciós körülményeket biztosítva ki lehet válogatni az egyik allélt tartalmazó baktériumokat permisszív és restriktív körülmények

15 Baktériumok markerei látható markerek a vad vagy mutáns allélt hordozó egyed növekedésében nincs kölönbség, de az eltérő genotípusú baktérium kimutatható a többi között (pl. festés) szelektálható markerek a vad vagy a mutáns allél előnyt vagy hátrányt jelent a baktériumnak, így megfelelő szelekciós körülményeket biztosítva ki lehet válogatni az egyik allélt tartalmazó baktériumokat permisszív és restriktív körülmények

16 Bakteriális kolónia formák (Eshel Ben Jacob, Tel Aviv University)

17 Bakteriális kolónia formák (Eshel Ben Jacob, Tel Aviv University)

18 A genetikai transzformáció felfedezése A prokarióták ellentétben az ekariótákkal képesek a környezetükből örökítő anyagot felvenni és megváltoztatni saját genomjukat: alkalmazkodnak a környezethez Transzformáció felfedezése: Frederick Griffith, 1928, Streptococcus pneumoniae DNS az örökítőanyag: Oswald Avery, MacLeod és McCarty 1944 Streptococcus Ennek óriási jelentősége van a gyógyászatban: fertőzőképesség és antibiotikum rezisztencia terjedése

19 A bakteriális metagenom Az emberi szervezetben re becsülik a különféle baktérium OTU-k számát Egy átlagos baktérium kb. 4-5 ezer génnel rendelkezik ( ) Ezen az alapon a velünk élő baktériumok génjeinek száma (200 millió) tízezerszer több lenne, mint az emberi gének száma A valóságban ennél sokkal kevesebb génjük van (közös génkészlet) (a pozitív szelekciót biztosító gének gyorsan terjednek a populációban, a genetikailag távol eső sejtek között is) Az eltérő fajok hasonló anyagcseréjűvé válnak: ez a konvergens evolúció

20 Gének átvitele, mozgása A gének egy része véletlenszerűen kerül át horizontálisan egyik sejtből a másikba (pl. elpusztult sejt DNS-ét felveszi és integrálja egy másik sejt) Más gének helyzetüket változtatva, ill. megsokszorozódva javítják esélyeiket, hogy fennmaradjanak, más sejtekbe is átjussanak (transzpozonok, retrotranszpozonok = mobil genetikai elemek) Kialakultak olyan gének, amelyek a DNS horizontális átjutását elősegítő szerkezetek (szex pilusok) fehérjéit kódolják Gének csoportjai készen állnak arra, hogy a baktérium számára letális körülmények között önállósodjanak és biztosítsák saját fennmaradásukat (lizogén fágok) Még önzőbb gének a sejtet csak saját maguk szaporítására használják fel (baktérium vírusok = bakteriofágok)

21 Prokarióták közötti géncsere Transzformáció: (elpusztult sejtből származó) DNS felvétele Konjugáció: DNS átadása (élő sejtből élő sejtbe) Transzdukció: gének átvitele (fertőző ágensek révén)

22 Rekombináció auxotróf baktériumok között Lederberg és Tatum kísérlete: Külön egyik mutáns törzsből sem keletkeznek prototróf egyedek, csak az összekeverésük után. Genetikai információ átadás és utána rekombináció történt.

23 A konjugáció felfedezése Az U-cső kísérlet - Bernard Davis: nem oldható faktorok játszanak szerepet, fizikai érintkezés szükséges az A törzs és a B törzs között, hogy rekombináns utódok jöjjenek létre. William Hayes, 1953 Elvesztett konjugáló képességű mutánsok A transzfer nem nem kétirányú! "Szexuális" kölönbség van a törzsek között: A = donor törzs ("male"), a B = recipiens törzs ("female"). A fertilitási tulajdonság viszonylag nagy gyakorisággal elveszhet, függetlenül a baktérium egyéb tulajdonságaitól.

24 A konjugáció felfedezése A donor tulajdonságért az extra-kromoszómális DNS (F= fertility) plazmid felelős. Az F faktor jellemzői: A donor törzs pilusokkal rendelkezik. Az F-faktor egy kópiája jut át a recipiens sejtbe, az is F+ lesz. Az F faktor a kromoszómától függetlenül replikálódik Többféle plazmid van: fertilitás, F rezisztencia, R virulencia killer, (K vagy Col) degradatív

25 A Hfr konjugáció Luca Cavalli-Sforza: véletlenszerűen ezerszer több rekombináns, de alig van F faktor átadás A kísérletben alkalmazott donor törzs megtartotta ezt a tulajdonságát: Hfr törzs (high frequency recombination). Nagy számú Hfr törzset izoláltak és ez felgyorsította az E. coli genetikai térképének elkészítését.

26 A konjugáció során az egyes gének egymás után jutnak át a donorból a recipiensbe Genetikai térképezés A konjugációt megszakítva meghatározhatjuk a gének sorrendjét. A teljes genom kb. másfél óra alatt jut át

27 Különböző Hfr törzseket használva (két irányból) ellenőrizhetjük az eredményeket Genetikai térképezés

28 Genetikai térképezés Az F-plazmid több helyre is beépülhet. A kromoszóma transzfer során az integráció irányítottságától függően jutnak át az első kromoszómális markerek Utoljára az ún. fertilitási gének jutnak át, ezért ha a plazmid integrálódott a kromoszómába ennek az eseménynek nagyon kicsi az esélye, nagy valószínűséggel előbb megszakad a konjugáció. Az önálló replikonként jelen lévő F-plazmidnál a helyzet éppen fordított. A donor tulajdonság nagy gyakorisággal átjut, mert az origót és a fertilitási régiót nem választja el egy teljes kromoszóma. Baktériumok között a konjugáció a leggyakoribb módja a gének cseréjének

29 Fág genetika A bakteriofágokkal (fágokkal) a genetikai munka igen egyszerű, mégis alapvető fontosságú eredmények születtek az E. coli T2, T4 és λ (lambda) fágokkal történő kísérletekből. Egy fágrészecske fertőzése után néhány óra alatt sok ezernyi fág keletkezik. A kiszabaduló utódok megfertőzik a közeli baktériumokat és több cikluson keresztül így alakul ki a baktériumpázsiton az átlátszó "tarfolt" (plaque)

30 Fág genetika A legtöbb fág-génben létrehozott mutáció "letális. A fágok haploid genommal rendelkeznek, ezért ezek a mutációk csak akkor tarthatók fent, ha feltételesen letálisak: van olyan körülmény (hőmérséklet vagy baktériumgazda), amely a mutáció ellenére megengedi a mutáns fág szaporodását ("permisszív" körülmények). Jól használhatóak a hőérzékeny (ts = thermosensitive) mutációk, amely csak magasabb hőmérsékleten (37-42 C) eredményezik pl. egy életfontosságú fehérje instabilitását ("restriktív" hőmérséklet). 40 C 30 C

31 Lizogén- és lítikus fágfertőzés

32 Fágok által közvetített génátvitel: általános transzdukció A DNS darabjai gyakran kicserélődnek: ez a rekombináció Ha a bakteriális és a fág DNS darabjai cserélődnek, szaporodásképtelen fágok alakulnak ki, ezek átvihetnek bakteriális géneket más sejtekbe A transzdukció fág által közvetített géntranszfer baktériumokban. Ebben az esetben a donor baktérium az a törzs, amelyen a transzdukáló fágot elszaporítják, a recipiens baktérium pedig az, amelyiket az így létrehozott transzdukáló fágpopulációval fertőznek. A transzdukció felfedezése Lederberg és Zinder (1951) nevéhez fűződik. Ők fedezték fel a Salmonella P22 transzdukáló fágját.

33 Fágok által közvetített génátvitel: speciális transzdukció A speciális transzdukció esetén a transzdukáló fág csak néhány meghatározott kromoszómális marker átvitelére képes. A jelenséget a lambda fág E. coli rendszeren fedezték fel és tanulmányozták behatóbban. A lambda fág, mint temperált fág, profágként a baktérium kromoszóma speciális helyén (attb) képes integrálódni a genomba

34 Speciális transzdukció Hibás kivágódás esetén az attb régió közelében lévő gal gén részévé válhat a fággenomnak, de csak ezt a baktériumgént képes a fág a recipiensbe átjuttatni. Ez a transzdukáló fág szaporodásra képtelen, defektív fág, mivel elvesztett fág-géneket (ezek ottmaradtak a kivágódás helyén). Ez a fág csak akkor tud szaporodni, ha egy vad típusú, "helper fág" segít ebben, amely hordozza a defektív fág hiányzó génjeit.

35 A baktérium- és fág-genetika haszna A baktérium- és fággenetika fejlődése vezetett el a molekuláris klónozás technikájának kifejlődéséhez, a biotechnológiai ipar kialakulásához. Ma már akármelyik organizmus bármely génjének szekvenciája megismerhető. A különböző baktériumok génjeinek megismerése ma is fontos kutatási cél: a kórokozó-, szimbionta- vagy extrém körülmények között élő fajoknál szeretnénk azokat a géneket megismerni, amelyek a betegség okozásában vagy a különleges környezethez való alkalmazkodásban játszanak szerepet.

36 Patogenitási szigetek (Islands of pathogenicity PAI) Patogén baktériumok számos virulencia faktort termelnek, amelyek génjei patogenitási szigeteket alkotna A patogenitási szigeteket hordozhatják mobil genetikai elemek (transzpozonok, retrotranszpozonok) plazmidok bakteriofágok gazda kromoszóma

37 Baktériumok cirkuláris genom térképei A külső (piros) gyűrű: gének a DNS W szálán, Sárga gyűrű: gének a komplementer (C) szálon trns-ek (zöld nyilak), rrns-ek (rózsa, ill. narancs vonalak), GC/AT arány (barna vonal), G/C arány (sárga vonal) Átlós sárga vonal: replikációs origó és termináció

38 A Clostridium perfringens genomja erősen eltérő gén- orientációt és G/C arányt mutat E. coli: egyenletes gén-orientáció

39 A G/C arány általában kevéssé variál egy adott genomon belül A lokális variáció gyakran arra utal, hogy az illető darabot a baktérium nem túl régen szerezte be horizontális génávitel útján, vagy inszercióval Pl. a Corynebacterium glutamicum genomjának egy (7 óra körüli) darabja ismert, nagy inszerció

40 Kórokozók és az embercsoportok eredete Ladakh-i lakosokból származó 119 Helicobacter pylori izolátum rokonsági viszonyai az egyének származási viszonyait tükrözik

41 Taiwan A nyelvi rokonság és a bélbaktériumok genetikája hasonló migrációra utal a Sahul (Ausztrál-Ázsia) és a Csendes Óceán-i szigetvilág, kb éve történt benépesedésével kapcsolatban

42 Baktérium- és fág genetika A bakteriális genom nagyon változó, gének elveszhetnek, kicserélődhetnek A riboszómális gén szekvenciája alapján azonosíthatók a baktériumok A géncsere leggyakrabban konjugációval történik, F+ és Hfr törzsek A környezetből (elhalt sejtekből) felvett DNS integrálódhat: transzformáció Rekombináns, defektív fágok is átvihetnek géneket gazda sejtek között (specifikus és általános transzdukció, nagyon ritka jelenség) A velünk élő baktériumok túlnyomó többsége hasznos vagy közömbös. Igen kis hányad kórokozó: ezek speciális virulencia géneket hordoznak A virulencia faktorokat kódoló gének patogenitási szigeteken helyezkednek el Patogenitási szigetek előfordulhatnak mobilis genetikai elemeken (transzpozonok), plazmidokon, a bakteriofágok- vagy a gazda DNS-ében The list of genome-sequenced microorganisms: Ongoing microbial genome projects: