A CD alapjai. Fény: elektromágneses hullám, elektromos és mágneses tér időbeli és térbeli periodikus változása

Hasonló dokumentumok
Szerves oldott anyagok molekuláris spektroszkópiájának alapjai

Abszorpciós fotometria

Abszorpciós fotometria

Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól

Abszorpciós spektroszkópia

Abszorpció, emlékeztetõ

A fény tulajdonságai

Lumineszcencia. Lumineszcencia. mindenütt. Lumineszcencia mindenütt. Lumineszcencia mindenütt. Alapjai, tulajdonságai, mérése. Kellermayer Miklós

Műszeres analitika. Abrankó László. Molekulaspektroszkópia. Kémiai élelmiszervizsgálati módszerek csoportosítása

Tartalomjegyzék. Emlékeztetõ. Emlékeztetõ. Spektroszkópia. Fényelnyelés híg oldatokban A fény; Abszorpciós spektroszkópia

Tartalomjegyzék. Emlékeztetõ. Emlékeztetõ. Spektroszkópia. Fényelnyelés híg oldatokban 4/11/2016. A fény; Abszorpciós spektroszkópia

Infravörös, spektroszkópia

CD-spektroszkópia. Az ORD spektroskópia alapja

Név... intenzitás abszorbancia moláris extinkciós. A Wien-féle eltolódási törvény szerint az abszolút fekete test maximális emisszióképességéhez

Abszorpciós fotometria

Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai módszerek

Orvosi Biofizika I. 12. vizsgatétel. IsmétlésI. -Fény

OPTIKA. Fénykibocsátás mechanizmusa fényforrás típusok. Dr. Seres István

Abszorpciós spektrometria összefoglaló

Műszeres analitika II. (TKBE0532)

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Dr. JUVANCZ ZOLTÁN Óbudai Egyetem Dr. FENYVESI ÉVA CycloLab Kft

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Lumineszcencia spektroszkópia

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Síkban polarizált hullámok síkban polarizált lineárisan polarizált Síkban polarizált hullámok szuperpozíciója cirkulárisan polarizált

Az elektromágneses hullámok

Makromolekulák szerkezetvizsgálati módszerei: IR, CD

OPTIKA. Vozáry Eszter November

E (total) = E (translational) + E (rotation) + E (vibration) + E (electronic) + E (electronic

Optikai spektroszkópiai módszerek

Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

23. Indikátorok disszociációs állandójának meghatározása spektrofotometriásan

Optika Gröller BMF Kandó MTI

Fluoreszcencia spektroszkópia

Lumineszcencia. Lumineszcencia. Molekulaszerkezet. Atomszerkezet

Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hőmérséklet miatt világít!!! Ez az ún. hideg emisszió

Műszeres analitika II. (TKBE0532)

Bevezetés a fluoreszcenciába

ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával.

Fizikai kémia és radiokémia labor II, Laboratóriumi gyakorlat: Spektroszkópia mérés

UV-VIS spektrofotometriás tartomány. Analitikai célokra: nm

5. Az adszorpciós folyamat mennyiségi leírása a Langmuir-izoterma segítségével

Biofizika. Sugárzások. Csik Gabriella. Mi a biofizika tárgya? Mi a biofizika tárgya? Biológiai jelenségek fizikai leírása/értelmezése

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

A fény. Abszorpciós fotometria Fluoreszcencia spektroszkópia. A fény. A spektrumok megjelenési formái. A fény kettıs természete: Huber Tamás

Abszorpciós fotometria

Fluoreszcencia spektroszkópia

MedInProt Szinergia IV. program. Szerkezetvizsgáló módszer a rendezetlen fehérjék szerkezetének és kölcsönhatásainak jellemzésére

Infravörös és CD spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Modern Fizika Labor. 11. Spektroszkópia. Fizika BSc. A mérés dátuma: dec. 16. A mérés száma és címe: Értékelés: A beadás dátuma: dec. 21.

Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly

A fény mint elektromágneses hullám és mint fényrészecske

Az Ampère-Maxwell-féle gerjesztési törvény

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Optikai spektroszkópia az anyagtudományban 8. Raman spektroszkópia Anizotrópia IR és Raman spektrumokban

1. mérés: Benzolszármazékok UV spektrofotometriás vizsgálata

Lumineszcencia alapjelenségek

SPEKTROFOTOMETRIAI MÉRÉSEK

Hogyan bírhatjuk szóra a molekulákat, avagy mi is az a spektroszkópia?

Kristályok optikai tulajdonságai. Debrecen, december 06.

2. Szerves anyagok oldatának fotolumineszcencia színképének meghatározása

Az elektromágneses spektrum és a lézer

Fotoszintézis. fotoszintetikus pigmentek Fényszakasz - gránum/sztrómalamella. Sötétszakasz - sztróma

Fotokémiai alapfogalmak, a fotonok és a molekulák kölcsönhatása

Optika Gröller BMF Kandó MTI

19. Sav-bázis indikátorok disszociáció állandójának spektrofotometriás meghatározása. Előkészítő előadás

19. Sav-bázis indikátorok disszociáció állandójának spektrofotometriás meghatározása. Előkészítő előadás Módosított változat

Hemoglobin - myoglobin. Konzultációs e-tananyag Szikla Károly

Hullámmozgás. Mechanikai hullámok A hang és jellemzői A fény hullámtermészete

Elektromágneses sugárzások és biológiai rendszerek Ionizáló és nem-ionizáló sugárzások. Dr. Fidy Judit egyetemi tanár 2012 Febr.15

Szalay Péter (ELTE, Kémia Intézet) Szentjánosbogár, trópusi halak, sarki fény Mi a közös a természet fénytüneményeiben?

Visszaverődés. Optikai alapfogalmak. Az elektromágneses spektrum. Az anyag és a fény kölcsönhatása. n = c vákuum /c közeg

A fény keletkezése. Hőmérsékleti sugárzás. Hőmérsékleti sugárzás. Lumineszcencia. Lézer. Tapasztalat: a forró testek Hőmérsékleti sugárzás

Reakciókinetika és katalízis

Talián Csaba Gábor Biofizikai Intézet április 17.

Infravörös és CD spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában

Röntgensugárzás az orvostudományban. Röntgen kép és Komputer tomográf (CT)

Szentjánosbogár, trópusi halak, sarki fény Mi a közös a természet fénytüneményeiben?

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

A fény és az anyag kölcsönhatása

Molekulaspektroszkópiai módszerek UV-VIS; IR

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak

TÁVKÖZLÉSI ISMERETEK FÉNYVEZETŐS GYAKORLAT. Szakirodalomból szerkesztette: Varga József

2. ZH IV I.

Optika és Relativitáselmélet II. BsC fizikus hallgatóknak

Mézerek és lézerek. Berta Miklós SZE, Fizika és Kémia Tsz november 19.

13. Előadás. A Grid Source panelen a Polarization fül alatt megadhatjuk a. Rendre az alábbi lehetőségek közül választhatunk:

Elektromágneses sugárzások és biológiai rendszerek Ionizáló és nem-ionizáló sugárzások. Sugárzások és biológiai rendszerek

Tantárgy neve. Környezetfizika. Meghirdetés féléve 6 Kreditpont 2 Összóraszám (elm+gyak) 2+0

SPEKTROSZKÓPIA: Atomok, molekulák energiaállapotának megváltozásakor kibocsátott ill. elnyeld sugárzások vizsgálatával foglalkozik.

Gyors-kinetikai módszerek

Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? Komplex egyszerű S E J T

9 gyak. Acél mangán tartalmának meghatározása UV-látható spektrofotometriás módszerrel

Atomfizika. Fizika kurzus Dr. Seres István

Lumineszcencia Fényforrások

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Átírás:

Fehérje Analitika 2. Spektroszkópiás technikák MSC, 2011. tavaszi félév

CD Cirkuláris Dikroizmus spektroszkópia

A CD alapjai Fény: elektromágneses hullám, elektromos és mágneses tér időbeli és térbeli periodikus változása Síkban (lineárisan) polarizált fény: térerősség vektorok (elektromos és mágneses) mindig ugyanabba az irányba mutatnak. A lineárisan polarizált fény terjedési iránya és az elektromos vektornak erre merőleges iránya által meghatározott síkot nevezzük a polarizáció síkjának.

A CD alapjai Cirkulárisan polarizált fény: két egymásra merőleges síkban polározott fénysugár szuperpoziciója, 90 o fázis különbséggel. Szemléletesebben a cirkulárisan polarizált fény térerősség vektorai egy kör kerülete mentén forgó mozgást végeznek, közben viszont a fény halad előre: haladó csavarvonalat kapunk. (b) Jobbra cirkulárisan polarizált fény (c) Balra cirkulárisan polarizált fény

Cirkulárisan poláros hullám A CD alapjai abszorpciója közegben Cirkulárisan polarizált fény anyagon halad át intenzitása exponenciálisan csökken, de térerősség vektora ugyanabba a fázisban marad

A CD alapjai Ha egy jobbra és egy balra cirkulárisan poláros fényt adunk össze = síkban polározott fény (azonos amplitudó, azonos hullámhossz) Következteztetés: Minden lineárisan polarizált fény felbontható két, azonos amplitudojú jobbra ill. balra cirkulárisan polarizált fény összegére

A CD alapjai Vannak olyan anyagok, amelyek egy különleges tulajdonsággal rendelkeznek: eltérő mértékben nyelik el a jobbra, ill. balra cirkulárisan poláros fényt. Ezt a jelenséget nevezzük cirkuláris dikroizmusnak: A fény elliptikusan polarizáltá válik. A cirkuláris dikroizmust az anyag molekuláris szerkezetének aszimmetriája okozza

A CD alapjai Két cirkulárisan polarizált fénysugár különböző mértékben nyelődik el az optikailag aktív közegben, így azon áthaladva az amplitúdójuk is különbözni fog (cirkuláris dikroizmus jelensége), ami elliptikus polarizációhoz vezet. Az ellipszis alakját egyértelműen jellemezhetjük az ellipticitással: θ = arc tg(b/a) ahol a az ellipszis nagy, míg b a kis tengelye. A mintán áthaladó fény elnyelődésére érvényes a Lambert- Beer törvény. A balra és a jobbra cirkulárisan poláros fény abszorpciós koefficienseinek különbségét ( ε = ε bal ε jobb ) mérve a hullámhossz függvényében kapjuk az optikailag aktív mintára jellemző CD spektrumot.

A CD alapjai Azokat az anyagokat, amelyek a rajtuk átbocsátott fény polarizációs síkját elforgatják (optikai rotáció), vagy a síkban poláros fényt elliptikussá teszik, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. Biológiai makromolekulák oldatainak az optikai aktivitásából következtethetünk a molekulák szerkezeti jellemzőire: Másodlagos szerkezet!

A CD alapjai Az élő szervezetek által szintetizált molekulák döntő többsége, így a fehérjék is optikailag aktívak, azaz az oldatukon keresztülbocsátott polarizált fény síkját elforgatják. Ezen optikai forgatás mellett felléphet még az ellipticitás, a cirkuláris dikroizmus és a cirkuláris törésmutató különbség jelensége. Csak olyan hullámhosszúságú fénynél kaphatunk CD jelet, ahol a mintának van normál elnyelése. Fehérjék esetében ez a távoli UV tartomány (180-260 nm)

A CD alapjai Közeli UV (310-260nm) Fehérjék harmadlagos esetleg negyedleges szerkezete, kismolekulák ujjlenyomat szerű spektrum Távoli UV (260-180nm): fehérje másodlagos szerkezet

Közeli UV(260-310nm) CD: Harmadlagos Elnyelési sávok: szerkezet Tyr (275-282 nm),trp (290-305 nm),phe (255-270 nm)

Közeli UV(260-310nm) CD: Harmadlagos szerkezet M. Kelly, T. Jees and N. Price How to study proteins by circular dichroism. Biochimica et Biophysica Acta 1751, 119-139 (2005)

Távoli UV tartomány: Másodlagos szerkezet vizsgálata Másodlagos szerkezet vizsgálata: - Peptid váz: elnyelés 240 nm alatt - n p* átmenet 220 nm körül - n - n* átmenet 190 nm körül (intenzív) Fehérjék jellemző spektrumai: - Alfa-hélix: 2 negatív csúcs 208 és 222 nm-nél - Béta-redő: 1 negatív csúcs 218 nm-nél - Rendezetlen régió: 1 negatív csúcs 196 nmnél

CD spektrumok kiértékelése Neurális háló alapú predikciós szoftver (CDNN, K2D) Bázis függvények lineár kombinációja (CCA+) Referencia vegyületek alapján (SELCON, CDSSTR)

Távoli UV tartomány: Másodlagos szerkezet vizsgálata alfa-hélix Dekonvolúció: béta-redő

β- redő MAb távoli UV CD spektruma

Rendezetlen (random coil)

Fehérjék vizsgálata Cirkuláris Dikroizmus spektroszkópiával Fehérjék másodlagos szerkezetének meghatározása (háttérkorrekció, NN alapú dekonvolúciós szoftverek) Oldószer, puffer hatásának vizsgálata (ph, ionerősség, sók, adalékok preformulálás) Stabilitás vizsgálat Összehasonlító vizsgálatok Hőstabilitási vizsgálatok: hőindukált unfolding görbék felvétele

Hőstabilitás vizsgálat

Kinetikai mérések Felfűtés Lehűlés

Oldó közeg ph-jának hatása ph=4,0 ph=3,2 ph=4,4 ph=8,8 22

Fluoreszcencia

Fluoreszcencia alapjai Lumineszcencia: gerjesztett molekulák fényemissziója a hőmérsékleti sugárzáson kívül, hideg emisszió Fluoreszcencia: szinglet-szinglet átmenet Foszforeszcencia: Triplet-szinglet átmenet ( tiltott ) Gerjesztés módjai: fotonabszorpció (fotolumineszcencia) kémiai reakció (kemilumineszcencia) biokémiai reakció (biolumineszcencia) radioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia) Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek 24

Jablonszki diagram 25

Fluoreszcencia alapegyenlete I F = I 0 * Φ * ε * l * c I F : kisugárzott fény intenzitása I 0 : gerjesztő fény intenzitása Φ: kvantumhasznosítási tényező ε: moláris abszorpciós koefficiens (dm 3 * mol -1 * cm -1 l: rétegvastagság, fényút a mintában c: komponens koncentrációja Fluoreszcencia nagyban függ az oldószertől (quenching).

Fluoreszcens spektrofotométer felépítése A gerjesztő és a kisugárzott fény detektálása egymásra merőleges elrendezésű.

Fluoreszcens fényforrások - halogénlámpák (látható, közeli infravörös), - xenonlámpák (látható, ultraibolya), - deutérium lámpák (ultraibolya), - hangolható lézerek, pl. festéklézer ( látható); Lézer Indukált Fluoreszcencia (LIF) A gerjesztés általában Nitrogén (N 2 ) lézerrel, másrészt nitrogén lézerrel pumpált festéklézer segítségével történik. A két gerjesztés közötti legfontosabb különbség, hogy amíg a nitrogén lézer egy önállóan működő ultraibolya lézer, addig a festéklézer gerjesztéséhez a nitrogénlézer szükséges. A festéklézeres mérésnél mindkét lézert alkalmazzuk. 28

LIF Nitrogén lézer: A nitrogén lézer a gázlézerek közé tartozik. A gázok energiaszintjeinek kiszélesedése jóval kisebb, mint a szilárd testekéi. A gázokat általában alacsony nyomáson használják, így az ütközés miatti kiszélesedés kicsi, és a vonalszélességet a Doppler kiszélesedés határozza meg. A gáz lézereket általában elektromos úton gerjesztik, nagy áram átvezetésével. Festéklézer: A festéklézer az egyetlen olyan jelentős lézer, amelynek lézer-aktív anyaga folyadék halmazállapotú. Az aktív anyag ebben az esetben egy olyan oldat, amelynél az oldott anyag szerves, az oldószer több fajta anyag lehet, például etilalkohol, metil-alkohol, víz, stb. 29

LIF A lézerfestékek általában a következő osztályokba tartoznak: Polymethine festékek: Ezek a lézer oszcillációt vörös, vagy közeli infravörös tartományban produkálják. Xanthene festékek: Ezek a látható tartományban (500-700nm) működnek. Coumarin festékek: A kék-zöld tartomány anyagai (400-500nm). 30

Fehérjék vizsgálata (saját fluoreszcencia) 31

Fehérjék vizsgálata (saját fluoreszcencia) Flourofór csoportot tartalmazó aminosavak: Fenilalanin, tirozin, triptofán A legkevésbé a fenilanalin gerjeszthető, ezért a tirozin/triptofán-t szokták vizsgálni. 280 nm-en a tirozin és triptofán egyaránt gerjeszthető, míg 295 nm-en a triptofán szelektíven sugározható be. Oldószer hatás: hidrofil közegben csökken, hidrofób közegben nő az emittált fény intenzitása (hiper- és hipokrom eltolás). Triptofánra jellemző az oldó közegtől függő erős Stokes eltolódás. 32

Triptofán fluoreszcencia 33

Harmadlagos szerkezet vizsgálata Fluorescence Spectroscopy: A tool for protein folding/unfolding study, PC3267, 2007. 34

Fehérje aggregátumok vizsgálata Besugárzási hullámhossz: Emissziós tartomány: 280 nm 300-450 nm 1,2: monomer fehérje 3,4: 5-6 %-ban aggregátumokat atartalmazó fehérje oldat 35

Fehérje bomlási folyamatainak vizsgálata Deamidált MAb oxidált MAb redukált MAb 36

Harmadlagos szerkezet változása a ph függvényében 37

Fluoreszcens jelzések Fehérjék direkt módosítása festékkel: Lys, Arg oldalláncok amino (NH2)-csoportja, Cys tiol (SH)- csoportja reaktív csoportot (izotiocianát, szukcinimidil észter, ill. maleimid) tartalmazó festékkel jelölhető. Pl. FITC (fluoreszceinizotiocianát), ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid), Nílus vörös, Nílus kék 38

Fluoreszcens jelzések (adatbázisok) 39

Fluoreszcenciával kombinált technikák UV abszorbancia Fényszórás Fluoreszcencia (saját és festés) 40

Fluoreszcenciával kombinált technikák 41

Fluoreszcenciával kombinált technikák 42

Fluoreszcenciával kombinált technikák Fehérje formulálás kísérlettervezéssel 43

Fluoreszcenciával kombinált technikák Fényszórás (aggregátumok vizsgálata) Fluoreszcencia (saját, szerkezet) - Dinamikus mérések (30 95 ºC) - Kis mintaigény (ultra-low volume 1-8 µl) - 48 mintahely - Automatizált adatgyűjtés - Automatizált adat feldolgozás - Kombinált értékelés (pl. olvadáspont meghatározás fényszórásból és fluoreszcens intenzitásból együtt.) 44

Fluoreszcenciával kombinált technikák 45