A HÁZIEGÉR (Mus musculus) Mendel és újra felfedezői (Correns, Tschermak, de Vries) mind növényeken kísérleteztek. Sokan megkérdőjelezték, hogy az állatoknál és az embernél is hasonló öröklődési szabályok vannak. A háziegérnek sok színváltozatát és morfológiai variánsát tenyésztették ki, mivel sok évszázada díszállat (Kína, Japán, később Európa). Ezek leginkább egygénes mutánsok, így az egér alkalmas volt a mendeli szabályok igazolására. Az egész világon elterjedt. Ma a legnagyobb számban tenyésztett laboratóriumi emlős. Kis testméret, szaporaság, nem agresszív, tartása olcsó. 3 hét után születnek, 3 hét szoptatás, 2-3 hét ivaréretség Rövid generációs idő: 8-10 hét Viszonylag sok utód: 5-6, évente 5-10 alkalommal. Általában két évet él és folyamatosan képes szaporodni. Mint emlős, az ember genetikai modelljeként is szolgál. Genomja, génjeinek elrendeződése, szabályozása sok hasonlóságot mutat az emberével. Betegségek modellezése: humán betegségekben érintett gének mutáns változatainak létrehozása transzgenikus technikával, szabályozás vizsgálata, gyógyszeres kezelések kidolgozása lehet kisérletezni vele. 10-1
Az egér életciklusa A csírasejtképződés az emberben és az egérben hasonló. A női csírasejtek már embrionális korban kialakulnak. Oogonium, meiózis-i. leáll a diplotén szakaszban. 50 ezer oocita ivarérettség (pubertás) elérésekor minden nemi ciklusban 8-10 oocitánál a meiózis-i befejeződik elsődleges oocita és elsődleges poláris sejt kialakulása után meiózis-ii. másodlagos oocita képződés leáll a meiózis II. metafázisban ovuláció: másodlagos oocita az oviduktuszba kerül. Megtermékenyüléskor fejeződik be a meiózis II petesejt 1n sejtmag + spermium 1n sejtmag zigóta pronukleuszok spermasejt v. spermatozoa, spermatogenezis 10-2
Megtermékenyítés, zigóta, embrió két haploid pronukleusz 1 sejtes embrió pronukleusz replikáció első mitózis 2, 4, 8 és 16 sejtes embrió további mitózisokkal beágyazódás előtti embrionális állapot: differenciálatlan totipotens sejtek, úszó embrió, könnyen eltávolítható, manipulálható, beültethető (az első 4-5 nap) bármilyen típusú sejtet létrehozhat (C. elegans 2 sejtes állapot már determinált!) Az első differenciációs lépés a 16 sejtes embriónál a beágyazódás (implantáció) előtt történik, amikor kialakul a trofektoderma, ami a placenta kialakításában vesz részt. A blasztociszta a belső inner cell mass (ICM) sejtekből alakul ki. 64 sejtes embrió. Megtörténik a beágyazódás. Blasztocoel és ICM. Normál esetben a 64 sejtes embrió ugyanakkora térfogatot foglal el, mint a petesejt, mert a zona pellucida jelenti a határokat. Kikelés, a zona pellucida leválása. Implantáció után az embrió növekedni kezd és kialakul a placenta. Endo- ekto és mezoderma kialakulása. Differenciáció. Már nem manipulálható. 10-3
A 4 sejtes embrió mind a négy szétválasztott sejtjéből teljes értékű utód jön létre emlősöknél. Alacsonyabb rendűeknél ez nem működik (Caenorhabditis, Drosophila). A 4 sejtes embrióból származó szétválasztott egyedi sejteket visszahelyezték a petevezetékbe és normál egérklónok születtek. Emberben kettős és hármas egypetéjű ikrek hasonló természetes hasadásokkal jönnek létre (természetes klónok). A négysejtes embrió másik embrió sejtjeivel fúzionáltatható is. Genetikailag eltérő sejtek esetén kiméra utód keletkezik. 1961-ben egy lengyel embriológus, Andrzej Tarkowski hozta létre az első kimérát eltávolítva a 2 sejtes állapotban a zona pellucida réteget. Ragadós sejtek, összetapadnak hasonló eredetű és korú sejtekkel. 4 és 6 szülős kimérák is létrehozhatók. 10-4
Idegen gének transzgenikus technikák A megtermékenyített petesejt kiszedhető, bele idegen DNS jutattható és visszatelepíthető. Pronucleus injektálás. Random beépülés (25-50% sikerrel). A funkciónyeréses mutációk fenotípusa látható csak. Transzgenikus technika: a funkció bizonyítása SRY (sex reversal on Y) vagy testis-determining factor (TDF). Az Y kromoszómán elhelyezkedő SRY gén felelős a hím jellegek kialakulásáért. A szabályozó és kódoló régió bejuttatása XX egérembrióba hím fenotípusú utódok Ez a gén önmagában elég a hím állatok kialakulásához, más Y kromoszómás gén nem kell. SRY (TDF) fehérje: transzkripciós faktor, DNS kötő domén, más transzkripciós faktorok expresszióját szabályozza. Csak emlősökben, gyengén konzerválódott. Az első osztódás utáni DNS beépülés kimérát eredményezhet. A jó hatásfokú beépülés az aktív repair folyamatoknak köszönhető. Hátrány: nem lehet írányítani a beépülést. Transzfekció: az emlős sejtek transzformációja. 10-5
Az egér genom Valamivel kisebb mint a humán genom, durván 3 000 Mb (3 Gb) 19 pár autoszóma és XY (humán 22+XY) akrocentrikus kromoszómák, más sávmintázat, de a legtöbb humán gén homológja megtalálható, hasonló géncsoportok szinténikus szakaszok, szinténia a gének azonos elrendeződése két rokon genomban 17 Mb átlagos kiterjedés, 170 átrendeződés (170 blokk) A szinténia segíti a homológ gének azonosítását. A közös ős kb. 85 millió éve élt, ekkortól fejlődött külön úton a két genom. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=mus+musculus 10-6
Az Alcp2 gén lokalizálása Az alkohol kedvelés genetikai háttere. 10% alkoholt előszeretettel fogyasztó egyedek genetikai vizsgálatával az egér genomban a 11. kromoszómán lokalizálták az Alcp2 gént (alcohol preference). A szinténiára alapozva ez a lókusz a humán 17. kromoszómára esik. Klónozás nélkül is valószínűsíthető a homológ gén elhelyezkedése a másik genomban. Ezzel a kezdeti információval már vizsgálható az alkohol preferencia (fenotípus) és különböző DNS markerek kapcsoltsága emberben. Ez elvezethet a gén pontos helyzetének meghatározására és a gén azonosításához. Betegség modellek kialakításánál fordított lehetőség: a meghatározott humán gén pozíciója alapján lehet tippelni, hogy az annak megfelelő gén az egér genomban hol helyezkedik el. Knock out egyedek készítése. 11. 17. 10-7
Repetitív elemek, transzpozonok Valamivel kisebb az ismétlődő szekvenciák aránya, mint a humán genomban. Ugyanazok a mobilis elemek fordulnak elő és hasonló arányban, mint a humán genomban. Retrotranszpozonok transzpozonok és Az ORF1 RNS kötő fehérjét, az ORF2 egy reverz transzkriptáz és DNS-endonukleáz aktivitással rendelkező fehérjét kódol. 10-8
Ektopikus expresszió: a myc gén elemzése Expresszió abnormális helyen. A myc gén azonosítása: myelocytomatosis chicken retrovírus (MCV) csirke sejttenyészetben tumort okoz, vírus myc gén transzkripciós faktor homológ (onkogén) hibridizáció: homológok egérben, emberben és más emlősökben humán myc a 8. kromoszómán Burkitt lymphoma (B-sejt rák) esetében transzlokáció a 14. kromoszómára myc gén érintett, magas expresszió ált. (normál esetben nagyon alacsony expresszó) A tumor kialakulásának egyik tényezője? Különböző promóterekkel myc kódoló régióa transzgenikus embriókból normál egerek fejlődtek, nem befolyásolta az egyedfejlődést, Konstrukciók transzgenikus egerek de gyakrabban alakult ki tumor náluk. Immunoglobulin gén promóter (magas expresszió) Dexametazon (DEX, glukokortikoid hormon) indukálható promóter (A kép a DEX indukciót mutatja különböző szervekben) Még egy szomatikus mutáció szükséges a tumorhoz. Több szomatikus mutáció vezet a tumoros növekedéshez. A myc fehérje egy minden sejtben kis koncentrációban jelen lévő transzkripciós faktor. A limfóma kialakulásának pontos molekuláris magyarázata még nem ismert. 10-9
Génszabályozás vizsgálata promóter-riporter gén konstrukciók - transzgenikus egerek 1) hosszú 5' DNS szakasz (5-10 kb is lehet), rajta az összes szabályozó elem: a riporter gén szövetspecifikus, normál expressziója figyelhető meg (bal ábra) 2) deléció sorozat a promóter régióban: ha a del. érinti valamely szabályozó elemet, abnormális expresszió lent (a) és (b) ábra (promóter aktivitás a 0,75 kb-nál hosszabb szakaszokon) 10-10
Az irányított beépítés knock out technika fordított genetika a génfunkció tisztázására BETEGSÉG MODELLEK! Cisztás fibrózis a CFTR gén hibájából emberben (homozig., recesszív) GÉN ELRONTÁSA EGÉRBEN homozigóta recesszív mutáns létrehozása Agouti-fekete kiméra egér 10-11
Az irányított beépítés knock out technika AGOUTI SZÜLŐKből ES sejtek A CFTR GÉN ELRONTÁSA EGÉRBEN (homozigóta recesszív mutáns létrehozása) HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓ RANDOM INTEGRÁCIÓ 10-12
Knock out technika HOMOLÓG REKOMBINÁCIÓ RANDOM INTEGRÁCIÓ neo rezisztens és ganciclovir rezisztens ES sejtek neo rezisztens és ganciclovir SZENZITÍV ES sejtek ganciclovir dg analóg timidin kináz (TK) jelenlétében dgtp analóg jön létre zavar a replikációban 10-13
Knock out technika FEKETE SZŐRŰ SZÜLŐK BLASZTOCISZTA neo rezisztens és ganciclovir rezisztens ES sejtek injektálása kiméra utódok keresztezés: Ki örökíti a knock out konstrukciót? 10-14
Knock out technika Agouti szülő: A/A és Cftr+/Cftr(ha az ivarsejtvonal transzgenikus) F1 agouti utódok DNS-elemzése Ki örökölte a knock out gént? (heterozigóták: +/-) Csak az agouti utódok hordozhatják a transzgént! Aa minden agouti utód heterozigóta CFTR knock out más kromoszómán! lehet Cftr+/Cftr+ és Cftr+/Cftrdihibrid keresztezés /szabad kombinálódás! újabb keresztezés: A/a és Cftr+/Cftr- utódok (hím és nőstény) Ki homozigóta recesszív (Cftr-/Cftr- )? Ha nincs fenotípus csak DNS elemzéssel lehet kimutatni: PCR, hibridizáció 10-15
Homeotikus gének működése egérben Drosophila Hox génekkel homológ nagyobb géncsalád. Az egymás alattiak homológok az adott muslica génnel (és egymással). A géncsoportban az első gén BAL oldalon (ez az 5 vég)! Mindegyiknek önálló promótere van! 10-16
Az egér Hox gének expressziója a fejlődő gerinc mentén. A farok felé haladva egyre több gén aktív. Episztatikus hatás 5 3 irányban a legelső számít (magasabb számú) pl.: HoxA1 és HoxD4 viszonya transzgenikus egerekben 10-17
HoxA1 promóter irányítás alatt a HoxD4 phoxa1_hoxd4 transzgenikus egerekben megjelenik a HoxD4 fehérje az occipitális részen. Homeotikus transzformáció: az occipitális csont nyaki csigolyává alakul. (ectopikus expresszió) Knock out HoxB4 egerekben ennek ellenkezője történik. Nincs HoxB4 fehérje ott sem, ahol lennie kellene: 2. nyaki csigolya (axis) 1. nyaki csigolyává alakul (atlas) D4 B4 10-18