Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem ÁOK Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint Sebészeti Műtéttani Intézet december 06-december 15. Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015 Core modul 3.1/6 Kültenyésztett, beltenyésztett és transzgenikus állatok, klónozás, genetikai módosítás. Dr. Jánossy Tamás SZTE Sebészeti Műtéttani Intézet I. szemeszter

2 Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban 1. A megfelelő állatfaj kiválasztása: Leggyakrabban használt állatfajok: Háziállatok:szarvasmarha, sertés, baromfi, kutya, macska Nem ember főemlősök:majom, csimpánz, cerkófmajom, selyemmajmok Kis laboratóriumi emlősök: egér, patkány, tengerimalac, hörcsög, nyúl Ezek a leggyakoribbak: kis helyigény, szaporaság, rövid tenyészidő 2.A megfelelő genetikai tényezők, tulajdonságok kiválasztása: pl. változatos v. azonos állatok

3 Kültenyésztés: a rokontenyésztés elkerülése genetikailag változatos állomány <100 tenyészpár:a rokontenyésztés maximális elkerülése >100 tenyészpár:rotációs v. találomra történő (random tenyésztés) A beltenyésztési együttható (F) (a homozigóta génhelyek gyakoriságának) növekedése: <1% A kültenyésztett (outbred) állomány egyedei heterozigóták:a génhelyek túlnyomó részébenaz apától (A), ill. az anyától (B) örökölt génallélekkülönbözőek (AB). A populáció anizogén: egyedei genetikailag különböznek (változatos genotípusúak).

4 Zárt kültenyészetbenis megfigyelhető a növekvő homozigótaság. Egyensúlyban lévő zárt tenyészetben az egyedek fele heterozigóta(ab), másik fele homozigóta (25% AA, ill. 25% BB) Rokontenyésztés:4 nemzedéken belüli közös ős a családfában Beltenyésztés:szigorú rokontenyésztés:sorozatos testvér-testvér, gyermek-szülő pároztatás növekvő homozigótaság(genetikai sodródás) (AB helyett AA v. BB) Beltenyésztett törzsek létrehozása: >20 nemzedéken átvégzett testvér-testvér (szülő-utód) pároztatás az összes génlokusz 98,4%-a homozigóta (F=98,4%) A beltenyésztett (inbred) törzs egyedei homozigóták és izogének (azonos genotípusúak).

5 A törzs bármely tagja elfogadja a bármelyik másik azonos nemű tagjából átültetett szöveteket (graft) az izogenitás ellenőrzése bőrtranszplantációval(silvers-féle körtranszplantáció) Fenntartása:a ritka mutációk miatt testvér-testvér pároztatással.

6 A beltenyésztett rágcsálótörzsek története: Jensen, Loeb, Ehrlich, Tyzzer: spontán egértumorok sorozatos transzplantációval történő fenntartása többnyire sikertelen (nem eredt meg v. visszafejlődött) Jensen (1903), Loeb (1908): sikeres sorozatos tumorátoltások viszonylagosan beltenyésztett egerekben a transzplantált tumorokkal szembeni fogékonyság örökletes Little (1914):a tumorrejekció, ill. a fogékonyság több dominánsan öröklődő génen alapul a hisztokompatibilitási gének, a celluláris immunválasz tanulmányozása Rommel, Wright (1906):beltenyésztett tengerimalacok (2-es és 13-as törzs)

7 King (1909): beltenyésztett patkányok (PA, WKA törzsek) Little (1909):beltenyésztett egerek(dba/1, DBA/2 törzsek) Bagg (1913): BALB egértörzs Snell (1930): BALB/c egértörzs Strong (1920): C3H, CBA, A egértörzsek Little (1921): C57 egértörzsek családja : a leggyakrabban használt egér-és patkánytörzsek kifejlesztése 1929: A Jackson Laboratórium megalapítása (Little, Bar Harbor, Maine, USA)

8 Beltenyésztési depresszió (leromlás):a szaporodási képesség, életképesség, egészség stb. csökkenése Csak az első néhány generációbanfigyelhető meg. Oka: a káros recesszív gének homozigótasága A kialakult törzsben már nem fordul elő (szelekció). F 1 hibridek:két genetikailag különböző beltenyésztett törzs keresztezéséből származó első generáció Minden egyed izogén és heterozigóta mindazon génlokuszokra, amelyekben a két szülői törzs különbözik(= a gének kodomináns öröklődése és kifejeződése).

9 Ha két transzplantációs antigénekben (H Ag) eltérő törzset keresztezünk, az F 1 -ek mindkét szülő H Ag-jeit kifejezik ezért egyik szülői törzstől származó bőrgraftot sem lökik ki, a szülői törzsek viszont kilökik az F 1 graftokat.

10 Hibrid életerő vagyheterózis:a beltenyésztési depresszióellentéte a káros recesszív gének elfedése a kialakuló heterozigótaság miatt. Nevezéktan: Nómenklatúra Bizottság(1952) Törzsnév: 1-4 nagybetű Egér:A, AKR, CBA,DBAstb. Patkány: LEW, WAG, BN, PVG stb. Számok csak a korábban elterjedt törzsek esetén engedélyezettek(pl. egér: C3H, C57BL; patkány: F344, AS2, M520)

11 Altörzs: - atörzs két v. több ágra oszlika testvérpároztatás között, v. - ugyanabban a tenyészetben két párhuzamos vonal genetikailag eltér. Példák: C57BL/6, C57BL/10 Alvonal: - egy másik laboratóriumban történő hosszú tenyésztés (CBA/J, CBA/Ca; A/He, A/J stb.) - a törzs bármilyen manipulációja Nevezéktan: törzsnév/altörzs, alvonal szimbólum(ok) történeti sorrendben (a tenyésztő v. a laboratórium nevének rövidítése, ritkán szám: pl. C57BL/10ScSn: Sc=Scott, Sn=Snell

12 Manipulációk: f: dajkaság(foster nursing) egy másik törzsnél: pl. C57BL/10ScSnfC3H. Pl. specifikált patogénmentes (SPF) törzsek létrehozása a magzatok méhhel együtt történő eltávolítása és SPF dajkaságban történő felnevelése révén e: embriótranszfer egy másik törzsbe o: ovárium-transzplantáció h: mesterséges táplálás(hand rearing) p: petesejttárolás(preservation) cseppfolyós nitrogénben Rövidített törzsnevek:akr=ak, BALB/c=C, C3H=C3, C57BL=B, C57BL/6=B6, C57BL/10=B10 F 1 hibridek elnevezése:(nőstény szülői törzsx hímszülői törzs)f 1 : (BALB/c x C57BL/6)F 1 =CB6F1

13 Koizogén törzsek: Mutáció egy jelentős génlokuszban egy beltenyésztett törzsben egy új beltenyésztett törzs kialakítása a mutációt hordozó állatokból Az újtörzs csak egyetlen génlokuszban (a mutált génben) különbözik az eredetitől a génmutáció fenotipikus hatása tanulmányozható. A mutáció betegség alapját képezheti: Egér: Anémia: sla gén Diabétesz és elhízás(obesity): db, ob gének Anyagcsere-betegségek: his (hisztidinémia), pro (prolinémia) Vesebetegség: kd gén Izomsorvadás(dystrophia): dy, dy2j gén

14 Farok (tail) fejlődési rendellenességek: t-allél Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: nu Patkány: Diabetes insipidus: di gene Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: rnu gén Bilirubinémia: j gene Nevezéktan: törzsnév/altörzsnév-mutáns gén neve: BALB/c/Rij-nu, C57BL/6J-ob Kongenikus, ill. kongenikus rezisztens törzsek: -A kívánt domináns gén (D)bejuttatásaegy donor törzsből (2.) egy másik, beltenyésztett (d génallélű)recipienstörzsbe(1.)keresztezéssel F 1 hibridek létrehozása; -az F 1 -ek visszakeresztezése az 1. (recipiens) törzsű egerekkel; -a D gént hordozó utódok (Dd) szelekciója és visszakeresztezése 1. egerekkel.

15 Legalább 12 visszakeresztezés szükséges majd egy Dd heterozigóta hím és nőstény pároztatása ezután egy DD homozigóta hím és nőstény beltenyésztése: az új, kongenikus törzs hordozza a donor D gént, míg az összes egyéb génjei (háttérgének) azonosak a recipiens (1.) törzsével.

16 Kongenikus rezisztens törzsek:a bőr-, ill. tumorgraftok rejekcióját kiváltó antigének génjeinek (MHC) bejuttatása a recipiens törzsbe Nevezéktan:recipienstörzs.donor törzs (gyakran rövid nevekkel): pl.b10.d2 génrecipiens: C57BL/10 (B10)(MHC=H-2 b ), géndonor:dba/2 (D2)(MHC=H-2 d ) kongenikus rezisztens törzs = B10.D2 (másik elnevezés:c57bl/10scsn-h-2 d ) A B10.D2 (H-2 d ) törzs kongenikus a B10 (H-2 b ) törzzsel: csak a H-2 lokuszban térnek el, háttérgénjeik azonosak. A H-2 felfedezése = az egér fő hisztokompatibilitási komplexe [major histompatibilitycomplex (MHC)] H-2 kongenikus törzsek közöttitranszplantáció: az MHC felelős a graftrejekcióért.

17 Rekombinánstörzsek: két nem rokon beltenyésztett törzskeresztezésévellétrehozott F 2 generációból származnak, >20 generáción át végzett testvértestvér pároztatással állítják elő őket. Elnevezés:pl.AKR/J(AK) x C57L (L) AKXL törzsek az elfogadott nevezéktan szerint számokkaljelölve: AKL-1, -2, -3 stb. [A legelső rekombinánstörzsek esetén nagybetűket használtak: BALB/c (C) x C57BL/6 (B6) CXBtörzsek(CXBD, -E, -G, -H stb.). Alétrejött törzsek izogének, a két ős génjeit összekeveredve hordozzák random eloszlásban. Új polimorf gének azonosítására, térképezésére és poligénestulajdonságok tanulmányozására alkamasak: pl. élettartam, morfológiaiés fiziológiai jellemzők, viselkedés, gyógyszerhatások, betegségekre való hajlam stb.

18 Transzgenikus állatok: Transzgének (= idegen DNS-szekvenciák) előállítása (rekombináns DNS technológia révén) A struktúrgénen kívül tartalmazhat vektorgént, ill. szabályozó (promoter, ill. enhancer) DNSszekvenciákat. Bejuttatás: a) mikroinjekcióval megtermékenyített petesejtek hím pronukleuszaiba és a 2 sejtes embrió bejuttatása álterhes nőstények petevezetékébe b) transzfekcióval embrionális őssejtekbe c) vírus által közvetített génátvitellel A transzgént kifejező transzgenikus állatok kiválasztása(75%-uk minden testi és ivarsejtje tartalmazza) és homozigóta vonal kitenyésztése [nevezéktan: törzsnév-tgn v. H(tr.gén neve) laborkód; N=nem homológ; H=homológ]

19 A transzgéneket ki lehet fejeztetni: - meghatározott szövetekben a megfelelő regulátor szekvenciákhoz való kapcsolás révén (pl. lymphoid promoter: antigénreceptor-gének kifejeződése lymphocytákban) - gyógyszerekre v. hormonokra(pl. tetraciklin, ösztrogén, dexametazon) válaszoló promoterekhez kapcsolva a transzgén célzott bekapcsolása A transzgenikus állatokat lehet használni: -a transzgén élettani, patológiai hatásainak vizsgálatára; - betegségmodellként; -transzgenikus fehérjék/peptidek(gyógyszerek, hormonok stb.) nagy mennyiségben történő előállítására; -előnyös tulajdonságú állatok (nagyobb tej-, húshozam, ellenállóképesség) létrehozására.

20 Génkiütött (knockout) állatok: Gének célzott mutációja v. szétrombolása homológ rekombináció révén hólyagcsírából nyert pluripotens embrionális őssejtekben (ES): a kiütésre használt működésképtelen exogén génkonstrukció az endogén génnel homológ szekvenciákattartalmaz rekombináció a kódoló szekvenciák diszrupciója a génexpresszió és/vagy -funkció megszűnése, deléciója A génkiütött ES-ek mikroinjekciója hólyagcsírába (kiméra: normál + génkiütött sejtek), beültetés álterhes nősténybe kimérautódok homozigóta génkiütött vonal kitenyésztése A génfunkció in vivo tanulmányozása Génbeütött (knockin) állatok: Működőképes transzgén célzott beillesztése homológ rekombinációval egy endogén gén helyére.

21

22 Klónozott állatok: Klón:az utód genomja teljesen azonos a kiinduló egyedével. Sejtosztódások (pl. megtermékenyített petesejtek és testi sejtek osztódása a kiinduló sejt klónjai) Többsejtű élőlények klónozása: I.Embrióosztási (splitting) v.ikerkészítési (twinning) technika: Rutin módszer a jó tulajdonságokkal rendelkező háziállatok klónozására(pl. szarvasmarha). Mesterségesen egypetéjű ikreket állítanak elő. Lépések: 1. Egy petesejtet mesterségesen megtermékenyítenek spermiummal. 2. A zigótát hagyják osztódni 8-sejtes embrióvá.

23 3. Az embriót 2 x 4-sejtes v. leggyakrabban 4 x 2- sejtes darabokra osztják. A sejtek még nem differenciálódnak a 8-sejtes embrióban a szétválasztott embriók genetikailag azonosak, mint az egypetéjű ikrek:ikerkészítés embrióból. 4. A szétválasztott embriókat hagyják fejlődni in vitro. 5. Azután beültetik őket egy álterhes nőstény méhébe.

24 II. Testi sejtmag átvitele [somatic cell nuclear transfer (SCNT)] Ian Wilmut és Keith Campbell, Roslin Intézet, Skócia, 1997: a Dolly bárány létrehozása Az SCNT-hez két sejt szükséges: a magdonor testi sejt+ egy megtermékenyítetlen petesejt mint recipiens sejt: - A petesejt megfelelőbb recipiens sejt, mint a testi sejtek: könnyebb osztódásra késztetni. - megtermékenyítetlen petesejtkönnyebben befogadja a sejtmagot, mint a megtermékenyített. Az SCNT lépései (Roslin-technika): 1. A donor sejtet(a Dolly esetében emlőmirigysejt) fötális borjúsavót tartalmazó tápfolyadékban tenyésztik, és hagyják osztódni in vitro.

25 2. Ezután a sejteket FCS-mentes tápfolyadékba helyezik az osztódás leáll, és a sejtek G 0 v. nyugalmi állapotba kerülnek. Ez szükséges, hogy a recipens sejt befogadja a donor sejtmagot. 3. A sejtmagot eltávolítják a petesejtből. 4. A donor sejteta mag nélküli recipens sejt közelébehelyezik órával a mageltávolítás után elektromos inger: -donor sejt (v. izolált mag) fúziójaa mag nélküli petesejttel; -a sejtosztódás aktivációja és az embrió fejlődése

26 A differenciált donor sejtmaggenetikai programja lenullázódik a petesejtben differenciálatlan, pluripotens sejt 6. Az embriót birka-petevezetékbehelyezik 5-6 napra (itt az embriók túlélése jobb, mint szövettenyészetben). 7. Amikor az embrió eléri a hólyagcsíra (blasztoméra)állapotot (kb. 100 sejt), az embriót beültetik egy dajka anya méhébe. 8. Az anya kihordja a terhességet. Az utódok a donor genetikailag pontos másolatai (a sejtmag DNS-re korlátozódóan!) reproduktív klónozás A blasztomérákat őssejtforrásként is lehet használni.

27 Honolulu-technika: egerek sikeres klónozása A klónozott állatok képesek voltak normálisan szaporodni, fenntartani a klónt szexuális reprodukció révén. Kromatintranszfer:A klónozandó sejtek kezelése eltávolítja a sejtdifferenciálódással kapcsolatos molekulákat, mielőtt a magot eltávolítják a genetikai program lenullázódása könnyebben megy végbe a sejtmagátvitelt követően.