Az ellenanyagok orvosbiológiai alkalmazása PhD kurzus 2011/2012 II. félév
Ellenanyaggal működő módszerek Analitikai felhasználás
Analitikai felhasználás Ellenanyag / antigén kapcsolódás Az Ab/Ag kapcsolat csak kapocs az analit és a jel között Az Ab/Ag kapcsolat önmagában egy jel megváltozása Heterogén (szilárd) fázisú rendszerek Homogén (folyadék) fázisú rendszerek
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Általános felépítés Hordozó felület (műanyag, üveg, ill. ezek biopolimer bevonata, specifikus kapcsolóelem ellenanyag, avidin) Minta / antigén kapcsolódik a hordozóhoz (vagy aspecifikus, kémiai kötéseken, vagy specifikus reakción alapuló kapcsolat) Detektáló ellenanyag (direkt vagy indirekt jelölt) kapcsolódik az antigénhez Jelet felfogjuk / mérjük Lépések között mosás, ezzel elkülönítjük a kötött és szabad reagenseket
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Detektáló műszer Detektáló ellenanyag Minta / Antigén Hordozó felület Érzékenység * ** *** Alacsony költségek *** ** * Alacsony háttér * ** ***
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Direkt jelölt Haptén jelölt Jelöletlen Detektáló és/vagy jelhordozó ellenanyag Minta / Antigén Hordozó felület Érzékenység * *** *** Alacsony költségek ***/** * **/*** Gyorsaság *** ** * Alacsony háttér *** ** *
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k A felfogható jel Foton >> Elektron >> Egyéb Színintenzitás Fluoreszcencia Kemilumineszcencia γ-sugárzás Elektromos áram β-sugárzás Mechanikai jel Mágneses rezonancia
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Érzékenység Linearitás Stabilitás Költség Abszorbancia * * *** *** Fluoreszcencia ** *** ** ** Kemilumineszcencia *** ** * ** TRF *** *** *** * γ-sugár számlálás **** *** */*** *
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Homogén reakció: maga az Ag / ellenanyag kapcsolódás idéz elő mérhető jelet Nincs szükség a kötött / nem-kötött reagensek szétválasztására (mosás) Sok esetben közelebb áll a fiziológiás folyamatokhoz Hátrány: műszerigényes, drága, sok kémiai-biológia korlátja van, vagy nem elég érzékeny
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Immunprecipitáció / agglutináció
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Turbidimetria / nefelometria
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Turbidimetria / nefelometria Klinikai laboratóriumi tesztek Módszer CRP Turbidimetria uscrp Latex turbidimetria RF Latex turbidimetria Ferritin Latex turbidimetria Transferrin Turbidimetria IgE Latex turbidimetria IgA Turbidimetria IgM Turbidimetria IgG Turbidimetria A1-antitripszin Turbidimetria C3 Turbidimetria C4 Turbidimetria
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Gerjesztett állapot (S 1 ) hν ex hν em Köztes állapot (S int ) Alapállapot (S 0 )
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Donor Akceptor
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Journal of Lipid Research, 2007, 48:19-29
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluorescence protection assay FRET elvén működik, de nem emittál az akceptor, csak elnyomja a donor fluoreszcenciáját Olcsóbb, egyszerűbb, de kevésbé érzékeny
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP)
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP) P=(I P -I A )/(I P +I A ) τ: fluoreszcens életidő
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP) FL_IgG-FITC FL_EVBlue-FITC 1000000 r 2 =0.9997 slope=288.3 1000000 r 2 =0.9999 slope=277.8 FL intensity 100000 10000 1000 FL intensity 100000 10000 1000 M w =150 kd 100 1 10 100 1000 10000 FITC (nm) IgG-FITC Ex:180 Em: 90/180 100 0.1 1 10 100 1000 FITC (nm) EVANS-BLUE-FITC Ex:180 Em: 90/180 M w =1,35 kd 35 30 35 30 25 25 FP (mp) 20 15 10 5 0-5 -10 1000 2000 3000 FITC (nm) FP (mp) 20 15 10 5 0-5 -10 100 200 300 400 500 FITC (nm)
Alpha-technology 680 nm O O O 200 nm 680 nm O O 520-620 nm
Ellenanyaggal működő módszerek Preparatív felhasználás
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció Kovalens kötés a mátrix és az ellenanyag között Ag /Ab kapcsolás fiziológiáshoz hasonló körülmények (alacsony ionerő, ph ~7) Elúció fiziológiástól erősen eltérő körülmények (magas ionerő, savas v. lúgos ph) Emiatt hamar denaturálódnak az ellenanyag molekulák egy oszlopot/ mátrixot csak néhányszor lehet használni!
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mechanikus, fluoreszcens és mágneses válogatás (Cell sorting)
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mechanikus válogatás
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Fluoreszcens válogatás Fluoreszcensen jelölt sejtek Detektor Lézer + -
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mágneses válogatás
Ellenanyaggal működő módszerek Funkcionális felhasználás
Funkcionális felhasználás Makromolekulák kölcsönhatásának gátlása Vírus neutralizáció Toxin neutralizáció Adhézió gátlás Citokin neutralizáció Sejt aktiváció / depléció Sejthalál indukció Receptor mediált aktiváció Vakcináció Ellenanyag terápia / RIT
Funkcionális felhasználás Receptor szignalizáció modellezése CD3 migm /IgD FcεRI EGFR CD95L
Ellenanyaggal működő módszerek Analitikai felhasználás Szilárdfázisú assay-k
Szilárd fázisú tesztrendszerek ELISA / RIA / FLIA Bead-array Fehérje micro-array Western-blot NanoPro EMSA-Supershift Immun-mikroszkópia Áramlási citometria ELISPOT
ELISA Enzime-linked immunosorbent assay Szilárd fázis mosás Enzimatikus erősítés Mikrolemez formátum (96-, 384-, 1526-lyuk/lemez) automatizálás, nagy áteresztőképesség, kedvező kontroll/minta arány Standardizált infrastruktúra (lemezek, pipetták, robotok, mosók, mérőműszerek) Olcsó, egyszerű
ELISA Ellenanyag teszt Antigén teszt (szendvics) Kompetitív tesztek Jel Jel Analit koncentráció Analit koncentráció
ELISA Szendvics teszt Kompetitív teszt
Bead-array 40 szérumminta 1 szérum biomarker 40 szérumminta 10-100 szérum biomarker
Bead-array α-il1 α-il6 α-il8 α-mcp-1 α-tnfα α-ifnγ α-tgfβ α-il10
Bead-array FL2 FL3 Gyöngyszám FL1
Fehérje micro-array Üveg vagy membrán felület Antigén chip vagy ellenanyag chip Szendvics elrendezés FLIA
Western-blot - + Molekulatömeg szerinti szétválasztás utáni mérés Aspecifikus reakcióra érzékeny (membrán egységesen alapreakciót ad) Keresztreakcióra / polireaktivitásra kevésbé érzékeny, mint az ELISA /array típusú módszerek, mert a molekulatömeg segít
Western-blot
NanoPro
EMSA-Supershift - Nem fiziológiás körülmények között kell működniük Monospecificitás nagyon fontos +
Immun-mikroszkópia Immunhisztokémia /Immuncitokémia Enzim jelölés, színes kicsapódó szubsztrát Immunfluoreszcens mikroszkópia Fluoreszcens jelölés Immun-elektromikroszkópia Arany-kolloid jelölés
Immun-mikroszkópia
Immun-mikroszkópia
Áramlási citometria (FACS) Lézer Fluoreszcensen jelölt sejtek Detektor + -
ELISPOT Szendvics módszer Sejtek produktumait méri, de nem kvantitatív módon, hanem a termelő/nem-termelő sejtek arányában Ritka események is jól mérhetőek Speciális membrán aljú steril 96-lyukú mikrotiter lemez Standardizálás műszerigényes
ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT n=1 000 000 p=46 f=4,6*10-5
Jövő heti program Dr. Nagy György: Ellenanyag terápia