Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Az aflatoxin M1 megjelenése élelmiszereinkben Szigeti Tamás János (WESSLING Hungary Kft.)
Bevezető statisztikák
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 2013 (db) Összesen: 18 625 db aflatoxin vizsgálat
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 2013 (db)
Aflatoxin vizsgálati igények 2006 2013 (db)
Aflatoxin M1 vizsgálati igények 2006 2013 (db)
Aflatoxin M1 vizsgálati igények 2011-13 (havi db) 2011 2012 2013
Aspergillus flavus telepek kukoricaszemen
Penészgombák Az elmúlt évezred utolsó évtizedeiben fordult a figyelem a mikroszkópikus gombák toxinjai felé. A takarmánynövényeket és élelmiszereket fertőző gombák közül több faj olyan biokémiai szisztémával rendelkezik, amely a gombára ható környezeti hatásokra adott válaszként toxikus vegyületet állít elő (Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Claviceps). Az élelmiszerbiztonsági RASFF riasztások között a legtöbb mikotoxinszennyezettség miatt történt:
RASFF riasztások 2006-ban (MÉBIH adat) 700 riasztás mikotoxinok miatt
RASFF riasztás tejek: aflatoxin M1 tartalma Date Pro-duct type Reference Notification type Controll type Notified by rigin Subject Distribution Category Week Dátum Kódszám Termék típus Bejelent.tí pus Ellenőrz.tí pus Bejelentő Származás Tárgy Ért.helye Kategória Hét 2012. 10.25 2012.1 499 food information for followup company's own check Slovenia Hungary Aflatoxins (Tot. = 0,074 μg/kg - ppb) in raw chilled milk from Hungary Slovenia milk and milk products 43 2012. 10.22 2012.1 469 food information for attention company's own check Italy Hungary Aflatoxins (Tot. = 0,095 μg/kg - ppb) in raw milk from Hungary Italy milk and milk products 43 2012. 01.23 2012.0 116 food information for followup company's own check Italy Hungary Aflatoxins (M1: 0,072 μg/l) in raw milk from Hungary Italy milk and milk products 4 2012. 01.17 2012.0 093 food information for attention company's own check Italy Slovenia Aflatoxins (M1: 0,183 μg/kg - ppb) in raw milk from Slovenia Italy milk and milk products 3 2007. 09.17 2007.0 645 food alert company s own check Italy Hungary Slovakia Aflatoxins (M1 = 0,03; 0,45; 0,43 μg/kg ppb) in fresh raw milk from Hungary, via the Slovak Republic Italy Slovakia milk and milk products 38
1960: Anglia, pulykák X betegsége
1960: Anglia, pulykák X betegsége
Gerald Wogan és George Hermann Büchi 1960/1963 GB/USA Gerald Wogan: a vegyületet azonosította George H. Büchi: az A. flavus gombát ismerte fel >100 000 pulyka és kacsa pusztulása mogyorótól
Vizsgálatok (1960 1963) G. Wogan a brazíliai földimogyoróból UV-fényben fluoreszkáló vegyületet talált. Az erősen mérgező földimogyoróból G. H Büchi fonalas gombát is izolált, amely táptalajon termelte az ismeretlen anyagot: Aspergilus flavus (magyarul: kannapenész )
Aspergillus konidiumtartók 10 7 spóra/cm 2 Aspergillus sp.
Néhány nemzetség és faj Aspergillus (flavus, ochraceus, niger, viridicatum) toxinok: Aflatoxinok (B1, B2, G1, G2, M1, M2) chratoxin-a, ochratoxin-b, ochratoxin-c Patulin Penicillium (chrysogenum, brevicompactum) toxinok chratoxin-a Patulin Fusarium (graminearum, culmorum) toxinok Zearalenon (F-2 toxin) Nivalenol Deoxinivalenol (DN) T2-toxin Fusarium moniliforme toxinja Fumonizinek Alternaria alternata toxinok Alternariol Altertoxin 1
Mikotoxinok meghatározása A mikotoxinok a gombák, elsősorban a penészgombák extracellulárisan kiválasztódó másodlagos anyagcseretermékei. E vegyületek a melegvérűeket főként enterálisan károsítják. Némelyek közülük antibiotikus hatásúak. A kalaposgombák toxinjai nem tartoznak az ún. mikotoxinok közé!
Mikotoxinok csoportba-sorolása Az eddig leírt nagyszámú toxin és gombafaj miatt nehéz a csoportosítás. Az egy nemzetségbe tartozó gombák különböző toxinokat termelnek, és fordítva, taxonómiailag távol álló fajok képesek azonos toxinokat előállítani. Rendszerezési lehetőségek: 1. Kémiai szerkezet alapján 2. Magasabbrendűekre gyakorolt farmakológiai hatás alapján 3. Bioszintézisük alapján (nem teljeskörű)
Furanofuránok - aflatoxinok Aflatoxin-csoport: szubsztituált kumarin-származékok - aflatoxin B1 - aflatoxin G1 - aflatoxin M1 - aflatoxin B2 - aflatoxin G2 - aflatoxin M2 - aflatoxin B3 Aspergillus flavus, Asp. parasiticus B1, G1, M1 : 7,8-dihidrofurano(2,3-b)furán B2, G2, M2: 2,3,7,8-tetrahidrofurano(2,3-b)furán
Kumarin régóta ismert íz- és aromaanyag Fahéj (ceyloni, cassiai) Szagos müge (szeszipari alkalmazás) Brazil tölgy Somkóró
Aflatoxin B1 Alattomos, kifejezetten toxikus vegyület CH 3
Aflatoxin B1 (szubsztituált kumarinok) Kumarin-váz CH 3
Aflatoxin B2 (szubsztituált kumarinok) Hiányzik egy kettőskötés CH 3
Aflatoxin G1 (szubsztituált kumarinok) CH 3
Aflatoxin G2 (szubsztituált kumarinok) CH 3
Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok) Mitokondriális citokróm P450: AFB1 AFM1 (15-30 perc) AFM1 AFB1
Aflatoxin M1 (szubsztituált kumarinok) H CH 3
Az Aspergillus fajok toxintermelési jellemzői - SZAPRDÁS: széles hőmérsékleti intervallumban - TXINTERMELÉS: - Valószínűsége: 6-75 % (változó adatok) - Vízaktivitás - ptimális hőmérsékletek: - 20 o C körül: aflatoxin G1-30 o C körül: aflatoxin B1 - Hazai klíma? - Maximális koncentráció: a fertőzést követő 2 héten belül - TXINTERMELÉST TÁMGATÓ SZUBSZTRÁTK: - Szacharóz - Glükóz - (NH 4 ) 2 S 4 Zn,
Az aflatoxinok biológiai hatása (B1 és M1) - ÉRZÉKENY FAJK: kacsa, pulyka, egér, tengerimalac, patkány, - TLERÁNS FAJ: juhok - TÜNETEK: étvágytalanság, tömegvesztés, elhullás, krónikusan karcinóma kialakulása; - KÓRBNCTAN: májkárosodások (elhalás, daganatok; egy kóreset: napi 100 g sózott mogyoró veszélyes lehet ) - ADI-ÉRTÉK: 5 ng/ttkg/nap (kb 300 400 ng/fő) (FDA adat) - LD 50 -ÉRTÉK (patkányoknál ip): 6 mg/ttkg 18 mg/ttkg
Az aflatoxinok biológiai hatása (AFB1, AFM1) T.D.Phillips 1, E. Afriyie-Gyawu 1, J.Williams 2, H.Huebner 1, N.A. Ankrah 3, D.fori-Adjei 3, P.Jolly 4, N.Johnson 1, J.Taylor 1, A. Marroquin- Cardona 1, l.xu 5, l.tang 5, & J.S.Wang 5: : Reducing human exposure to aflatoxin through the use of clay: A review. Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): 134 145 1 Department of VIBS-MS 4458, Texas A&M University, Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine, College Station, TX 77843, USA, 2 Peanut Collaborative Research Support Program, University of Georgia,Griffin, GA, USA, 3 School of Public Health, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana,Legon, Accra, Ghana, 4 Epidemiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA, and 5 Instituteof Environmental/Human Health, Texas Tech University, Box 41163, TTU/TIEHH, Lubbock, TX 79409-1163, USA A cikk az alábbi oldalon található: http://www.scribd.com/doc/61661206/36450378 (Food Additives and Contaminants, February 2008; 25(2): 133)
Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj
Az aflatoxinok elsődleges célszerve a máj Az aflatoxin B1 molekulái (vörös színnel) a DNSláncba interkalálódnak. Interkalálódott aflatoxin B1 [d(atc AFB GAT). d(atcgat) és d(at AFB G-CAT) 2 ]
Aspergilloma a tüdőben (a gomba belégzése) Az Aspergillus spóráinak belégzése következtében gombatelepek alakulhatnak ki a tüdő hörgőiben.
VM 64/2012. (VII. 3.) VM rendelet Takarmány mg/kg 0,02 0,01 0,005 0,02
A Bizottság 165/2010/EU rendelete Tej µg/kg 0,050 0,025 0,025
Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg Aflatoxin M1 határérték tejben: 0,05 µg/kg (50 ng/kg)
Analitikai lehetőségek
Amit mérni kell (néhány század ppb) 1 ppb = 1 gramm/1000 tonna 1 ppb = 1 µg/kg 1 ppb 1 µg/liter Számottevő mérési bizonytalanság!
Méréstechnika, analitikai lépések 1. Mintaaprítás, extrakció 2. Immunkromatográfiás tisztítás 3. Származékképzés 4. Műszeres mérés: 1. HPLC/DAD kis érzékenység nagyobb pontosság 2. HPLC/FLD nagyobb érzékenység és pontosság 3. ELISA nagy érzékenységű, kevésbé pontos 5. Értékelés 6. Vizsgálati jegyzőkönyv Mindezek mellett: Kalibráció, pontosság Görbeillesztés, línearitás Ismételhetőség, reprodukálhatóság Visszanyerés vizsgálata Alsó méréshatár ellenőrzése
Immunkromatográfiás oszloptisztítás Extraktum
Immunkromatográfiás oszloptisztítás Mosás Eluálás
Kromatográfiás elválasztás és detektálás A vizsgálat eredménye: 1. toxin µg/kg 2. toxin µg/kg 3. toxin µg/kg Kromatogram 1. 2. 3. Kolonna
Fluorimetriás detektálás származékképzéssel Gerjesztő hullámhossz Mérési hullámhossz Norm. 40 l Ex = 373 nm l Em = 435 nm 30 20 10 0 250 300 350 400 450 500 550 nm HPLC-FLD: nagy érzékenység, precíz konfirmálás
A mérőberendezés Agilent 1100 HPLC-FLD
Mérési eredményeink 2006 óta 18 625 aflatoxin mérés
Aflatoxin standardek kromatogramja B, G B1 G1 G2 B2 Aflatoxin standard, G1: 12,5 ng/ml, B1: 12,5 ng/ml, G2: 3,75 ng/ml, B2: 3,75 ng/ml
Minta extraktumának kromatogramja (B, G) B1 G1 G2 B2
6.984 - Aflatoxin_M1 15.055 7.013 7.010 Aflatoxin M1 kromatogramok (tej vizsgálata) FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX 2012-11-08 13-16-13\022-2501.D) LU 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3 0 2 4 6 8 10 12 14 FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX 2012-11-08 13-16-13\036-3901.D) LU 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3 0 2 4 6 8 10 12 14 FLD1 A, Ex=365, Em=450 (Z:\DATA\121108_TX 2012-11-08 13-16-13\037-4001.D) LU 4.8 4.6 4.4 4.2 4 0,02 µg/kg <0,02 µg/kg <0,02 µg/kg 3.8 3.6 3.4 3.2 3 0 2 4 6 8 10 12 14 Area: 18.9755 Area: 5.65423 Area: 9.95952 Aflatoxin M1 min min min
Aflatoxin M1 kalibrációs görbéje A re a A fla to x in _ M 1, F L D 1 A A re a = 2 2.3 0 7 8 9 7 *A m t + 0 R e l. R e s % (1 ): -1 8.9 9 8 200 5 150 4 100 50 3 1 2 0 C o rre la tio n : 0.9 9 9 6 2 0 2 4 6 8 A m o u n t[n g / m l]
Aflatoxin B1 gyakorisága takarmányokban >20 µg/kg 7 db minta
Aflatoxin M1 gyakoriság összes tejtermékben LQ alatt 351 db minta 0,05 µg/kg aflatoxin M1 (19 db minta)
Aflatoxin M1 gyakoriság 482 db tejtermékben Aflatoxin M1 gyakorisága 482 db tej- és tejtermék-mintában <LQ nélkül 2006 2013 > 50 µg/kg minták: 50 db (15,2%)
Tejek aflatoxin M1 tartalma (>LQ = 0,01 µg/kg) µg/kg 70 db <0,05 µg/kg (21,3%) 50 db 0,05 µg/kg (15,2%)
Köszönöm megtisztelő figyelmüket! Külön köszönet illeti a WESSLING Hungary Kft. Élelmiszerbiztonsági Üzletága Laboratóriumának munkatársait.