1 01/2008:1134 NADROPARINUM CALCICUM Nadroparin-kalcium R = H vagy SO 3 (½Ca), R' = H vagy SO 3 (½Ca), vagy CO-CH 3 R2 = H és R3 = CO 2 (½Ca), vagy R2 = CO 2 (½Ca), és R3 = H DEFINICIÓ A nadroparin-kalcium kis molekulatömegű heparin kalciumsója, amit sertés bélnyálkahártyából származó heparin salétromossavas depolimerizációjával állítanak elő. Az anyagot ezután frakcionálják, melynek során szelektíven eltávolítják a 2000-nél kisebb molekulatömegű láncok nagy részét. A legtöbb összetevő a nemredukáló láncvégen 2-O-szulfo-α-L-idopiranózuronsavat, a redukáló láncvégen 6-O-szulfo-2,5-anhidro-D-mannitot tartalmaz. A nadroparin-kalcium feleljen meg a Kis molekulatömegű heparinok (0828) cikkely előírásainak a következő módosításokkal és kiegészítésekkel: Az átlagos realtív molekulatömeg 3600 5000; jellemző értéke kb. 4300. A szulfatáltság foka diszacharid egységenként kb. 2. A szárított anyagra vonatkoztatott anti-xa-faktor aktivitás 95 130 NE/mg. Az anti-xa-faktor aktivitás/anti-iia-faktor aktivitás arány 2,5 és 4,0 közé esik. AZONOSÍTÁS
2 Elvégezzük a Kis molekulatömegű heparinok (0828) cikkelyben leírt A azonosítási vizsgálatot. Az anyag felejen meg a következő követelményeknek: A relatív átlagos molekulatömeg 3600 és 5000 között legyen. A 2000-nél kisebb molekulatömegű láncok tömegaránya legfeljebb 15,0% legyen. A teljes tömeg 75 95%-a a 2000 8000 molekulatömeg-tartományba essék. A teljes tömeg 35 55%-a a 2000 4000 molekulatömeg-tartományba essék. VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. 0,5 g vizsgálandó anyagot 10 ml R vízben oldunk. Az oldat opálossága nem lehet erősebb, mint a II. számú összehasonlító szuszpenzióé (2.2.1), és színe nem lehet erősebb, mint az S 5 szín mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). Etanol: legfeljebb 1,0 %m/m. Gőztér (head-space) gázkromatográfiás meghatározást végzünk (2.2.28), belső standardként R 2-propanolt használunk. Belső standard oldat. 1,0 ml R 2-propanolt R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R vízzel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat. 1,0 ml R etanolt R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 0,5 ml-ét R vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. A mintatartó üvegcsék tartalma. Négy, kupakkal lezárható, a mintaadagoló rendszerrel kompatibilis mintatartó üvegcsét rendre megtöltünk az alábbi oldatokkal: 1 ml R víz (üres minta); 0,5 ml összehasonlító oldat és 0,50 ml belső standard oldat (összehasonlító minta); 10,0 mg vizsgálandó anyag, melyhez 1,0 ml R vizet adunk (A-vizsgálati minta); 10,0 mg vizsgálandó anyag, melyhez 0,50 ml R vizet és 0,50 ml belső standard oldatot adunk (B-vizsgálati minta). A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei: 1,5 m hosszú, 2 mm belső átmérőjű, R etilvinilbenzol-divinilbenzolkopolimerrel (150 180 μm) töltött nikkel oszlop;
3 vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium vagy R kromatográfiás célra szánt nitrogén 30 ml/perc áramlási sebességgel; lángionizációs detektor. Az oszlop hőmérsékletét 150 ºC-on, az injektorét és a detektorét 250 ºC-on tartjuk. Az egyensúly elérése céljából a gőztérbe helyezett valamennyi mintatartó üvegcsét 15 percig 90 ºC-on tartjuk. A mintafelvitel előtt a nyomás alá helyezés időtartama: 1 perc. Az összehasonlító minta kromatogramján két csúcs jelenik meg, amelyek növekvő retenciós idő szerint az etanolnak és a 2-propanolnak felelnek meg (kb. 2,5 és 4 perces retenciós idővel). Az m/m etanol-tartalmat az etanol 20 ºCon meghatározott sűrűsége (0,792 g/ml) figyelembevételével számítjuk ki. N-NO-csoportok. Legfeljebb 0,25 ppm. Mennyiségét az N-NO kötés hidrogén-bromiddal, etil-acetátos közegben, visszafolyóhűtő alkalmazása mellett történő hasításával, majd a felszabadult NO kemilumineszcenciás detektálásával határozzuk meg. A berendezés leírása (1134-1 ábra). 500 ml-es, háromnyakú boroszilikát gömblombik, amelyet visszafolyóhűtővel és a következők feltétekkel szerelünk fel: az egyik oldalon gázbevezető csatlakozás, amelyen keresztül R argon gázt vezethetünk be kanülön keresztül, a másik oldalon szeptummal ellátott csavarmenetes csatlakozás, amelyen keresztül az összehasonlító oldatot és a vizsgálati oldatot juttatjuk be. A gömblombikot három sorbakapcsolt gázmosópalackhoz kötjük. Ezekhez két hidegcsapda csatlakozik, amelyek egy kemilumineszcenciás dekektorhoz kapcsolódnak. A csatlakozások szivárgásmentességét megfelelő csövekkel és kapcsoló elemekkel biztosítjuk.
4 Gázmosó palackok. Magasság: 24 cm, belső átmérő: 2,5 cm; belső cső: hossza 23 cm, belső átmérője 0,5 cm. Középre felhelyezett Rotulex állvány. Ki- és bemeneti torion csatlakozóval felszerelve. Kemilumineszcenciás detektor. Hidegcsapda. Magasság: 16,5 cm, belső átmérő: 4 cm, belső cső: hossza 14 cm, belső átmérője 1,3 cm. Ki- és bemeneti torion csatlakozóval felszerelve. Hűtő. Magasság: 21 cm, belső átmérő: 3 cm. Alul csiszolatos, felül torion csatlakozóval felszerelve. Lombik. Boroszilikát gömblombik, középen csiszolatos csatlakozóval, bal nyakán torion csatlakozóval, jobb nyakán 1,5 cm csavaros csatlakozóval felszerelve. Izotermikus lombik. Belső mélység: 22 cm, belső átmérő: 8 cm. Szeptum. Szilikon anyagú, átmérő: 14 mm, vastagság: 3,5 mm. Torion csatlakozó. Cső. Politetrafluoretilén FW teflon anyagú, belső átmérő: 3,2 mm, vastagsága: 0,8 mm. 1134.-1. ábra Az N-NO csoportok meghatározásához használt berendezés
5 A kemilumineszcenciás detektor előkészítése. A kemilumineszcencia detektort 48 órával a mérés előtt bekapcsoljuk és elindítjuk a vákuumszivattyút. A nyomásnak 0,5 Hgmm-nél kisebbnek kell lennie. Az oxigénszelepet 0,2 MPa nyomásra és 9,4 ml/perc áramlási sebességre állítva 1 órával a mérés előtt kinyitjuk. A gázmosó palack előkészítése. Minden gázmosó palackba R nátrium-hidroxid R vízzel készült, 300 g/l töménységű oldatának 30 ml-ét töltjük. A hidegcsapdák előkészítése. 120 ºC-os csapda: 250 ml R etanolt tartalmazó izotermikus (Dewar) palackba, faspatulával történő kevergetés közben, lassan folyékony nitrogént adagolunk addig, amíg sűrű, pasztaszerű anyagot nem kapunk. A hidegcsapdát a leírtak szerint készült izotermikus palackba helyezzük. 160 ºC-os csapda: 250 ml R 2-metilbutánt tartalmazó izotermikus (Dewar) palackba, faspatulával történő kevergetés közben, lassan folyékony nitrogént adagolunk addig, amíg sűrű pasztaszerű anyagot nem kapunk. A hidegcsapdát a leírtak szerint készült izotermikus palackba helyezzük. Az 500 ml-es boroszilikát gömblombik és a hűtő kiszárítása. 50 ml R etilacetátot R argon alatt visszafolyóhűtő alkalmazása mellett 1 órán keresztül forralunk, anélkül, hogy a rendszert a kemilumineszcenciás detektorhoz csatlakoztatnánk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagot R foszfor(v)-oxid jelenlétében, 60 ºC fokon, csökkentett nyomáson 12 órán keresztül szárítjuk. 0,10 g szárított anyagot 1,0 ml R szulfamidsavas formamidban oldunk. A kapott oldatot 30 percig rázatjuk. Összehasonlító oldat. 0,1 ml R nitrozo-dipropil-amin oldatot 6,0 ml R etanollal hígítunk. Ezen oldat 0,1 ml-ét 1,0 ml R szulfamidsavas formamiddal hígítjuk. (Az így kapott oldat 0,05 ppm N-NO-csoporttal egyenértékű). 50 ml R szulfamidsavas etil-acetátot a száraz, 500 ml-es, szeptummal ellátott boroszilikát gömblomikba töltünk. A gömblombikot az előzőleg 2 órán át 15 ºC-ra hűtött visszafolyó hűtőhöz kötjük. Az R argon kanült a berendezéshez kötjük és az áramlási sebességet 0,1 liter/perc-re állítjuk be. A rendszer szivárgásmentességét ellenőrizzük. Csak a kemilumineszcenciás detektor felé vezető összekötést hagyjuk nyitva, hogy a túlnyomást elkerüljük.
6 Az R szulfanilsavas etil-acetátot felforraljuk. A berendezést a kemilumineszcenciás detektor szelepének lassú elzárásával vákuum alá helyezzük. Ezzel egy időben megszorítjuk a kemilumineszcenciás detektor bemeneti csövét. A kiegyenlített rendszerben a vákuum eléri a 4 Hgmm nyomást. A kemilumineszcenciás detektor jelét a nullázóval a rekorder teljes skálaszélességének 10%-ára állítjuk be. Az 500 ml-es boroszilikát gömblombik szeptumán keresztül sorban injektálunk 0,5 ml R vizet, 2,0 ml R hígított hidrogén-bromid oldatot, majd újabb 2,0 ml R hígított hidrogén-bromid oldatot, figyelve arra, hogy a rekorder írója minden injektálás után térjen vissza az alapvonalra. A lombikba előbb 50,0 μl összehasonlító oldatot, majd amikor a rekorder írója visszatér az alapvonalra, 50,0 μl vizsgálati oldatot injektálunk. Kiszámítjuk a vizsgálandó anyag N-NO-csoport tartalmát. Szabad szulfát: legfeljebb 0,5%; folyadékkromatográfiás meghatározást végzünk (2.2.29); vezetőképességi detektorral felszerelt berendezést használunk. Vizsgálati oldat. 30,0 mg vizsgálandó anyagot R vízzel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 1,4784 g R vízmentes nátrium-szulfátot R vízzel 1000,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R desztillált vízzel 200,0 ml-re hígítjuk (5 ppm szulfátion). A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei: 50 mm hosszú és 4,6 mm belső átmérőjű anioncserélő oszlop; kémiai semlegesítő rendszer: az aniondetektorhoz áramló mozgófázissal párhuzamosan elhelyezett semlegesítő mikromembrán; az oszlopot 1,91 g R dinátrium tetraborát 1000 ml R vízzel készült oldatával mint mozgófázissal 15 percig átáramoltatjuk, majd 0,5 perc alatt 0,1 M nátrium hidroxid oldatra váltunk; ezzel az oldattal 10 percig eluálunk, majd 0,5 perc alatt visszaváltunk a kiindulási körülményekre; az áramlási sebesség 1,0 ml/perc;
7 detektor, 30 μs érzékenységgel. A kémiai semlegesítőszert, amely R tömény kénsav 2,45 g/l töménységű oldata, 4 ml/perc-es sebességgel ellenáramban folyamatosan áramoltatjuk. Minden oldatból 50 μl-t injektálunk. Az összehasonlító oldat kromatogramján egy főcsúcs jelenik meg, amely a szulfátionnak felel meg (retenciós ideje kb. 7,5 perc). Szükség esetén az előírt retenciós idő elérése érdekében a mozgófázis összetételén változtatunk. Kiszámítjuk a vizsgálandó anyag szulfáttartalmát.