Mikrobiális aktivitás mérése talajban CO 2 -termelés alapján

Átírás

1 Mikrobiális aktivitás mérése talajban CO 2 -termelés alapján Laborgyakorlat Összeállította: Gruiz Katalin, Molnár Mónika, Klebercz Orsolya, A mérés célja Laborkísérletekre van szükség annak megállapítására, hogy a talajban lévő mikroflóra működőképes és aktiválható-e, és ha igen, milyen módon (levegőztetés, olajbontó baktériumok talajhoz keverése, tápanyagkiegészítés stb.) A laborgyakorlat során két, ennek az igénynek a kielégítésére szolgáló mini-reaktoros gyorstesztelő módszert ismerünk meg. Mindkét, viszonylag egyszerű talajlégzésmérőrendszer alkalmas mind a talajok állapotának, mind a talajszennyező szénhidrogének bonthatóságának megítélésére, mind pedig a remediációhoz használható technológia vizsgálatára. A talaj állapota, aktivitása úgy jellemezhető talajlégzési teszttel a legegyszerűbben, hogy a megfelelően előkészített és levegőztetett talaj széndioxid termelését folyamatosan mérjük. A termelt széndioxid abszolút mennyisége is alkalmas durva jellemzésre, de a folyamat dinamikáját jobban jellemzi az a módszer, amit Torstensson (1994) javasol. A talajlégzés folyamatos mérése közben bontható szubsztrátot adagolunk a rendszerhez. A pillanatszerű beadagolás hatására bekövetkező légzésintenzitás növekedést a széndioxid termelés időgörbéjének meredekségével lehet jellemezni. A széndioxid termelés alapján mért talajlégzés mind tiszta, mind szennyezett talajok esetében jellemzi a talaj állapotát. A dinamikus vizsgálat szintén alkalmas mind tiszta, mind szennyezett talajok jellemzésére, várható viselkedésük vizsgálatára. A légzést mérő tesztrendszer segítségével az alkalmazástól függően választ kaphatunk a következőkre: szennyezett-e a talaj, toxikusan hat-e a szennyezőanyag, vagyis gátolt-e a mikróbák működése vagy sem, adaptálódott-e a mikroflóra és aktívan működik-e, aktiválható-e a mikroflóra, ha aktiválható a mikroflóra, milyen technológiai paraméterekre van szükség az optimális működéshez. A termelődött CO 2 mennyisége arányos az elbontott szénhidrogén mennyiségével, a biológiai oxidáció mértékével, tehát a rendszer alkalmas, mind a talaj biológiai állapotának felmérésére, mind a biodegradáció folyamatának jellemzésére és követésére. A szénhidrogén vagy más szerves szennyezőanyag típusából, a talaj fajtájából, a szennyezőanyag korából és koncentrációjából adódó különbségek kimérésére is alkalmazható a mérőrendszer.

2 A technológiát tekintve válasz kapható például arra (levegőztetett rendszer esetében) hogy milyen mértékű levegőztetésre van szükség a mikroflóra aktiválásához. Szükség van-e tápanyag adagolásra (N-, P-forrás), szükségesek-e adalékanyagok (pl. hozzáférhetőséget javító anyagok). Karbonátos talajok esetén a felszabaduló CO 2 zavarhatja a mérést. A gyakorlat során kis térfogatú reaktorokban vizsgáljuk a szennyezetlen és szénhidrogénekkel szennyezett talajok biológiai állapotát, valamint a levegőztetés hatását szennyezett talajokra CO 2 termelés alapján. A két vizsgált mérőrendszer közti legfontosabb különbség, hogy az első módszer zárt közegben, míg a második átlevegőztetett rendszerben vizsgálja a talaj aktivitását. 1. Talajlégzés mérése zárt palackban - Az OxiTop légzésmérő rendszer 1.1. A mérés elve A teszt a manometrikus oxigén-meghatározás elvén alapul, melynek lényege, hogy az élő szervezetek az O 2 elfogyasztása mellett, széndioxidot állítanak elő. Az utóbbi gázt megköti egy abszorpciós szer, és ennek eredményeként nem szabad gázként jelenik meg, amiből következően a nyomás megváltozása kizárólag az oxigénfogyasztásra vezethető vissza, amit manometrikusan mérünk. Az oxigénfogyasztás manometrikus méréséhez a következő feltételeknek kell teljesülnie: A (biológiailag aktív) mintának gázt át nem eresztő edénybe zárva kell lennie. A minta fölött levegővel töltött, megfelelően méretezett gáztérnek kell rendelkezésre állnia, amely korlátozás nélkül biztosítja a biológiai lebontáshoz szükséges oxigént. A mérőedényben a széndioxid megkötésére szolgáló abszorpciós szert kell elhelyezni olyan módon, hogy az ne kerülhessen érintkezésbe a mintával. A reakciós edényen megfelelő nyomásmérő berendezést kell elhelyezni. A reakciós edényt a mérés közben állandó hőmérsékletű helyen kell tartani Az OxiTop Control zárt palackos légzésmérő rendszer jellemzése Az alkalmazott OxiTop Control készülék légzésintenzitás változások mérésére alkalmazható. A rendszer a mintában lévő élő mikroorganizmusok aerob légzése során felhasznált oxigén fogyását, és az ezzel arányosan növekvő, kilélegzett szén-dioxid mennyiségét követi nyomon. A szén-dioxid a talajminta fölötti légtérbe kerül, ahol egy NaOH-ot tartalmazó edény található, a keletkező szén-dioxid megkötésére. Mivel az oxigén fogy, és a keletkező széndioxidot pedig elnyelődik, ezért az edény légterében a légzés hatására nyomáscsökkenés figyelhető meg, amit a mérőfejben elhelyezett nyomásmérő mér. A készülék vezérlése és az információk lekérdezése a Control Panel-lel történik. A Control Panel infravörös jelekkel képes kapcsolatot teremteni a mérőfejekkel.

3 1.3. Szükséges eszközök, anyagok 1. OxiTop-C mérőfejek 2. OxiTop OC110 Controller 3. ACHAT OC PC kommunikációs szoftver 4. AK 540/B típusú adatátviteli vezeték RS 232 porthoz 5. Mérőedények 6. Nátriumhidroxid 7. Környezeti minta (pl.talaj) Egy összeállított rendszer felépítését mutatja az 1. ábra. 1. ábra. A zárt palackos OxiTop Control talajlégzésmérő rendszer 1.4. A mérés kivitelezése A mintatartó edényekben (500 ml) elhelyezzük a talajmintákat (100 g), majd hozzáadjuk a szükséges adalékanyagokat. Ezután az edényben elhelyezett anyagokat homogenizáljuk, majd csatlakoztatjuk a NaOH tartó edényt. Ebbe az edénybe ~ 1 g szilárd NaOH-ot mérünk be. A NaOH tartó csavarosan illeszkedik a fedélhez. A NaOH-os edények csatlakoztatása után rögzítjük a tömítéseket csavaros technikával. A Control Panelen már ezt megelőzőleg be kell állítani a mérési módot, időt és a méréshatárt. A megfelelő beállítások ellenőrzése után elindíthatjuk a mérést, mégpedig úgy, hogy a Control Panel-t megfelelően közel (kb. 40 cm távolságba) helyezzük a mintatartó edényhez, hogy az infravörös kapcsolat létrejöjjön. A kapcsolat tényleges létrejöttét a mérőfejen piros fény felvillanása jelzi. A mérés ideje alatt állandó hőmérsékletet, és napsugárzástól mentes környezetet kell biztosítani, mert ezek mind hatással vannak a mért nyomásértékekre. A változásokat az idő függvényében rögzíti a készülék, az időadatokat percekben jeleníti meg. A mért adatokat az adatátviteli vezeték segítségével továbbíthatjuk a számítógépre egy a készülékhez tartozó számítógépes szoftver segítségével, majd Excel táblában elvégezhetjük a kiértékelést.

4 A talaj-mikrokozmosz kísérleteink során nyomásváltozást mértünk, mely a talaj mikroflóra aerob légzése során felhasznált oxigénfogyásból adódik. A zárt palack tesztet alkalmazó talajlégzés mérés főbb paraméterei Mérőedény (reaktor) térfogata: Talajmennyiség a reaktorban: 500 ml 100 g Talajminták nedvességtartalma: % Hőmérséklet: Mérési mód: Méréshatár: Mérési idő: NaOH mennyiség: 1.5. Az eredmények értékelése 25 o C nyomásváltozás Δp [hpa] 300 hpa 5 nap 1,5 g Az OxiTop mérőfej öt napon keresztül, öt percenként rögzíti a palackban uralkodó nyomás értékét. Mivel a tesztedényt állandó hőmérsékleten tartjuk, ezért a nyomásváltozás elvileg kizárólag a talaj légzése során termelődött, és a NaOH által elnyelt szén-dioxid mennyiségével arányos. A kiértékelés szemléltetésére egy, különböző szerves szennyezőkkel kezelt kísérlet talajainak teszteredményeit közöljük. kontroll dízel friss dízel régi 50 pakura friss pakura régi p [hpa] idő [min] 2. ábra. Nyomáscsökkenés az 5 napos zárt palack teszt során Az eredményekből a következő következtetések vonhatók le: 1. A mindegyik görbén megjelenő nyomáscsökkenés azt mutatja, hogy a szennyezőanyagok gyors biodegradációja elkezdődött.

5 2. A meredeken induló görbék azt mutatják, hogy a dízelolaj sokkal gyorsabban és könnyebben bontható a mikróbák számára, mint a nagy mólsúlyú pakurakomponensek. 3. A frissen szennyezett talajban gyorsabban bontják a szennyezőanyagot a mikrobák, mint a régebben szennyezett talajban. Gyorsabban aktiválódnak a szénhidrogénbontó mikroorganizmusok a friss szennyeződések esetében, hiszen nagyobb a hozzáférhető frakció, míg a régi szennyeződés esetén feldúsultak a nehezebben bontható, kevésbé hozzáférhető komponensek. 4. Ugyanakkor a nagymértékű a nyomáscsökkenés a dízelolajjal régóta szennyezett talajban is, ami az adaptálódott mikroflóra jelenlétét és aktivitását mutatja. 5. A szennyezett területről származó, régi, koros szennyeződést tartalmazó pakurával szennyezett talajnak még a kontroll talajénál is kisebb az aktivitása, ami arra utal, hogy szénhidrogének már biológiailag nem vagy nehezen hozzáférhetőek, a mikroflóra aktivitásának növelésére van szükség. A nyomásértékek jól szemléltetik a talajokban zajló különböző folyamatok eredményét, a mikroflóra adaptációs képességét. A könnyebben bontható dízelolajhoz gyorsabban adaptálódtak a mikroorganizmusok; nagyobb a mikrobiális aktivitás, (nagyobb az oxigénigény és ezzel együtt a nyomáscsökkenés) ezekben a talajokban. (A dízeolajjal szennyezett mintáknál megfigyelhető hogy a mérőedénybe helyezett NaOH kimerülése miatt nem nyelődött el a CO 2, ezért nem tudott tovább csökkenni a nyomás. Ilyen nagy légzésintenzitásnál több NaOH-ra van szükség.) 2. Talajlégzés mérése átlevegőztetett rendszerben 2.1.A mérés elve A bemutatott mérési eljárás azon alapul, hogy a vizsgálni kívánt talajrészletet CO 2 -mentesített levegővel levegőztetjük át. Így a reaktorból távozó levegő széndioxid-tartalma teljes mértékben a talajmikroflóra tevékenységéből származik. A keletkezett szén-dioxidot elnyeletjük, mennyiségét titrimetriásan határozzuk meg. 2.2.A mérőrendszer összeállítása A mérőrendszer szénhidrogénekkel szennyezett talajok mikrobiológiai állapotára ad felvilágosítást. Segítségével megállapítható, hogy van-e a talajban működőképes mikroflóra, a mikroflóra aktiválható-e a technológiai paraméterek megváltoztatásával (pl. levegőztetéssel, hozzáférhetőséget fokozó adalékanyagok adagolásával). A talaj származhat szennyezett területről, de vizsgálhatunk mesterséges szennyezett talajokat is.

6 1. ábra: A mérőrendszer összeállításának elve és gyakorlati megvalósítása A talajlégzést vizsgáló tesztrendszerben központi szerepe van egy folyamatosan levegőztethető 1100 cm 3 hasznos térfogatú üvegreaktornak. Az üvegreaktor aljára kavicsréteget, erre pedig vászonlapot teszünk a levegőztető eldugulásának elkerülésére. A reaktor tetejéhez gumidugó, üvegcső és gumicső segítségével csatlakozik a vízsugárszivattyú, melynek segítségével levegőt áramoltatunk át a rendszeren. A talajjal töltött reaktoron való áthaladás előtt kétszeres, lúgban történő elnyeletéssel, eltávolítható a levegő CO 2 tartalma.

7 Így titrálás során már csak azt a CO 2 -t mérjük, amely a mikroorganizmusok életműködéséből származik, tehát az olajbontást jellemzi A mérés kivitelezése A mérés során általában szennyezett talajokat vizsgálunk. Az oszlopreaktorba töltött vizsgálandó talajjal elindítjuk a levegőztetést. A CO 2 termelődés felfutását és állandósult állapotát mérhetjük megfelelő gyakorisággal végzett CO 2 meghatározással. Feldatok: 1. A szennyezett talaj levegőztetése 2. A termelt CO 2 mennyiségének meghatározása CO 2 mennyiségi meghatározása A meghatározás gázanalitikai módszerrel, sav-bázis titrálással történik. A CO 2 elnyeletését 150 cm 3 -es gázmosópalackban, 100 cm 3 1 mólos NaOH oldatban végezzük. Az elnyeletés után a lúgoldatból 10 cm 3 térfogatú mintákat titrálunk. 3 párhuzamos mérést végzünk. A titrálás menete: A mintát 3 csepp fenolftalein indikátor jelenlétében 0,1 mólos HCl oldattal halványrózsaszínig titráljuk. A reakciók: NaOH + HCl = NaCl + H 2 O Na 2 CO 3 + HCl = NaCl + NaHCO 3 Majd 3 csepp metilvörös indikátor jelenlétében hagymaszínig titráljuk a bürettában levő 0,1 mólos faktorozott HCl-val. A végpont előtt az oldatot kiforraljuk, majd hűtés után tovább titráljuk hagymaszínig. NaHCO 3 + HCl = NaCl + H 2 O +CO2 Megjegyzés: Fontos, hogy a titrálást viszonylag alacsony hőmérsékleten (15 o C körül), az erős rázogatást kerülve végezzük Az eredmények értékelése A vizsgált talajok biológiai állapotát jellemezzük és összehasonlítjuk széndioxid termelésük alapján. A Jegyzőkönyvvel szemben támasztott követelmények A jegyzőkönyvnek mindkét mérés esetében tartalmaznia kell az alábbiakat: A vizsgálat célja, alkalmazhatósága A mérés menete, készülékrajz A vizsgálat során kapott és számított adatok alapján a szennyezett talajok értékelése és jellemzése