A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS A KOMBINÁLT CD/UV

A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS A KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN PH.D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI HORVÁTH PÉTER TÉMAVEZETŐ: DR. GERGELY ANDRÁS A KÉMIAI TUDOMÁNY KANDIDÁTUSA SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST DOKTORI ISKOLA PROGRAM: A GYÓGYSZERÉSZETI TUDOMÁNYOK KORSZERŰ KÉRDÉSEI GYÓGYSZERÉSZI KÉMIAI INTÉZET 2000

A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN Írta: Horváth Péter Témavezető: Gergely András, a kémiai tudományok kandidátusa Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 2000 Program:A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai A kiroptikai spektroszkópia dinamikusan fejlődő területe a kiroptikai analízis. Korábban ezt a módszert elsődlegesen molekulák szerkezetének meghatározására alkalmazták, azonban napjainkban egyre nő az igény -elsősorban a gyógyszeripar részéről- az enantiomer tisztaság precíz meghatározására. Az elválasztástechnikai eljárások egyre gyakrabban alkalmazzák a kiroptikai detektálást, amely módszer egyik legfontosabb előnye, hogy királis anyagok szelektív mérését teszi lehetővé, továbbá az, hogy segítségével az enantiomer arány az izomerek elválasztása nélkül is meghatározható. Célkitűzéseink között szerepelt, hogy -a technikai feltételek megteremtése után- új módszerek kifejlesztésével a kiroptikai spektroszkópia gyógyszeranalitikai lehetőségeire felhívjuk a figyelmet. Legfontosabb eredményeink közé soroljuk, hogy Magyarországon elsőként, de nemzetközi viszonylatban is az elsők közt oldottuk meg a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia /HPLC/ és a cirkuláris dikroizmus /CD/ spektroszkópia, mint detektálási eljárás összekapcsolását. Fentiek eredményeként az elválasztástechnikában általánosan alkalmazható csúcshomogenitás vizsgáló módszer kidolgozására nyílt lehetőség, amely a szimultán kettős CD/UV detektáláson és az azt követő hányadosképzésén alapuló vizsgáló eljárás. A módszer továbbfejlesztésével átfedő kromatográfiás csúcsok dekonvolucióját is sikerült elvégezni. Szintén a csúcshomogenitás ellenőrzésére alkalmas a CDspektrumok nagy sebességgel történő regisztrálása, amely eljárás a látszólag homogén kromatográfiás csúcsok esetében is jól alkalmazható. A fentiek mellett számot adok a CD spektroszkópia közvetlen alkalmazási lehetőségeiről is, mint például kémiai egyensúlyok vizsgálatáról és egy új elven alapuló, enantiomer tisztaság meghatározásra alkalmas módszerről is. 1

Method developments and applications of cicular dichroism and simultaneous dual CD/UV spectroscopy in analytical chemistry PÉTER HORVÁTH SEMMELWEIS UNIVERSITY, DEPARTMENT OF PHARMACEUTICAL CHEMISTRY TUTOR: ANDRÁS GERGELY C.SC. SEMMELWEIS UNIVERSITY, SCHOOL OF PH.D. STUDIES PROGRAMME: RECENT TRENDS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES CIRCULAR DICHROISM (CD) IS ONE OF THE FEW SENSITIVE INDICATORS OF MOLECULAR CONFIGURATION. CD SPECTROSCOPY HAS THEREFORE LONG BEEN USED FOR STRUCTURE ELUCIDATION. RECENT TRENDS SHOW, HOWEVER, AN ENORMOUS PROGRESS OF CD SPECTROSCOPY IN ANALYTICAL CHEMISTRY, EITHER AS AN INDEPENDENT METHOD, OR AS A DETECTOR IN HYPHENATED SEPARATION TECHNIQUES. ITS USES BECAME ESPECIALLY WIDESPREAD IN PHARMACEUTICAL ANALYSES, SINCE ENANTIOMERIC PURITY IS A CRUCIAL CRITERION OF DRUG QUALITY. Objectives of the present Ph.D. work included fundamental research in CD and related methodologies, but also, its applications in pharmaceutical analysis. A technical prerequisite of our research work was the instrumental hyphenation of separation and chiroptical detection techniques, which has been achieved by the combination of high performance liquid chromatographic and circular dichroism spectroscopic devices. Our home-built apparatus was the first HPLC-CD instrument in Hungary. Its uses allowed the elaboration of a new method for the determination of peak homogeneity, which applies simultaneous, dual CD/UV detection, and a subsequent ratio-formation. An improved version of this method resulted in the deconvolution of overlapping chromatographic peaks. Another type of peak homogeneity control method was elaborated by rapid, on-line recording of CD spectra in the progress of elution, in order to analyse apparently homogeneous peaks. Circular dichroism has also been applied to quantitate enantiomeric purity in composite samples without any separation of the analytes, and also, to determine equilibrium constants of protonating chiral compounds. 2

BEVEZETÉS Napjaink gyógyszeriparában jelentős szemléletváltozásnak lehetünk tanúi a királis gyógyszeranyagok és ezen belül is az enantiomer molekulák vonatkozásában. Egyre nagyobb az igény mind a gyártás közbeni, mind pedig a hatósági ellenőrzés során, hogy a gyógyszeranyagok királis tisztaságát szelektív módszerekkel lehessen meghatározni. A legelterjedtebben használt technika erre a célra a királis elválasztástechnika. Az elválasztástechnikában leggyakrabban használt detektorok azonban nem képesek a meghatározandó anyagok királis tulajdonságait mérni, hanem valamilyen más fiziko-kémiai tulajdonság alapján detektálják az anyagokat. A legspecifikusabb detektálási módszer királis anyagok meghatározása során a kiroptikai detektálás. A kiroptikai detektorok elterjedésének azonban gátat szabott azok viszonylag magas ára és a gyakran nem megfelelő érzékenység, valamint az a tény, hogy a műszergyártó cégeknek a viszonylag szűk körű érdeklődés miatt nem érte meg kiroptikai detektorokat fejleszteni. Ez a trend manapság megfordulni látszik és egyre nő az igény az ilyen jellegű készülékek iránt. A műszergyártó cégek közül a japán Jasco cég felismerve ezt az igényt 1998-ban hozta forgalomba az első, kereskedelemben is beszerezhető cirkuláris dikroizmus (CD) mérésén alapuló detektorát. Korábban csak a CDspektropolariméterek részleges átalakításával lehetett HPLC-CD detektorokhoz jutni. 3

CÉLKITŰZÉSEK Az Intézetünkben üzemelő Jasco J-720 típusú CDspektropolariméter adottságait, technikai lehetőségeit megismerve célul tűztük ki, hogy: 1 kiaknázzuk a szimultán kettős CD/UV spektroszkópia nyújtotta lehetőségeket, 2 megvizsgáljuk a CD spektroszkópia alkalmazási lehetőségeit egyensúlyi vizsgálatok során, 3 megvalósítsuk a műszer összekapcsolását a nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal és a műszert, mint kiroptikai detektort alkalmazzuk. A kiroptikai detektort konkrét célfeladatok elvégzéséhez kívántuk használni, ezért fontosnak tartottuk a módszer korlátainak, általános felhasználási lehetőségeinek feltérképezését. Új, az irodalomban még részletesen le nem írt módszerről van szó, ezért elsődlegesen- általánosan használható elvek kidolgozására kívántunk hangsúlyt helyezni. A műszer technikai adottságait kihasználva meg kívántuk vizsgálni a nagysebességű, on-line spektrumfelvételekkel a kromatográfiás elválasztás közben milyen körülmények között milyen információkhoz juthatunk. A szimultán, kettős detektálás egy új technika, amelynek használatával általánosan is alkalmazható csúcshomogenitási és dekonvoluciós eljárások kifejlesztésére nyílik lehetőség. 4

ALKALMAZOTT MÓDSZEREK CIRKULÁRIS DIKROIZMUS (CD) SPEKTROSZKÓPIA A vizsgált molekulák CD spektrumainak felvétele, elemzése. CD spektrumok ph függésének vizsgálata, protonálódási állandók meghatározása. Enantiomertisztaság közvetlen meghatározása kettős CD/UV spektroszkópiával NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Királis detektorral mérhető anyagok elválasztása normál és fordított állófázisú akirális valamint királis rendszerekben. HPLC-CD/UV MÓDSZER On-line, nagysebességgel történő spektrumfelvétel áramló rendszerből. CD spektrumok felvétele stop-flow módszerrel. Szimultán kettős CD/UV detektálás. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE - A kromatogramok kiértékelése a Borwin kromatográfiás szoftverrel, - A kettős detektálást követő hányadosképzés és a hányadoskromatogram előállítása valamint az alapvonal korrekció a Microsoft Office 97 Excel programjával, - Az egyensúlyi (protonálódási) állandók meghatározása és a statisztikai paraméterek számolása a STATISTICA 5.0 programcsomaggal történt. 5

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK EGYENSÚLYI /PROTONÁLÓDÁSI/ ÁLLANDÓ MEGHATÁROZÁSA Meghatároztuk a fenilglicin és a mandulasav protonálódási állandóit. A mandulasav esetében kapott 3,18-as érték valamint a fenilglicin esetében kapott 9,09-es és 1,77-es érték jó egyezést mutat a szakirodalomban fellelhető állandókkal. Méréseink esetében nagy hangsúlyt kapott az a tény, hogy a protonálódó csoportok közvetlenül a kromofór csoporttal szomszédos királis szénatomhoz kapcsolódnak és így a királisan perturbált kromofór csoport változását lehet a CD spektrumokon követni. Fenti mérésekkel optimalizálni lehetett az enantiomertisztasági vizsgálatok mérési körülményeit is. ENANTIOMERTISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA ALKALMAZÁSA NÉLKÜL, SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV SPEKTROSZKÓPIÁVAL Új, az irodalomban eddig még nem közölt eljárást dolgoztunk ki enantiomerek tisztaságának meghatározására. A módszer a kiroptikai és az UV abszorpciós jel egyidejű mérésén valamint a két jel hányadosának képzésén alapul. A kapott eredmények függetlenek -a hányadosképzésnek köszönhetően- a minta összkoncentrációjától valamint számos, az analitikus által elkövethető hiba lehetőségét kiküszöböli. A módszer alkalmazhatóságának előfeltétele, hogy rendelkezésre álljon legalább az egyik tiszta enantiomer. Meghatározva ennek a jellemző hányados értékét, a 6

másik izomer hányadosa egyértelműen megadható, mivel a hányadosok értéke abszolút értelemben megegyezik, előjelük viszont ellentétes. Az enantiomer összetétel és a hányados értékek között lineáris függvénykapcsolat van, az egyenes racém elegy esetében metszi az abszcisszát. Fontos, hogy a mintát ne szennyezze olyan komponens, amely a mérendő komponens kiroptikai és/vagy abszorpciós jelét zavarja. Zavaró komponens jelenlétében a módszert akirális kromatográfiával kombinálva lehet alkalmazni, ahol természetesen az enantiomerek elválasztása nem feladat, csak az egyéb szennyező komponensek szeparálását kell megoldani. A SZIMULTÁN KETTŐS DETEKTÁLÁS ALKALMAZÁSA ÁTFEDŐ KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSOK ANALÍZISÉBEN Hazánkban elsőként, de világszerte is az elsők között oldottuk meg a CD spektroszkópia és a HPLC összekapcsolását. A CD és UV kromatogramokból nyerhető un. Hányados kromatogram alkalmas a csúcshomogenitás ellenőrzésére. A kettős szimultán detektálás, bár elvét tekintve hasonló a diódasoros-detektoroknál alkalmazott módszerhez, annál azonban több információt nyújt. Királis anyagok, de leginkább enantiomerek esetében szelektivitása és specificitása pedig egyedülálló. A kromatográfiás hányadosképzés nem csak az átfedő csúcsok homogenitásának vizsgálatára, hanem azok dekonvoluciójára is alkalmas anélkül, hogy szükség volna a kromatogramok alakját leíró matematikai modellekre és azok paramétereinek becslésére. A hányadosképzésen alapuló 7

görbefelbontási eljárás matematikai levezetését szintén elsőként publikáltuk a nemzetközi és a hazai szakirodalomban. ON-LINE NAGYSEBESSÉGŰ CD SPEKTRUMFELVÉTEL ÁRAMLÓ KROMATOGRÁFIÁS RENDSZERBEN A diódasoros-uv detektoroknál alkalmazott eljárás analógiájára megvizsgáltuk a CD spektroszkópia lehetőségeit. Összevetettük a stop-flow és az on-line regisztrált CD spektrumok tulajdonságait. Megállapítottuk, hogy -a jel/zaj viszony alacsonyabb hullámhosszaknál történő csökkenése ellenére is- a nagy sebeséggel felvett spektrumok alkalmasak az anyagok azonosítására. Meghatároztuk a vizsgált modellanyagok esetében az optimális spektrumfelvételi paramétereket, mint pl. az alkalmazható hullámhossz tartományt és a spektrumfelvétel sebességét. A módszer segítségével látszólag homogén kromatográfiás csúcs esetén is ki tudtuk a mutatni szennyező anyagokat, a spektrumok kiválasztott hullámhosszainak hányadosait képezve a csúcshomogenitást nyomon lehetett követni. 8

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK 1. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Determination of enantiomeric purity by simultaneous dual circular dichroism and ultraviolet spectroscopy Talanta 44 (1997) 1479-1485105 2. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Characterization of Peak Purity by Fast Multiscan Circular Dichroism Detection Chromatographia 48 (7/8) (1998) 584-588124 3. Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Determination of Peak Homogeneity by Dual Detection Anal. Chem. 71 (8) (1999) 1500-1503 135 4. Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Deconvolution of composite chromatographic peaks by simultaneous dual detections J. Chromatogr. Sci. 38 (10) (2000) 425-429 181 9

AZ ÉRTEKEZÉSSEL ÖSSZEFÜGGŐ KÖZLEMÉNYEK 1 Horváth P., Gergely A., Noszál B: Characterization of lactate-guanidinium and lactate-lactate interactions in aqueous solution by spectropolarimetry J. Chem. Soc. Perkin (1996) 1419-1422 2 Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Enantiomer-tisztaság közvetlen meghatározása ellipticitás és abszorpció egyidejű mérésével Acta Pharm. Hung. 68 (1998) 249-254 3 Gergely A., Zsila F., Horváth P., Szász Gy.: Determination of absolute configuration of ketamine enantiomers by HPLC-CD-UV technique Chirality 11(10) (1999) 741-744 149 4. Zsila F., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.. Separation and identification of tofisopam stereoisomers by hyphenated HPLC-CD technique J. Liq. Chromatogr. 22 (5) (1999) 713-719 30 5. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Noszál B: Acid-base Properties of Biological Phenyl-alkyl-amines, Characterised by CD-pH titrations J. Chem. Res. (1999) 1331-1332 6 Gergely A., Hegedűs H., Horváth P., Noszál B., Szász Gy., Zsila F.: Újabb kiroptikai módszerek a gyógyszeranalízisben Acta Pharm. Hung. 69 (1999) 128-1347 5 7. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.: Determination of 4-3-ketosteroids based on oxime formation by difference circular dichroism spectroscopy Fresenius J. Anal. Chem. 368 (2000) 384-388 10

ELŐADÁSOK, POSZTERBEMUTATÓK 1. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Characterization of chromatographic peak purity by chiroptical methods. Balaton Symposium `97 on High Performance Separation Methods Siófok, 1997. szeptember 3-5 2. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Determination of chiral amines by 2,4-dinitrophenyl derivation and CD spectroscopy. 6 th International Conference on Circular Dichroism, Molecular Homochyrality Pisa, Italy 1997. szeptember 21-24 3. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Characterization of chromatographic peak purity by chiroptical-optical methods. 10 th International Symposium on Chiral Discrimination Vienna, Austria 1998. augusztus 30 4. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Determination of phenyl-alkyl-amine stereoisomers of related chiral and pharmacological properties. Interdisciplinary Symposium on Biological Homochirality Modena, Italy 1998. szeptember 6-12 5. Noszál B., Erdélyi M., Horváth P.: Individual chiroptical characteristics of unseparable triplet rota-microspecies. 10 th International Symposium on Chiral Discrimination Vienna, Austria 1998. augusztus 30 6. Noszál B., Erdélyi M., Horváth P.: Amino acid rota-microspecies: sovereign chiral entities. Interdisciplinary Symposium on Biological Homochirality Modena, Italy 1998. szeptember 6-12 7. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Átfedő kromatográfiás csúcsok felbontása szimultán kettős detektálással MTA Szerves és Gyógyszeranalitikai Munkabizottságának ülése Budapest, 1999. szeptember 30 8. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Kromatográfiás csúcshomogenitás kiroptikai meghatározása. MTA Elválasztástudományi (Kromatográfiai) valamint Szerves és Gyógyszeranalitikai Munkabizottságának Előadóülése Budapest, 1997. december 9 9. Horváth P., Gergely A.: Laktát ionok biomolekulákhoz történő kötődésének vizsgálata spektropolarimetriás módszerrel. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus IX. Budapest, 1993. szeptember 19-22. 10. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Takácsné Novák K., Noszál B.: Deprenil és más fenil-alkil-aminok protonspeciációja UV/CD-pH titrálással. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus X. Budapest, 1996. május 15-17 11. Gergely A., Hegedűs H., Horváth P., Noszál B., Szász Gy., Szentesi A., Zobin Á., Zsila F.: A CD detektálás néhány előnyös alkalmazása a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI. Siófok, 1999. október 6-10 11

12. Szentesi A., Gergely A., Szász Gy. Horváth P.: 4-3-ketoszteroidok differencia CD spektroszkópiás meghatározása MKE Fiatal Kémikusok Előadóülése Budapest, 1999. november 23 13. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Kiroptikai módszerek alkalmazása a kábítószerek analitikájában MKE Analitikai Napok Budapest, 1999 február 4 14. Gergely A., Horváth P., Noszál B.: A kiroptikai spektroszkópia analitikai alkalmazásai ennatiomerek tisztaságának meghatározására anizotropia faktor mérésével. MKE Vegyészkonferencia Eger, 1996. július 2-4 15. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Takácsné Novák K., Noszál B.: (-)Deprenil és más fenil-alkil-aminok speciációja valamint kiroptikai tulajdonságaik jellemzése UV/CD-pH titrálással. MKE Vegyészkonferencia Eger, 1996. július 2-4 16. Horváth P., Gergely A.: Enatiomertisztaság vizsgálata elválasztástechnika alkalmazása nélkül. II. Clauder Ottó Emlékverseny Budapest, 1994. július 21 17. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Takácsné Novák K., Noszál B.: (-)Deprenil és más fenil-alkil-aminok speciációja valamint kiroptikai tulajdonságaik jellemzése UV/CD-pH titrálással. III. Clauder Ottó Emlékverseny Budapest, 1996. szeptember 26-28 18. Horváth P., Gergely A., Noszál B., Szentesi A.: A CD/UV kettős detektálás néhány előnyös alkalmazási lehetősége MET. Elválasztástudományi vándorgyűlés Visegrád, 2000 november 8-10 19. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Mátyus P., Szász Gy.: Szteroid-oxim izomerek moláris CD és UV értékeinek meghatározása a vegyületek izolálása nélkül MET. Elválasztástudományi vándorgyűlés Visegrád, 2000 november 8-10 20. Gergely A., Horváth P., Noszál B.:Kiroptikai detektálás. Kromatográfiás Ankét `97 Budapest, 1997. november 28 21. Gergely A., Horváth P.: Some analytical application possibilities of circular dichroism to the analysis of drugs. III.Semmelweis Scientific Fair Budapest, 1994. április 2 22. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Takácsné Novák K., Szökő É., Noszál B.: Chiroptical characterization and speciation of (-)Deprenil and related phenyl-alkyl-amines by UV/CD-pH titration. V.Semmelweis Scientific Fair Budapest, 1996. szeptember 26 23. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Determination of chiral amines by 2,4-dinitrophenyl derivation and CD spectroscopy. VI.Semmelweis Scientific Fair Budapest, 1997. november 5-7 24. Horváth P., Gergely A., Noszál B.: Characterization of chromatographic peak purity by chiroptical-optical methods. VI.Semmelweis Scientific Fair Budapest, 1997. november 5-7 12

25. Zsila F., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.: Tofizopam sztereoizomerek CD-detektálással összekötött HPLC-s elválasztása. SOTE Gyógyszerészi Kémiai Intézete és az MGYT Gyógyszeranalitikai Szakosztály emlékülése Budapest, 1997. október 31 26. Hegedűs H., Gergely A., Horváth P., Noszál B.: Sanger reakció alkalmazása enantiomertisztaság meghatározására CD spektroszkópiás módszerrel. SOTE Gyógyszerészi Kémiai Intézete és az MGYT Gyógyszeranalitikai Szakosztály emlékülése Budapest, 1997. október 31 27. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Mátyus P., Szász Gy.: New data about oxime formation by 4-3-ketosteroids EUFEPS 2000, 2000. szeptember 16-19. Budapest 13