QUANTA Lite TM MPO 708700 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM MPO 708700 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM MPO egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a myeloperoxidáz (MPO) ellenes IgG autoantitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. Ez a teszt a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt felhasználható kiegészítő adatként bizonyos autoimmun vasculitisek diagnózisának felállítása során, mint amilyen a mikroszkopikus polyarteritis és a gyorsan progrediáló glomerulonephritis. A teszt összegzése és magyarázata Az anti-neutrophil cytoplasma antitestek (ANCA) kimutatása forradalmasította a különböző autoimmun vasculitisek diagnosztikáját és kezelését. 1-4 A panca és canca autoantitestekről bebizonyosodott, hogy klinikailag hasznos, és tudományos szempontból is érdekes az olyan betegségek felismerésében, mint a Wegener granulomatosis (WG) és a gyorsan progrediáló (crescent) glomerulonephritis. Legkevesebb hat azonosított ANCA antigén van már, és több olyan, amit még nem sikerült pontosan identifikálni. 1,5 Ezen antigének többsége valószínűleg a neutrophil sejtek primer granulumaiban található enzim. Ilyen enzim többek között a myeloperoxidáz (MPO), szerin proteáz 3 (PR-3), elasztáz, lactoferrin, cathepsin G és a kationos protein 57 (CAP-57). Korábbi öszefoglaló cikkekben megállapították, hogy a canca pozitív minták 80-90%-a PR-3 reaktivitással rendelkezik. 1,3 Az aktuális százalékos arány függ a vizsgált betegpopulációtól, és az alkalmazott ELISA eljárás minőségétől. Számos ELISA módszer a szilárd fázis bevonására használt «tisztított» antigénben szennyeződést tartalmazott, ami téves pozitív eredményekhez vezetett. A mi saját nagyon tiszta és specifikus ELISA módszerekkel végzett tanulmányainkban a gyakoriság többnyire az 50-60% tartományban volt. Az autoimmun vasculitisek területén jártas szakemberek többsége elsődleges szűrésre ma is az IFA használatát javasolja. Minden egyes IFA pozitív minta esetében viszont a specifikus MPO és PR-3 ELISA assay alkalmazása követéses vizsgálatra, további információt tud nyújtani. Egy újabb tanulmány, amelyben 277 WG beteget és1657 kontroll pácienst vizsgáltak, az anti-pr-3 antitestek specificitása WG vonatkozásában 98%-os volt. PR-3 kimutatható volt az aktív generalizált betegségben szenvedők 93%-ában, az aktív regionális betegségben szenvedők 60%-ában, és a remisszióban lévők 40%- ában. Kimutatták, hogy az autoantitestek változásai követik a betegség aktivitásának változását, és segítenek elkülöníteni a WG relapszust az egyéb intercurrens megbetegedésektől (például az infekcióktól) amelyek mindig veszélyeztetik az immunszupresszív kezelésben részesített betegeket. 6 Az anti-mpo antitestek igen specifikusak az idiopathiás és a vasculitissel kapcsolatos crescent glomerulonephritisre és a klasszikus polyarteritis nodosa, Churg-Strauss szindróma és a vese érintettség nélküli polyangitis overlap szindróma eseteire. 7-10 Ami az érzékenységet illeti, mind az MPO mind pedig a PR-3 antitestek megtalálhatók a betegek 77-100%-ában, idiopathiás és vasculitissel asszociált crescent glomerulonephritisben. A WG esetekben az anti-mpo antitestek csak ritkán mutathatók ki, és többnyire olyan betegekben, akik PR-3 antitest negatívak voltak. 7 Az MPO antitestek koncentrációja szignifikánsan nagyobb a bgetegség aktív fázisai alatt, a remisszió fázisában mérhető értékekkel összehasonlítva. 7 Ezért ezek az autoantitestek, mint amilyen a PR-3 antitest, a betegség aktivitási markereként használhatók. MPO és PR-3 ELISA módszerek nem helyettesíthetik az ANCA detektálására humán neutrophil sejteken végzett standard IFA vizsgálatot, mivel túl sok egyéb specifitás van, amelyek fontosak. Ez különösen igaz az atípusos vagy gyulladásos bélbetegség (IBD) esetében. ANCA található ulcerativ colitis és cholangitis sclerotisans eseteiben is. 4 Az MPO és PR-3 specifikus ELISA módszerek képesek az ismert antigének közül két fontosabbra vonatkozóan értékes megerősítő eredményt adni. Az ELISA ugyancsak hasznos az IFA vizsgálattal problémás minták interpretációja alkalmával is, például amikor több antitest szimultán jelenléte észlelhető, vagy túl nagy a háttér fluorescencia. Az ELISA technika, amit ebben a tesztben alkalmaztak, szenzitív, specifikus és objektív. Egyaránt kényelmesen használható nagy és kis mintaszám esetén is. A módszer elve Tisztított humán MPO antigént kötöttek mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához olyan körülmények között, ami képes az antigén natív állapotát megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az 1

egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő MPO antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított MPO antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán MPO antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. MPO ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum MPO ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. MPO ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum MPO ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kék színűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az MPO ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 11 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. 2

Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 MPO ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL MPO ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL MPO ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 3

1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, az MPO ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. Az MPO antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított MPO ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az MPO ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 4

5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az MPO ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az MPO ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított MPO ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított MPO ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. Az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. Az ELISA negatív kontroll és az MPO ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. Az MPO ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása kiszámítható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk az MPO ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x MPO ELISA mérs. poz. kontr. (egység) MPO ELISA mérs. poz. kontr. OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, 5

kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, gyengén pozitív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív 20 Gyengén pozitív 21 30 Mérsékelten pozitív - Erősen pozitív > 30 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában MPO antitestek vannak, és felveti bizonyos autoimmun vasculitisek, mint a mikroszkópikus polyarteritis és a gyorsan progrediáló glomerulonephritis fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs MPO antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM MPO ELISA kit használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott MPO eredmények ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek, köztük ANCA indirekt immunfluorescens vizsgálat eredményével együtt kell értékelni. 3. Az assay eredménye nem tekinthető diagnosztikai bizonyítéknak a betegség fennállása vagy hiánya tekintetében. Kizárólag egy pozitív teszt eredményre alapozva nem szabad immunszuppresszív kezelést indítani. 4. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A QUANTA Lite MPO ELISA teszt alkalmasságát a MPO antitestek detektálására egy kereskedelmi ELISA teszttel történt összehasonlítás segítségével vizsgálták. A másik ELISA módszer eredményeit a gyártó előírásainak megfelelően értékelték. Referencia tartomány Száz random szérum mintát vizsgáltak. Mindegyik minta eredménye az MPO teszt határértéke, azaz 20 egység alatt volt. A legnagyobb mért reaktivitás 13 egység volt. A minta-populáció átlagértéke 2.5 egység. MPO Autoantitestek különböző betegcsoportokban Csoport Esetszám Pozitívak száma (%) Normál 100 0 (0) Non-ANCA vesebetegség 66 1 (1.5) Wegener (canca Poz.) 43 1 (2.3) Gyorsan progrediáló glomerulonephritis 45 43 (95.6) (panca Pozitív) Mind a 100 normál minta negatív volt, a 45 panca pozitív gyorsan progrediáló glomerulonephritis esetből 43 volt pozitív. A 43 Wegener beteg között egy gyengén pozitívat találtak anti-mpo IgG antitestre. A «non- ANCA vesebeteg» csoportban 66 betegből egynek a mintáját találták pozitívnak. Ez utóbbi, 66 betegből álló csoportban a diagnózisok között előfordult anti-glomerularis basalmembran (GBM) betegség, Lupus glomerulonephritis, thromboticus microangiopathia, IgA nephropathia és immunkomplex betegség. Relatív szenzitivitás és specificitás A fentebb említett Wegener és gyorsan progrediáló glomerulonephritis csoportokból és a normál, valamint a 6

non-anca vesebeteg csoportokból származó 66 mintát is tesztelték a QUANTA Lite MPO IgG kittel, és egy másik, referens ELISA kittel, amelyben polivalens konjugátumot használtak. Az eredmények az alábbiakban láthatók : INOVA + - + 22 27* Relatív Szenzitivitás 44.9% Referens módszer Relatív Specificitás 99.4% - 1 156 Relatív Hatékonyság 86.4% * Ezeknek a mintáknak nagy többsége a non-anca vesebeteg csoportba tartozott. Precizitás és reprodukálhatóság Az assay precizitását és reprodukálhatóságát egy negatív, egy gyengén pozitív és egy erősen pozitív minta hat paralell vzsgálatával határozták meg, hat különálló sorozatban megismételve. Az átlagos reaktivitás az erősen pozitív mintában 100.9 egység volt, a gyengén pozitív minta átlaga 25.5 egység és a negatív mintáé 19.3 egység volt. Az alábbiakban összefoglalva láthatók a sorozatok standard deviációi és variációs együtthatói az egyes minták esetében. Negatív Erősen pozitív Gyengén pozitív SD CV SD CV SD CV Általános 1.14 5.9% 7.55 7.5% 1.40 5.5% Sorozaton belül 0.88 4.6% 2.11 2.1% 0.84 3.3% Sorozatok között 1.05 5.4% 8.09 8.0% 1.37 5.4% 7

Hivatkozások 1. Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11:161-174, 1991. 2. Specks U, et al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, 1989. 3. van der Woude FJ, et al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet 423-429, 1985. 4. Cohen-Tervaert JW, et al., Association between active Wegener s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149:2461-2465, 1989. 5. Cambridge, et al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33:668-679, 1992. 6. Nolle B, et al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, 1988. 7. Cohen-Tervaert JW, et al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arthritis and Rheumatism 33 (8):1264-1272, 1990. 8. Cohen-Tervaert JW, et al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37:799-806, 1990. 9. Falk RJ and Jenette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318:1651-1657, 1988. 10. Cohen-Tervaert JW, et al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, 1991. 11. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628700HUN May 2007 Revision HUN0 8