Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 Clone EP17/EP30 Kód: M3652 Felhasználási terület In vitro diagnosztikai alkalmazás. A Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, immunhisztokémiai felhasználásra szolgál. A citokeratin 8/18 ellenes antitestek hasznosak lehetnek epithelialis eredető daganatok azonosításában (1). A festıdés, illetve a festıdés hiányának klinikai értékelését morfológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett, és a páciens kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálati eredményeinek figyelembevételével patológus szakorvosnak kell végeznie. Az antigén szinonimái Keratin 8/18 (K8/18) (1), CK8/18 (2). Összegzés és magyarázat Biztosított reagens Immunogének Specifitás A citokeratin 8/18 (CK8/18) az intermedier filamentumok családjába tartozik, amely heteropolimer fehérjék egy változatos csoportja, és 54 különbözı génbıl áll. A citokeratin polipeptidek (CK-k) savas (I. típusú) és neutrálisbázikus (II. típusú) alcsaládokba oszthatók. Az I. és II. típusú polipeptidek egy párt alkotva építik fel az érett tetramer heteropolimert. A CK18 egy 45 kda-os CK, amely a I. típusú, savas CK alcsaládhoz tartozik, amely jellemzıen az 54 kda-os, II. típusú CK8 citokeratinnal kapcsolódik. A CK8/18 együtt az alacsony molekulasúlyú citokeratinok egyikét (LMW-CK) építik fel. A CK8/18 az egyszerő, nem többrétegő epitheliumokban, az átmeneti epithelium bazális és felszíni sejtjeiben, az összetett epitheliumok luminalis/szekretoros sejtjeiben, valamint a mezotéliumban expresszálódik, illetve jelen lehet bizonyos mesenchymális sejttípusokban is (1). Egy adott sejtben egy citokeratincsalád több tagja is expresszálódhat, és azok a sejttípusra, valamint a differenciáltsági állapotra jellemzıek (1). Majdnem minden epithelialis eredető karcinóma és mezotelióma expresszál CK8/18-at (2), és így a CK8/18 ellenes antitestek hasznos segítséget nyújtanak az ismeretlen eredető tumorok és a gyengén differenciált karcinómák osztályozásában (1). A CK8/18 elleni antitestek citoplazma- és/vagy membránfestıdési mintázatot mutatnak. Gyenge fokális expresszió jelen lehet mesenchymalis tumorokban, beleértve a leiomiómákat, a rabdomioszarkómát, a malignus melanómát, a schwannómát, a Ewing szarkómát, a dezmoplasztikus kis kereksejtes tumort, a pikkelysejtes karcinómát és a limfómát (3, 4). Az alábbi témakörök áttekintéséhez lásd a Dako Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványát, vagy az IHC eljárás detektálórendszerének útmutatóját. Két monoklonális nyúl antitest keveréke, (sejtkultúra felülúszó) 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó 0,05 mol/l koncentrációjú Tris-HCl, ph 7,2 oldatban. Ez a termék stabilizáló fehérjét tartalmaz. Klón: EP17 (CK8) és EP30 (CK18). Izotípus: Nyúl eredető IgG. Nyúl lgg koncentrációja mg/l-ben: Lásd az üveg címkéjén. A tételenkénti fehérjekoncentráció különbözhet, de ez nem befolyásolja az optimális hígítást. Minden egyes tétel titerét egy referenciatételhez hasonlították és annak megfelelıen állították be, hogy tételrıl tételre konzisztens immunhisztokémiai festési teljesítményt biztosítsanak. CK8: egy szintetikus peptid, amely megfelel a humán citokeratin 8 fehérje C-terminális részén lévı aminosavaknak. CK18: HT-29 sejtekbıl izolált humán citokeratin 18 fehérje. A CK8/18 két monoklonális antitest koktélja. Az A431 sejtlizátum Western blot vizsgálata során az anti-ck8, EP17 klón egy 52 kda-ból álló nagyobb sávot ismer fel, amely a CK8 várható molekulatömegének felel meg; és az anti- CK18, EP30 klón egy 45 kda-os nagyobb sávot ismer fel, amely a CK18 várható molekulatömegének felel meg. Óvintézkedések 1. Professzionális felhasználóknak. 2. A termék nátrium-azidot (NaN 3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, ami során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Kiöntéskor, a fémazidok vezetékekben történı lerakódását megelızendı, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni. 3. A biológiai anyagokból elıállított egyéb termékekhez hasonlóan ennél is ügyelni kell a megfelelı kezelési eljárások betartására. 4. A szemmel és bırrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelı személyi védıfelszerelést. 5. A fel nem használt oldatot a helyi és állami hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. (124407-002) P02831HU_02_M3652/2013.12 o. 1 /5
Tárolás 2-8 C hımérsékleten tárolandó. Az üvegen feltüntetett lejárati idı után nem használható fel. Ha a reagenseket a megadottól eltérı körülmények között tárolják, a felhasználónak ellenıriznie kell az adott körülmények megfelelı voltát. A termék instabilitásának nincsenek egyértelmő jelei. Ezért a páciens mintájával együttesen egy pozitív és egy negatív kontrollvizsgálatot is el kell végezni. Ha nem várt festıdés jelenik meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és antitesttel kapcsolatos probléma gyanítható, forduljon a Dako Mőszaki szolgálatához. Gyors útmutató* Lépés Megjegyzések Fixálás Formalin N/A Elıkezelés EnVision FLEX, High ph (kód: K8000/K8004) 20 perc HIER, 3 az 1-ben PT Link és PT Link Rinse Station használatakor Hígítás 1:50 20 perc inkubálás Hígítópuffer Dako Antibody Diluent (kód: S0809) Közvetlenül a felhasználás elıtt hígítandó Negatív kontroll Negative Control, Rabbit IgG (kód: X0936) 20 perc inkubálás Megjelenítés EnVision FLEX, High ph (kód: K8000/K8010) 20 perc inkubálás, 2x5 perc DAB+ inkubálás Kontrasztfestés EnVision FLEX Hematoxylin 5 perc inkubálás (kód: K8008/K8018) Kontroll szövet Normál máj Citoplazma/membránfestıdés Lemezek FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) A szövetmetszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítéséhez javasolt. Rögzítés Nem vizes, tartós rögzítıszer szükséges A festést követıen a metszeteket dehidratálni kell, meg kell tisztítani, majd tartós rögzítıszer használatával fel kell vinni a tárgylemezre. Készülék Autostainer Link 48 és Autostainer Plus Használja a készülékspecifikus üvegeket (kód: SK200-SK203 és S3425) *A felhasználónak mindig el kell olvasnia a terméktájékoztatót a festési eljárásra és a termék kezelésére vonatkozó részletes utasításokért. Minta-elıkészítés Paraffinba ágyazott metszetek: Az antitest formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek jelölésére használható. A szövetmintákból körülbelül 4 µm-es metszeteket kell készíteni. Elıkezelés: A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket elı kell kezelni hıindukált epitópfeltárási (HIER) technikával. A legjobb eredményeket a szövetek hígított EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (kód: K8004) reagenst alkalmazó HIER technikával történı elıkezelésével lehet elérni. A deparaffinálás, rehidratálás és epitópfeltárás végrehajtható a Dako PT Link (kód: PT100/PT101) használatával. A részleteket illetıen lásd a PT Link Használati útmutatóját. A PT Link készüléknél az alábbi paramétereket kell alkalmazni: Elıhevítési hımérséklet: 65 C; az epitóp feltáráshoz szükséges hımérséklet és idı: 97 C 20 (±1) percre; hőtés 65 C-ra. Vegye ki a tartóállványt a PT tartályából, és azonnal merítse a tárgylemezeket hígított, szobahımérséklető EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód: K8007) pufferoldatot tartalmazó edénybe/tartályba (pl. a PT Link Rinse Station (kód: PT109) edénybe). Hagyja a metszeteket 1-5 percen át a Wash Buffer pufferben. A szövetmetszeteknek a kezelés, illetve az azt követı immunhisztokémiai festési eljárás során nem szabad kiszáradniuk. A szövetmetszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítésére ajánlott a FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek használata. A festést követıen a metszeteket vízmentesíteni kell, meg kell tisztítani a reagens maradványoktól, majd tartós rögzítıszer segítségével fel kell vinni tárgylemezre. (124407-002) P02831HU_02_M3652/2013.12 o. 2 /5
Festési eljárás Festés értelmezése Hígítás: A Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, kód: M3652 termék esetében az ajánlott hígítási arány 1:50. Az antitestet Dako Antibody Diluent (kód: S0809) hígítószerrel hígítsa. Az elıkezelt szövetmetszeteket szobahımérsékleten 20 percig kell inkubálni. A fentiek csak irányelvekként szolgálnak. Az optimális körülmények a mintától és az elıkészítés módjától függıen változhatnak, ezeket az egyes laboratóriumoknak kell hitelesíteniük. Negatív kontroll: A javasolt negatív kontroll reagens a Dako Negative Control, Rabbit IgG (kód: X0936), amelyet a primer antitesttel megegyezı Ig-koncentrációban kell hígítani. Amennyiben a hígított antitest és a negatív kontroll stabilitását nem ellenırizték az adott festési eljárás során, hígítsa ezeket a reagenseket közvetlenül a használat elıtt. A páciens mintáival párhuzamosan pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell. Megjelenítés: Az ajánlott megjelenítı rendszer az EnVision FLEX, High ph (kód: K8000/K8010), 20 perces, szobahımérsékleten történı inkubációt használva. Kövesse a kiválasztott megjelenítırendszer(ek)hez mellékelt eljárási leírást. Automatizálás: Az antitest jól használható automatizált rendszerekkel, például Dako Autostainer, Autostainer Plus és Autostainer Link készülékkel végzett immunhisztokémiai festéshez, valamint PT Link készülékkel végzett elıfestéshez. Kontrasztfestés: A javasolt kontrasztfesték az EnVision FLEX Hematoxylin (kód: K8008/K8018). Az optimális eredmény elérése érdekében nem vizes alapú, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Kontrollok: Egyidejőleg pozitív és negatív kontroll szöveteket is vizsgálni kell, ugyanazt a protokollt alkalmazva, mint a páciensmintákhoz. A pozitív kontrollszövetnek tartalmaznia kell normál májszövetet, és a sejteknek/struktúráknak a Teljesítményjellemzık részben az adott szövettípusra vonatkozóan ismertetett reakciómintázatot kell mutatniuk. A sejtfestıdési mintázat citoplazmatikus / membránhoz kötıdı. (124407-002) P02831HU_02_M3652/2013.12 o. 3 /5
Teljesítményjellemzık Normál szövetek: Az epithelium sejtek közepes erıs citoplazmatikus és/vagy membránhoz kötıdı festési reakciót mutatnak (5). Meg kell jegyezni, hogy a retikuláris sejtek festıdése elıfordulhat a limfoid szövetekben. Mellékvese 3/3 Hasnyálmirigy 3/3 Csontvelı 0/3 Mellékpajzsmirigy 3/3 Emlı 3/3 Agyalapi mirigy 1/3 Kisagy 0/3 Prosztata 3/3 Nagyagy 0/3 Nyálmirigy 3/3 Méhnyak 1/3 Vázizom 0/3 Vastagbél 3/3 Bır 3/3 Nyelıcsı 3/3 Vékonybél 3/3 Szív 0/3 Lép 3/3 Vese 3/3 Gyomor 3/3 Máj 3/3 Here 2/3 Tüdı 3/3 Csecsemımirigy 3/3 Mezoteliális sejtek 2/3 Pajzsmirigy 3/3 Perifériás ideg 0/3 Mandula 3/3 Petefészek 3/3 Méh 1/3 Abnormális szövetek: Az epithelium sejtek közepes erıs citoplazmatikus és/vagy membránhoz kötıdı festési reakciót mutatnak (41/56) (6). Hepatocelluláris karcinóma 3/3 Melanóma 0/3 Világossejtes vesekarcinóma 3/3 Differenciálatlan karcinóma 1/3 Papilláris vesekarcinóma 3/3 Leiomioszarkóma (1) 0/1 Tüdı adenokarcinóma (2) 2/2 Rabdomioszarkóma (1) 0/1 Tüdı pikkelysejtes 1/1 Intesztinális karcinoid (2) 2/2 karcinóma (1) Kissejtes tüdıkarcinóma 3/3 Ovarium karcinóma (2) 2/2 Gyomor adenokarcinóma 3/3 Fibrotikus szövet (2) 0/2 Hasnyálmirigy adenokarcinóma Pajzsmirigy papilláris karcinóma Emlı ductalis karcinómája Emlı lobuláris karcinómája Prosztata adenokarcinóma Vastagbél adenokarcinóma 3/3 Teratóma - érett (1) 0/1 3/3 Teratóma - éretlen (1) 0/1 3/3 Leiomióma (2) 1/2 3/3 Diffúz nagy B-sejtes limfóma 0/2 (2) 2/3 T-sejtes limfóma (2) 0/2 3/3 Follikuláris limfóma (2) 0/2 (124407-002) P02831HU_02_M3652/2013.12 o. 4 /5
Irodalomjegyzék 1. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol 2008;129: 705-33. 2. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia,PA: Churchill Livingstone, 2002. 3. Adams H, Schmid P, Dirnhofer S, Tzankov A.Cytokeratin expression in hematological neoplasms: A tissue microarray study on 866 lymphoma and leukemia cases. Pathol Res Pract 2008;204:569-73. 4. Lane EB, Alexander CM. Use of keratin antibodies in tumor diagnosis (review). Semin Cancer Biol 1990; 1:165-79. 5. Yu J. Report of Normal Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19056. 6. Yu J. Report of Cancer Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19756. Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 (CK8/18), Clone EP17/EP30 has been created by Epitomics Inc., using Epitomics proprietary rabbit monoclonal antibody technology covered under Patent Nos 5,675,063 and 7,402,409. Kiadás dátuma: 14/04 (124407-002) P02831HU_02_M3652/2013.12 o. 5 /5