Az enzimes analízis helye és perspektívái a korszerű élelmiszeranalitikában* I. Az enzimes analízis elméleti alapjai TÖRLEY DEZS 6** és VÁMOSNÉ VIGYÁZÓ LI LL Y*** Érkezett: 978. november 5.. Bevezetés Az enzimológia fejlődése az élelmiszerkémiai és élelmiszertechnológiai ismeretek fejlődéséhez erősen kapcsolódott, talán azt is állíthatjuk, hogy ezen a tudományterületen tanulmányozták és használták először az enzimeket. A keményítő cukrosítása, a fehérjék bontása, a mandula emulzinjának hatása régen ismeretes, és már a múlt században sor került olyan analitikai eljárások bevezetésére, melyek indikátorszérűén mutatták egyes élelmiszerek hőkezelésének elégséges vagy elégtelen voltát. Századunkban az enzimes élelmiszer-analízis sokat fejlődött, de összefoglaló munka erről a területről csak 952-ben jelent meg, mikor Steifer () könyvében rendszerezve közölte az 950-ig megjelent ilyen tárgyú publikációkat. 2. Az enzimes analízis alkalmazási területe az élelmiszertudományban Az enzimek analitikai alkalmazhatósága két alapvető tulajdonságukra vezethető vissza: a) fajlagosságuk következtében olyan anyagok meghatározására is használhatók, amelyek elválasztása egyébként alig lehetséges vagy nagyon nehéz; b) az enzimek nagyon érzékenyek a környezeti tényezők, különböző kémiai és fizikai befolyások iránt. Ezért használhatók gátló vagy gyorsító tényezők vizsgálatára is. A felsorolt tulajdonságok azonban nemcsak az enzimes analízis előnyeit szabják meg, hanem a korlátáit is. Mivel az enzimek biológiai katalizátorok, olyan vegyületek analitikájára alkalmasak, amelyek az élő szervezetek anyagcseréjében előfordulnak. Ezen túlmenően vizsgálhatók enzimekkel olyan anyagok, amelyek a biológiai átalakulásokat befolyásolják. Az enzimek katalizátor voltából következik, hogy hatásuk megállapításához az egyes kémiai reakciók sebességét kell mérnünk, tehát szem előtt kell tartanunk a reakciókinetika törvényeit is. Az enzimek aktivitását is a katalizált reakció sebességével mérik; egysége az az aktivitás, mely percenként ^mol szubsztrátumot alakít át, lehetőleg szubsztráttelítettség mellett. * Elhangzott a M KE Biokémiai Szakosztálya, a M ÉTE és a M agyar K linikai Laboratórium i Diagnosztikai T ársaság Enzim es analízis és enzim diagnosztika kollokvium án. M átrafüred, 978. máj. 4 6. ** B udapesti Műszaki Egyetem Biokém iai és Élelm iszertechnológiai Tanszék. *** Központi Élelm iszeripari K utató Intézet, Budapest. 57
2.. Az enzimreakciók kinetikája Az enzimreakciók matematikai leírása ma is Michaelis és Menten (2), ill. Briggs és Haldane (3) levezetése alapán történik. Ez az elmélet feltételezi, hogy az enzim az S szubsztrátummal ES enzim - szuhsztrát komplexet képez, és a szubsztrátum átalakulásának sebessége arányos a komplex koncentrációjával. Az ES bomlása a sebességet befolyásoló lépés a termékképződés folyamatában. Egy-szubsztrátumos reakció esetén: K i K 3 E + S - ES - E + P () K 2 ahol: Kp K2 és K3 sebességi állandók, P a termék. Az enzimes reakciókat rendszerint a termék képződésének, vagy a szubsztrátum eltűnésének mérésével követjük. Fontos a reakció kezdeti sebességének mérése, mikor a szubsztrátum-koncentráció még nem csökkent számottevően, ill. nem képződött nagyobb mennyiségű gátló termék. Ha a reakció sebességét (v) a szubsztrátum-koncentráció [S] függvényében ábrázoljuk, hiperbolát kapunk, melynek egyenlete Vmax [S] Km + [S] + KM (2) ahol: Vmax és Km állandó. A Vmax maximális sebesség akkor érhető el, h a ----- Gyakorlatilag ez Km nem következik be. Nagysága függ az enzimkoncentrációtól, és úgy is definiálható, mint az a sebesség, mely akkor alakul ki, ha a teljes enzim-mennyiség ES alakban van. Km a Michaelis állandó, azt a szubsztrátum-koncentrációt adja meg, amelynél a reakciósebesség a maximálisnak fele: Vmax V = ----------- 2 Ez tehát az enzimnek a szubsztrátum iránti affinitását mutatja: minél kisebb Km - annál nagyobb az affinitás. Km függ a sebességi állandóktól is: ha k2» k3, akkor Km = Ks = KM = ^2 К k2 + k3 К К s = [S ] [ E ] [S ] Km értéke függ a hőmérséklettől, a ph-tól, a puffer minőségétől, effektoroktól stb., dimenziója mól dm-3. V m a x és Km meghatározható, ha a (2) egyenletet megfelelő átrendezés után ábrázoljuk. Legtöbbször Lineweaver és Burk (4) módszerét használják. A (2) egyenlet reciproka: _ Км [ 58 V V m a x [S ] V m a x L E S ] (3) (4)
Ez az у = ax + b típusú egyenes ábrázoljuk (. ábra). Ha egyenlete, értékét függvényében v [S] és =0, - [S] = К м - J [ S ] V V m a x Hofstee (5) szerint is lineáris összefüggés állapítható meg (2. ábra), mert a fentiek szerint V [S] + V К м = ^ гп ах [S] (6) V v + Km = Vmax (7) V V = - К M 72^ + V max b ] (8) kapunk. Ha a v-t ábrázoljuk V ~ függvényében, ismét у = a x + b típusú egyenest H a v -0, V - Vma\ [SÍ KM V ha 7Z 7 = 0, V = Vmax. LS] 7. ábra. A K m és Vm ax kinetikai állandók m eghatározása Lineweaver és B urk (4) szerint. [S] = a szubsztrátum koncentrációja, v = a reakciósebesség. A tengely-m etszet az ordinátán a m axim ális reakciósebesség (Vm ax) reciproka, az abszcisszán =. (K m = a Michaelis állandó). Km 2. ábra. A K m és Vm ax kinetikai állandók meghatározása Hofstee (5) szerint. A jelölések, m int у az 7. ábrán. A tengelym etszet az ordinátán = Vm ax) az abszcisszán = max Km 59
Az utóbbi szélső esetek közvetlenül is levezethetők a (2) egyenletből: ha [S]» Km. akkor v = V m a x, ha [S] «Km. akkor v = V m a x ~K^~ [S] és [S ] V m a x K^vT Az eddig tárgyalt folyamatok egy-szubsztrátumos reakciók voltak: S E, A több-szubsztrátumos reakciók esetében a viszonyok sokkal bonyolultabbak Vegyünk például egy két-szubsztrátumos folyamatot: P E2 S + S 2 -------- * Р г + Р 2, amelyben az enzim a szubsztrátum-molekulákkal biner és terner komplexeket képez. Ha feltételezzük, hogy a terner komplex bomlása termékké viszonylag lassan játszódik le és az egyes biner ES komplexek gyorsan képződnek, akkor v = + KaíSi ------- + [SJ V m a x Km s2 [ S 2] + KmSiSY [SJ [S2] (9) ahol KmSi az E S ^ ^ ES2 + S; Km s2 az ESíS2 ~ ESi + Sg, K m S i S2 az E S js g ES j+ Sj, E S 2 ä E + S 2, ill. E S ^ folyamatok megfelelő állandója. E S x + Sa, E S t = E + S x Ha [SJ» KmSi, akkor a (9) egyenlet egyszerűsödik: és megforditva. V m a x V m a x [ S 2] j Km s2 KaíS2+ [S 2] (0) + [S2] Az egyes szubsztrátumok nagy koncentrációját alkalmazva tehát a Michaelisállandók meghatározhatók. Ha [SJ «KmSj, akkor v = K m s 2+ V m a x [ S J KmSiS2 [S 2] ( ) 60
Ha viszont [Sj] «KvuSi és [S2]» KMSxSa, akkor v = V m a x [ S ] i ( 2) KmSi 2.2. Az enzimes analitikai meghatározások fontosabb típusai 2.2.. Metabolitkoncentrációk meghatározása (végp о n t a n a í z i s). Ha a S P átalakulás teljes, a végső értéket határozzuk meg. Ha S és P között van jellegzetes kémiai vagy fizikai különbség, a végpontot közvetlenül mérhetjük. Pl. a piridin-koenzimek 260 nm-en abszorbeálnak, redukált alakban 340 nm-en is. Ezáltal követhető a reakció minden beavatkozás nélkül! A 340 nm-en mért /Е alapján mind az oxidáció, mind a redukció követhető. Megfelelő redox-színezékek alkalmazásával a nikotinamid-koenzimtől függő reakciók a látható spektrumban is követhetők: a tetrazóliumsók redukciójával formazánok képződnek, ezeknek színintenzitása fotométerrel mérhető. Ha az enzimes reakció egyensúlya a termékmeghatározás szempontjából nem megfelelő, mellékreakció segítségével lehet eltolni az egyensúlyt a kívánt irányban, ill. a reakciót teljessé tenni. Vigyázni kell az enzimreakciók fajlagosságára. Enzimes szennyezés (idegen aktivitás) nem kívánt mellékreakciót okoz, de lehet a nem túl szigorú fajlagosság miatt a tiszta enzimnek is más szubsztrátumra ható mellék-aktivitása. 2.2.2. A z enzimaktivitás mérése. Az enzimaktivitás mérésekor - a szubsztrátum-meghatározással ellentétben - nagy szubsztrátum-koncentrációt, lehetőleg szubsztrát-telítettséget biztosítunk. dt (3) Az enzimkoncentrációt úgy kell beállítani, hogy a reakció lassú legyen, a szubsztrátumnak csak kis hányada alakuljon át. A reakció fotométeres követésekor extinkcióváltozást mérünk. Ha a változás lineáris, a mérési intervallumok tetszés szerint választhatók meg. Ha az átalakulás az időben görbe mentén játszódik le, rövid időközönként kell a mérést végezni. Az enzimes reakciók sebessége erősen függ a hőmérséklettől; a hőmérsékletkoefficiens s 0%/fok is lehet, azaz C különbség könnyen okozhat 0% eltérést. b Itt is érvényes a: log К = а (4) összefüggés, К azonos a V m a x = к [E] kifejezésben szereplő arányossági tényezővel. Tehát nagyon fontos a hőmérséklet pontos betartása, az átszámítási tényezők használatával óvatosan kell bánni. Az enzimek ph-optimuma függ a puffer minőségétől, az ionerősségtől, továbbá a hőmérséklettől és a szubsztrátum-koncentrációtól. Az optimális szubsztrátum-koncentráció meghatározására rendszerint v-t ábrázolják [S] függvényében. A legjobban használható a Lineweaver-Burk módszer (. ábra), mellyel a K m és V m ax egyaránt meghatározható. 6
Км 3. ábra,\ gátlás típusának m eghatározása Lineweaver és Burk (4) szerin t.--= nem gátolt reakció; ------ = különböző inhibitor-koncentrációkkal gátolt reakciók. A jelölések, mint az. ábrán: K g = az ES enzim szubsztrá um komplex disszociációs állandója, a) a gátlás kom petitiv, a tengelym etszet az ordinátán = ----------- ;az abszcisszán a nem gátolt reakciók esetében = Vm ax K m a gátolt reakciók esetében = ~ ~ ]/K )' ^ ^ gátlás nem kom petitiv: a tengelym etszet,, KM ( + [I az abszcisszán = = az ordinátán a nem gátolt reakció esetében =, a gátolt К м К s ; v m ax +Ш/К/ reakciók esetében. c) A gátlás versengőtlen: a tengelym etszetek az ordinátán, ill. az abszcisszán a nem gátolt reakció esetében V, ill., a g áto lt reakciók esetében m ax Km + Ш /К / + [I]/K / v, i. v m ax K m A V m a x akkor közelíthető meg, ha a K m elhanyagolhatóan kicsi a szubsztrátumkoncentrációhoz képest. Ha az elfogadható hiba szerint akarjuk megválasztani, Michaelis és Menten egyenletét átalakítjuk: [ S ] = v K m V m ax V (5) 62
На % az eltérés a Vmax-tól, v = 0,99, S = 99 Km, ha 2% az eltérés a Vmax-tól, S = 49 K,n. A nagy szubsztrátum-felesleg sokszor azért nem érhető el, mert gátol, vagy a szubsztrátum oldhatósága nem elég nagy. Az aktivitás meghatározásakor figyelembe kell venni az esetleges aktívátorok vagy inhibitorok jelenlétét is. Szintetikus szubsztrátumok gyakran gyorsabban alakulnak át, mint a természetesek. 2.2.3. Mérés kapcsolt reakcióval. Enzimes átalakítás esetében előfordul, hogy a termék nem mérhető közvetlenül kémiai vagy fizikai módszerrel, de egy másik enzim okozta átalakulás szubsztrátumának vagy termékének meghatározásával igen. Az átalakító folyamat a segéd-reakció, a mérési folyamat az indikátor-reakció. A gyakoribb eset az indikátor-reakciónak a segédreakció után kapcsolása. Pl. Sj szubsztrátum meghatározása esetén: E s Sx + S2 -----------* P! + P2 (segédreakcio) Rx+ P2-----------Qx+ Q2 (indikátorreakció) Meghatározandó R^ Qt vagy Q mennyisége. Az előre kapcsolt reakcióban Е / M + N ----------- 0 + S2 Es, Sx + S, --------------- - P i + P 2 (7) Meghatározandó M, N vagy О értéke. Ilyen pl. a glükóz meghatározása, amelyben a hexokináz a segéd-enzim: Es glükóz + ATP----------*- ADP + G-6-P G 6 - P - dehidrogenáz G 6-P + NADP+------------------------------ 6 -P G + NADPH + H + ahol ATP ADP NADP + NADPH G-6-P 6-PG adenozin-trifoszfát adenozin-difoszfát oxidált nikotinamid-dinukleotid-foszfát redukált nikotinamid-dinukleotid-foszfát glükóz-6-foszfát 6-foszfoglukonát. Több segédreakció is lehetséges, melyet indikátor-reakció ki tud szolgálni. 2.2.4. A z inhibició meghatározása. Az inhibitorok vagy a Km értékét növelik látszólag (kompetitiv gátlás), vagy a Vmax értékét csökkentik (nem kompetitiv gátlás), esetleg mindkettőt megváltoztatják (versengőtlen gátlás). (8) (9) 63
4. ábra. A gátlás típ u sán ak m eghatározása Dixon (6) szerint. A jelölések, m int az 7. és 3. ábrán a) A gátlás kom petitiv: a különböző inhibitorkoncentrációkhoz tartozó egyenesek m etszéspont- jának ordináta-értéke = ~\7, abszcissza-értéke = К /. b) A gátlásnem ko m p etitiv :atengely - v m ax m etszet az ordinátán = ~ :7,, az abszcisszán = -К/. c) A gátlás versengőtlen: a tengelym ax m etszet az ordinátán, ill. az abszcisszán a nem gátolt reakció esetében + K S /[S], to lt reakciók esetében у ---- ill. K /(l + K s/[s ])., ill. K r, a gáv m ax A kinetikai összefüggéseket leíró képletekbe inhibició esetén egy [I] tag kerül be, ahol [I] az inhibitor-koncentráció. K; az inhibitor-állandó, az El komplex disszociációs állandója. Kompetitiv inhibició esetén: Vmax [S] [S ] + K m, ill. (20) 64
Ч +-& -) (2) V Vmax [S] Vmax Nem kompetitiv inhibició esetén: Vmax [S] I +, ill. [S] + K s к S Vmax [S] l [I] К / ) Vmax v К / ) (22) (23) Az inhibició típusa egy-szubsztrátumos reakció esetében meghatározható Lineweaver és Виг к (4) szerint úgy, hogy azonos inhibitorkoncentrációt alkalmazva, különböző szubsztrátum-koncentrációkkal mérjük a reakció sebességét. Minden szubsztrátum-koncentrációra egy-egy egyenest kapunk, melyek dőlésszöge eltér. Kompetitiv gátlás esetében az ordinátán metszik egymást, nem kompetitiv gátlás esetén az abszcisszán ( 3/a, b ábra). Versengőtlen gátlás esetében: V Vmax [S] Vmax A különböző inhibitor-koncentrációk esetében Lineweaver Burk szerint ábrázolt egyenesek nem metszik egymást (3/c. ábra). Ha behelyettesítjük,, Km és Vmax, valamint [I] értékét, К / kiszámít- S v ható. Dimenziója mól dm-3. Kényelmesebb a meghatározás Dixon (6) szerint: különféle konstans [S] érté- kék és változó [I] mellett mérjük v-t, -t pedig [I] függvényében ábrázoljuk. v Kompetitiv inhibició esetén az egyes szubsztrátum-koncentrációkra kapott egye- nesek a koordináta-rendszer 2. negyedében metszik egymást,---------magasságában Vmax (4/a ábra). Nem kompetitiv inhibició esetén a metszéspont a negatív abszcisszán van (4/b ábra), versengőtlen gátlás esetén az egyenesek párhuzamosak (4/c ábra). A metszéspont negatív abszcissza-értéke а К /, [I] = К /. Ha az inhibició típusa ismert, К / meghatározására elég egyenest felvenni. Közleményünk 2. és 3. részében az állati és növényi élelmiszerek vizsgálatában alkalmazott fontosabb enzimes analitikai eljárásokat fogjuk ismertetni, a teljesség igénye nélkül. 65
IRODALOM () Stetter H.: Enzymatische Analyse. Verlag Chemie, GmbH, W einheim /Bergstrasse, 952. (2) Michaelis, L., Menten, M. L.: Biochem. Z., 49, 333, 93. (3) Briggs, G. E., Haldane, J. B.: Biochem. J., 9, 338, 925. (4) Lineweaver, H., Burk, D.: J. Amer. Chem. Soc., 56, 658, 934. (5) Hofstee, B. H. J.: N ature, 84, 296, 959. (6) Dixon, M.: Biochem. J., 55, 70, 953. HAZAI LAPSZEMLE Összeállította: Kacskovics Miklós Ferenczi S., Érczhegyi L.: Pektinbontó enzimek borászati alkalmazása. Borgazdaság. 26, 45, 978. Tóth M.: Auto Analyzer néhány alkalmazási módszere a söripar analitikában. Söripar, 25, 55, 978. Oláh L.-né, Török S.: A kékderítés hatásának vizsgálata. Borgazdaság. 26, 50, 978. Kálmán B., Kiss /., Farkas J.: Félüzemi kísérletek a vöröshagyma kihajtásának gátlására, ionizáló sugárzással. Konzerv- és Paprikaipar. 26, 2, 978. Rak l.-né Vukov K.: Kombinált enzimkezelés hatása almazúzalék viszkozitására. Konzerv- és Paprikaipar. 26, 7, 978. Körmendу L., Erdős L.: A szórás értelmezésének kérdése húsipari nyersanyagoknál és késztermékeknél. Húsipar. 27, 80, 978. Bende E., Six L., Szabolcs L.: Érzékszervi bírálatok minősítése ízlelő-, szagló- és színlátóképességük alapján. Élelmezési ipar. 32, 69, 978. Kölesei M., Prágai /., Lukács P., Kardos F.: NEVIROL készítményekkel végzett biológiai-hatástani vizsgálatok repülőgépes alkalmazástechnológiai kidolgozása. Olaj, szappan, kozmetika, 27, 39, 978. Hopkó l.-né, Varjasy G.-né: Az édesipari nyersanyagok radiológiai vizsgálata. Édesipar. 29, 80, 978. Kiss L: Az ionizáló sugárzás alkalmazási lehetősége és sugárforrásigénye az élelmiszeriparban és a mezőgazdaságban. Izotóptechnika. 2, 39, 978. Nemeshegyi G., Hadnagy A., Tombor A.-né, Zentai Gy.: Porpúderok szemcseméretének és szemcseméret-eloszlásának hatása a késztermék színére II. Olaj, Szappan, Kozmetika. 27, 83, 978. Deák T., Fábri /., Vajda Ö.: A növényi élelmiszerek mikrobiológiai módszereinek egységesítése. Szabványosítás. 30., 274, 978. Ruip J., Gantner Gy., Rédey Z., Körmendy L., Mihályi Gy.-né: Á nátriumkazeinát és a szójafehérje hatása a húspépek vizkötő képességére. Húsipar, 27, 80, 978. Magyar К.-né: Cukoripari levek élesztőcsíraszámának gyors meghatározása rezazurin próbával. Cukoripar, 3, 39, 978. László Á., Varjú M., Ferenczi S.: Az alumínium mennyisége és változása tokaji borokban. Borgazdaság, 26, 97, 978. Molnár L, Lukács Gy.: A borok színének objektív meghatározása. Borgazdaság, 26, 0, 978. Mérő Gy.-né: Konzervipari zöldségés gyümölcsfélék radioaktív szennyezettségének és a technológiai folyamatok hatásának vizsgálata. Élelmezési Ipar, 32, 295, 978. 66