Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai módszerek Fluoreszcencia kioltás Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET), Lumineszcencia A molekuláknak azt a fényemisszióját, melyet a valamilyen módon (például fénnyel való besugárzással) gerjesztett molekula a hőmérsékleti sugárzáson kívül kibocsát, gyűjtőnéven lumineszcenciának nevezzük. Lumineszcencia típusai - fluoreszcencia - foszforeszcencia 1
Jablonski diagramm A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Gerjesztés Fluoreszcencia 10-9 s k f Foszforeszcencia 10-3 s k ph 10-15 s E=hν Alap állapot Relaxáció Gerjesztett állapot k q k ic Kioltás vagy Energia transzfer Internal conversion (HŐ) 2
Fluoreszcencia alapfogalmak Kvantumhatásfok: a kibocsátott fotonok száma, osztva az elnyelt fotonok számával. Q f f k f knr Élettartam: az az időtartam ami alatt az intenzitás az e-ed részére csökken le. 1 k f k nr k Fluoreszcencia kioltás Azon lecsengési folyamatok esetén, amikor egy fluorofórokat tartalmazó oldatban, olyan molekulák vagy ionok (kioltók) vannak jelen, amelyek megfelelő elektronszerkezettel rendelkeznek ahhoz, hogy a gerjesztett molekulákkal találkozva, azok energiáját átvegyék, és valamilyen formában disszipálják (pl.hő) fluoreszcencia kioltásról beszélünk. A kioltás által új lecsengési út válik lehetővé Q= k f / k f +k ic +k q Q~F Fluoreszcencia intenzitás lecsökken! 3
Kioltás típusai Kioltás típusai Fluorofór + : Nincs emisszió Kioltó Sötét komplex h*υ (a gerjesztés előtt jön létre) Gerjesztés + : Fluorofór Kioltó h*υ Gerjesztés Ütközési komplex (a gerjesztés után jön létre) Fluorofór + Kioltó 4
Stern-Volmer egyenlet ( a kioltás mértékének kvantifikálása) Max Volmer (1885-1965) Otto Stern (1888-1969) Fizikai Nobel díj (1943) F 0 : fluoreszcencia intenzitás a kioltó hiányában F : fluoreszcencia intenzitás a kioltó jelenlétében K sv : Stern-Volmer állandó [Q] : kioltó koncentrációja Stern-Volmer egyenlet F 0 1 K [ Q sv ] F 0 5
Stern-Volmer állandó(k sv ) A fluorofór hozzáférhetőségéről ad információt! Dinamikus kioltás K sv =k q * τ 0 Hogyan dönthető el milyen típusú kioltásról van szó? k q : bimolekuláris sebességi állandó, ami a fluorofór és a kioltó diffúziós képességével, illetve a fluorofór hozzáférhetőségével áll összefüggésben Einstein-Stokes D=kT/6πhR k q = 1x10 10 M -1 s -1 k q < 1x10 10 M -1 s -1 k q > 1x10 10 M -1 s -1 diffúzió kontrollált sztérikus elfedettség kötés Dinamikus kioltás Statikus kioltás 6
Semleges kioltók: akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok feltérképezése Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt töltés viszonyok meghatározása Kioltók típusai Alkalmazás Fehérjék folding -jának vizsgálata Fehérjék konformációs állapotának és töltés viszonyainak feltérképezése Membránok permeabilitása Diffúziós állandók meghatározása Ld: később 7
FRET Förster típusú / fluoreszcencia rezonancia energia transzfer a gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiai paraméterekkel rendelkező molekula (akceptor) között, dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. Az energiatranszfer által új lecsengési út válik lehetővé Q= k f /(k f +k ic +k t ) Q~F Förster típusú energiatranszfer feltételei hν G hν D 1. Dipól-dipól kölcsönhatás 2. Donor-akceptor távolság 2-10nm 3. Megfelelő orientáció 4. Donor emissziós és az akceptor abszorpciós spektrumának átfedése - D + k t ~ 1/R 6 E R - A + hν A Fluoreszcencia intenzitás lecsökken! 8
A donor emissziós és az akceptor abszorpciós spektrumának átfedése Hullámhossz J= átfedési integrál n= közeg törésmutatója R= donor-akceptor távolság κ= orientációs faktor kt konst. J( )n 4 6 kfr κ 2 Hogyan határozható meg a transzfer hatásfok? τ DA : élettartam az akceptor jelenlétében τ D : élettartam az akceptor hiányában F DA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében F D : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában Donor Floreszcencia emissziója energia csökken! transzfer Abszorpció Emisszió Donor Energia transzfer Akceptor Akceptor emissziója nő! 9
Energia transzfer hatásfok a donorakceptor távolság függvényében Förster féle kritikus távolság donor-akceptor pároknál E R 6 0 6 R0 R 6 Förster féle kritikus távolság (R 0 ): Az a donor-akceptor távolság aminél a transzfer hatásfok 0.5 10
Energia transzfer típusai Heterotranszfer: különböző fluorofórok között jön létre Homotranszfer: azonos fluorofórok között jön létre, melyeket kis Stokes eltolódás jellemez Távolság mérés (molekuláris mérőszalag) Fehérjék konformációs vizsgálat Alkalmazás Fehérjék interakciója Makromolekulák asszociációs vizsgálata (pl. DNS) Fehérjék interakciója Fehérjék konformációs változása 11
Aktin monomer Aktin filamentum - vég (nettó depolimerizáció) Milyen a nukleotid kötő zsebben található fluorofór hozzáférhetősége? Nukleotid kötőzseb Nukleotid kötőzseb εatp εatp + vég (nettó polimerizáció) Cofilin Profilin 12
F 0 / F Aktinkötő fehérjék hatása az ATP- kötőzseb konformációjára 3,00 2,75 2,50 2,25 2,00 1,75 Ksv profilin = 1.02 M -1 Ksv 1 = 0.28 M -1 Ksv cofilin = 0.09 M -1 1,50 = 20% (bound -ATP) 1,25 1,00 Ksv 2 = 53.6 M -1 (free -ATP) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Akrilamid (M) Profilin jelenlétében a fluorofor hozzáférhetősége nagyobb! Cofilin jelenlétében a fluorofor hozzáférhetősége kisebb! 13