Korszerű tömegspektrometria a biokémi miában Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont
Tematika Bevezetés: ionizációs technikák és analizátorok összehasonlítása a biomolekulák szemszögéből Mikromennyiségek mintaelőkészítése Intakt fehérjék vizsgálata: lehetőségek és korlátok Enzimatikus és kémiai hasítások oldatban és gélben Peptidtérkép készítése, szekvenciameghatározás Kromatográfia a mikro illetve nano tartományokban Peptidek tandem tömegspektrometriás szekvenálása Poszttranszlációs módosítások vizsgálata: metilálás, diszulfid hidak, foszforilálás, glikozilálás Fehérjekomplexek vizsgálata Enzimek aktív centrumának meghatározása Nukleinsavak vizsgálata Egyebek
Az MS felépítése Adatgyűjtő rendszer Mintabevitel Ionforrás Analizátor Detektor Vákuumrendszer Interface
Ionforrás Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: elektronütközéses ionizáció (EI) kémiai ionizáció (CI) gyors atom bombázás (FAB) lézerdeszorpció (LDI, MALDI) ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) photospray ionozáció (PSI)
Gyors atom bombázás Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe Mátrix: glicerin, NOBA Tömeghatár: néhány ezer Da Fragmentáció: kismértékű Gyors atom/ion: Xe, Cs Kvázi-molekulaion: [MH], [MNa],
Gyors atom bombázás
Lézerdeszorpció Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok: 4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA) 2,5-dihidroxi benzoesav (DHB) Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA)
MALDI ionképz pződés Mintatartó hn AH Laser 1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra. 2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba. 3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. 20 kv Rács Rács 4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás.
A MALDI előnyei Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kda) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors
Tipikus MALDI spektrum 100 90 80 70 [M2H] 2 74667 Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = 149089.4, 3562] [MH] 149131 1 pmol lineáris mód 25 kv gyors. fesz 3562.3 % Intensity 60 50 40 30 20 10 [M3H] 3 24607 49813 [2M3H] 2 99694 [2MH] 298434 0 0 20000 80000 140000 200000 260000 320000 Mass (m/z)
Ionizáci ció légköri nyomáson
Electrospray ionizáci ció IonSpray: (Pneumatikusan segített electrospray) Nagyfeszültség (5-6 kv) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!). Áramlási sebességek: TurboV (2µL/min 3mL/min) Turbo-IonSpray (2µL/min 1mL/min) IonSpray (2 to 200µL/min) Micro-IonSpray (50 to 1000 nl/min) NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 20-50 nl/min) Kis áramlás fi nagyobb érzékenység!
Turbo V TM Áramlási tartomány: 2 3000 µl/min
TurboIonSpray TM Áramlási tartomány: 2 1000 µ L/min
IonSpray TM Áramlási tartomány: 2 200 µ L/min
Microelectrospray Áramlási tartomány: 50 1000 nl/min
Nanospray Áramlási tartomány: 20 50 nl/min
Microtechnikák másként
Sprayképz pződés légköri nyomás 1. töltött cseppek képződése 3. Coulomb robbanás vákuum 2. oldószereltávolítás
Oldószerelt szereltávolítás Nitrogén gázfüggöny
Gázfüggöny interface légköri nyomás CUR DP SK vákuum Q0 FP N 2
Oldószerelt szereltávolítás Fűtött kapilláris Párologtató gáz HPLC eluens Spray Fűtőegység Szárítógáz Fűtött kapilláris
Többszörösen sen töltt ltött tt ionok Lágy ionizáció m/z = (M nh )/n
Rekonstruált tömegspektrumt
Eluensmódos dosítók Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp 3 N-tartalmú) protonálódását. Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mm koncentrációban. Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!!
Sóhatás