AZ IBUPROFEN AEROB ÉS ANAEROB MIKROBIÁLIS LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA HAGYOMÁNYOS TENYÉSZTÉSES ÉS MOLEKULÁRIS UJJLENYOMAT TECHNIKÁKKAL Készítette: Hatos Zsófia környezettudomány szakos hallgató 2012
Gyógyszermaradványok
Gyógyszermaradványok körforgása fogyasztó gyógyszerek szennyvíz felszín alatti vizek trágya talaj szennyvíztisztító telep felszíni vizek + szediment iszap tisztított víz
Ibuprofen élettani hatása (RS)-2-[4-(2-metilpropil)fenil]propánsav NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs metabolitok: hidroxi-ibuprofen, karboxi-ibuprofen, fenilpropionát 1,2-dihidroxi-ibuprofen, ibuprofenol, ibuprofenol-acetát, izobutilkatekol COX gátló prosztaglandin szintézis gasztrointesztinális vérzés vese- és májkárosodás ökotoxikológiai hatások akut és krónikus tesztek kockázatbecslés - 93/67EGK Európai Uniós Biztonsági Irányelv biodegradáció Nocardia sp. Sphingomonas sp. Trametes versicolor
Célkitűzéseink kísérleti rendszer gyógyszerek aerob és anaerob lebontása különböző közösségek biodegradációs potenciálja ibuprofen közösség átalakító hatása ibuprofent lebontó mikroorganizmus azonosítása
Kísérleti rendszer összeállítása [1] mintavétel: zöld növényi komposzt VÜSZI komposztáló telep eleveniszap Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep rothasztott iszap - Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep Duna iszap Soroksári Dunaág, parttól 5 m, 50 cm-es magmintavevő aerob és anaerob kísérletek sterilizált eszközök és vegyszerek hőlégsterilizáló, autokláv, égetés 3 párhuzamos mérés
Kísérleti rendszer összeállítása [2] AEROB: eleveniszap I, II; zöld növényi komposzt DSMZ 465 ásványi médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben) 50 ml inokulum 2009.03.26. eleveniszap I, 2009.08.11. eleveniszap II 73 mg/l és 300 mg/l ibuprofen koncentráció biotikus kontroll inokulum, ibuprofen abiotikus kontroll inokulum, ibuprofen hetente mintavétel, 2. kísérletnél naponta 1. kísérlet 1 hónapig; 2. kísérlet 2 hétig
Kísérleti rendszer összeállítása [3] Aerob eleveniszapos és zöld növényi komposztos kísérleti rendszer
Kísérleti rendszer összeállítása [4]
Kísérleti rendszer összeállítása [5] ANAEROB: Duna iszap (22 C); rothasztott iszap (35 C) Ramm médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben) 50 ml inokulum anaerob indikátorként 20 l 1%-os rezazurin oldat kupakok - méhviasz-paraffin keverékkel zárás biotikus kontroll inokulum, ibuprofen abiotikus kontroll inokulum, ibuprofen hetente mintavétel anaerob körülmények között
Vizsgálati módszerek {1} DUNA ISZAP ELEVENISZAP ROTHASZTOTT- ISZAP ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
Vizsgálati módszerek {1} 2 kísérleti rendszer 03.26. és 08.11. tenyésztés DUNA ISZAP ELEVENISZAP szekvencia analízis T-RFLP klónkönyvtár DNS izolálás, PCR reakciók kémia ROTHASZTOTT- ISZAP ARDRA ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
Vizsgálati módszerek {2} 2 kísérleti rendszer 03.26. és 08.11. szekvencia analízis ELEVENISZAP T-RFLP klónkönyvtár tenyésztés kémiai analízis kémia elektrospray ionizációs DNS izolálás, PCR reakciók LC-ESI-MS/MS BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar folyadékkromatográfia kapcsolt tandem tömegspektrometria DUNA ISZAP ROTHASZTOTT- ISZAP ARDRA ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
Kutatás lépései
Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (1) 120 120 100 100 80 80 60 40 20 eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll 60 40 20 komposzt - áltag abiotikus aerob kontroll 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja 100 100 80 80 60 60 40 20 Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll 40 20 rothasztott iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. 05.26. Mintavételek időpontja 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. 05.26. Mintavételek időpontja
Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (1) 120 120 100 100 80 60 40 20 eleveniszap I eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll >95%-os csökkenés 80 60 40 20 zöld növényi komposzt 25%-os csökkenés komposzt - áltag abiotikus aerob kontroll 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja 100 100 80 60 Duna iszap 80 60 rothasztott iszap 40 20 12%-os csökkenés Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll 40 20 <5%-os csökkenés rothasztott iszap - átlag (szórás, abiotikus kontroll) abiotikus anaerob kontroll 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. 05.26. Mintavételek időpontja 0 03.26. 04.02. 04.09. 04.16. 04.28. 05.26. Mintavételek időpontja
Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (2) 600 500 ibuprofen visszapótlás 400 300 200 100 abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag 0 2009.08.11-én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei
Ibuprofen koncentráció [mg/l] Kémiai analízis eredményei (2) 600 500 eleveniszap I ibu. visszapótlás 400 >95%-os csökkenés 300 200 100 1 hét alatt 5 napos lag fázis visszapótlás után 2 nap alatt abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag 0 2009.08.11-én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei
Genusok jelenlétének realtív aránya [%] Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp. 60 Flavobacterium sp. 50 40 30 20 10 0 2009.03.26. 2009.08.11. 12. napi minta 1. kísérlet 21 db izolátum 6. napi minta 2. kísérlet 36 db izolátum Pseudomonas sp. Aeromonas sp. Comamonas sp. Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp. Shewanella sp. Wautersiella sp.
Genusok jelenlétének realtív aránya [%] Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp. 60 55 Flavobacterium sp. 50 Pseudomonas sp. 40 34,70 Aeromonas sp. 30 20 10 5 20 15 5 8,7 17,3 21,6 13 4,3 Comamonas sp. Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp. Shewanella sp. 0 2009.03.26. 2009.08.11. 12. napi minta 1. kísérlet 6. napi minta 2. kísérlet Wautersiella sp.
Klónkönyvtár eredményei kiindulási minta 6. napi minta 45 40 35 41% 42% Flavobacteria Sphingobacteria 30 25 20 21% 27% 18% 19% 19% Betaproteobacteria nem osztályzott, kitenyésztetlen Alphaproteobacteria 15 10 11% Gammaproteobacteria 5 0 2009.08.11. 2009.08.17. 3% 1% Planctomycetacia Spartobacteria 56 db klón 91 db klón
T-RFLP analízis eredményei [1] 2009.08.11. eleveniszap kiindulási minta 2009.08.17. eleveniszap 6. napi minta ibuprofennel kezelt (300 mg/l)
T-RFLP analízis eredményei [2] 2009.08.11. eleveniszap kiindulási minta 2009.08.17. eleveniszap 6. napi minta Na-acetátos biotikus kontroll
Ibuprofen koncentráció [mg/l] T-RFLP analízis eredményei [3] 600 500 ibuprofen visszapótlás Irodalmi adatok 400 300 200 100 0 abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag Az ibuprofen lebontása egy Sphingomonas törzs által. (Forrás: Murdoch, R. W. Hay, A. G., 2005)
Összefoglalás ibuprofen lebontása csak aerob körülmények között jelentős eleveniszapban ibuprofen teljes eltávolítása 300 mg/l-es ibuprofen koncentráció mellett is voltak mikroorganizmusok, melyek szaporodtak és az ibuprofen általi szelekciós nyomás hatására a közösség domináns tagjává váltak T-RFLP és klónkönyvtár segítségével Sphingomonas sp. kimutatása
Jövőbeli célkitűzések komposzt további vizsgálata más szennyvíztisztító telepek és további környezeti minták közössége ibuprofen bomlástermékeinek detektálása funkciógének meghatározása Sphingomonas sp. kitenyésztése - egyéb gyógyszerek lebontásának vizsgálata a törzzsel a kísérleti rendszerben más gyógyszermaradványok biodegradációja
Köszönetnyilvánítás Mohr Anita - konzulens ELTE Mikrobiológiai Tanszék Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpont Tóth Blanka BME, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar
Köszönöm a figyelmet!
~
Metabolitok /1/ ibuprofen karboxi-ibuprofen hidroxi-ibuprofen fenilpropionát Az ibuprofen humán metabolitjai (Forrás: Zwiener, C. et al., 2002)
Metabolitok /2/ ibuprofen 2-hidroxi-ibuprofen 1-hidroxi-ibuprofen 1,2-dihidroxiibuprofen Az ibuprofen lebontása egy Nocardia sp. által (Forrás: CHEN, Y. ROSAZZA, J. P. N., 1993) Az ibuprofen T. versicolor általi lebontási útvonala (Forrás: Marco-Urrea, E. et al., 2008)
Metabolitok /3/ Az ibuprofen lebontása egy Sphingomonas törzs által. a ibuprofen; b izobutilkatekol; c 5-formil-2-hidroxi-7metilokta-2,4-dienoik sav; d 2-hidroxi-5-izobutilhexa-2,4-dienedoik sav (Forrás: (MURDOCH, R. W. Hay, A. G., 2005)
Vizsgálati módszerek {1} kémiai analízis LC-ESI-MS/MS cél: ibuprofen koncentrációjának meghatározása BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar mintaelőkészítés: homogenizálás, centrifugálás automatikus mintaváltóval direkt injektálás eluens: acetonitril, ammónium-acetát elektrospray ionizáció tripla kvadrupol analizátor MRM üzemmód m/z szerint szétválasztás
Vizsgálati módszerek {2} DNS izolálás cél: sejtalkotók és környezeti minta mátrixának eltávolítása és DNS kivonása a baktérium sejtekből közösségi minták Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit tenyésztett törzsek - G-spin Genomic DNA Extraction Kit PCR reakciók cél: DNS szálak amplifikálása 16S rrns gén primerek: 27f, 27f-hex, 519r, 1492r, M13
Vizsgálati módszerek {3} T-RFLP terminális restrikciós fragmenthossz polimorfizmus cél: közösségi mintázatok léterehozása fluoreszcens primerrel jelölt DNS restrikciós endonukleázokkal emésztés detektálás kapilláris elektroforézisben közösségben elváló csoportok felismerése és osztályozása, populációk azonosítása, mikrobiális változatosság és környezeti tényezők közötti összefüggés feltárása
Vizsgálati módszerek {4} T-RFLP ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) elektrokinetikus injektálás Elválasztás: 30 perc, POP-4 polimer TAMRA 500, formamid GeneMapper v3.7 szoftver
Vizsgálati módszerek {5} ARDRA amplifikált riboszomális DNS restrikciós analízis PCR reakció restrikciós enzimekkel emésztés etanol precipitálás elválasztás agaróz gélelektroforézissel klónok, tenyésztett törzsek csoportosítása
Mikrobiológiai vizsgálatok {1} tenyésztéses vizsgálat 2009. 04.07. és 2009.08.17-ei minták párhuzamosak összekeverése 3 x 1 ml + 27 ml fizsó hígítási sorozat 73 mg/l koncentrációjú ibuprofent tartalmazó R2A és nutrient táplemez 100 µl szélesztés tisztítási sorozat kolóniák izolálása DNS izolálás ARDRA - T-RFLP - szekvenciaanalízis
Mikrobiológiai vizsgálatok {2} közösségi vizsgálat minták: 2009.08.11., 14., 16., 17., 19., 21. közösségi DNS izolálás [Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit (MoBio)] PCR: 27f-hex-519r primerek restrikciós emésztés: Alu, Bsh etanol precipitálás T-RFLP analízis
Mikrobiológiai vizsgálatok {3} klónkönyvtár készítés 08.11. és 08.17. minták pgem-t Easy Vector Systemmel (Promega) 27-519r PCR, tisztítás, ligálás, transzformálás, tenyésztés, kék-fehér próba, klónok felszedése, M13 PCR ARDRA T-RFLP szekvenciaanalízis
Klónkönyvtár eredményei /1/ RDP Classifier internetes adatbázissal azonosítás klónkönyvtár készítése során kapott eredmények: 2009.08.11. 56 db klón 2009.08.17. 91 db klón genus szintű besorolás 500 bp tenyésztésbe nem vont törzsek kimutatása szennyvíztisztító telepekről izolálás kiindulási és 6. napi minta összehasonlítása diverzitás változás új osztályok megjelenése
Klónkönyvtár eredményei /2/ Csoportreprezentánsok % Azonosítás [RDP adatbázis] hasonlóság % Osztály (classis) [RDP adatbázis] Alu Bsh K-1 16 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria 235,94 102,37 K-3 9 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria 66,99 és 232,13 103,98 K-6 11 Pedobacter sp. 91 Sphingobacteria 67,4 106 K-8 2 Thauera sp, 100 Betaproteobacteria 235 143 K-9 11 Sediminibacterium sp. 100 Sphingobacteria 207 396 K-13 11 Flavobacterium sp. 97 Flavobacteria 67,71 103,82 K-21 5 Zoogloea sp. 98 Betaproteobacteria 69,15 203-204 K-30 4 Bacteroidetes phylum 95 Flavobacteria 146,57 203-204 K-37 2 Flavobacterium sp. 100 Flavobacteria 450 103,92 K-44 2 Simplicispira sp. 90 Betaproteobacteria 146,57 203-204 K-51 2 Hydrogenophaga sp. 90 Betaproteobacteria 69,97 193,7 K-5, 45 13 kitenyésztetlen törzs P 140 93 K-27 2,5 kitenyésztetlen törzs 1 233 208 K-55 2,5 kitenyésztetlen törzs 2 203 289 9 nem azonosítható
Klónkönyvtár eredményei /3/ Szekvenált Azonosítás hasonlóság Osztály (classis) % klónok [RDP adatbázis] % [RDP adatbázis] Alu Bsh K-1 37,4 Sphingobacteriales rend 97 Sphingobacteria 237,53 389,48 K-2 4,4 Zoogloea sp. 100 Betaproteobacteria 68,22 383,64 K-3 3,3 Comamonas sp. Betaproteobacteria 152,23 383,34 K-4 1,1 Prosthecobacter sp. 100 Spartobacteria 383,34 228,12 K-5 2,2 Thaurea sp. Betaproteobacteria 150,11 203,67-204,69 K-6 3,3 Pseudomonas sp. 100 Gammaproteobacteria 67,91 383,98 K-8 18,7 Sphingomonadaceae család 100 Alphaproteobacteria 206,65 92,14 K-9 4,4 Gammaproteobacteria osztály 94 Gammaproteobacteria 231,47 62,08 K-10 8,8 Acinetobacter sp. 100 Gammaproteobacteria 82,24 387,09 K-14 4,4 Chitinophagaceae család 95 Sphingobacteria 67,64 388,09 K-35 1,1 Achromobacter sp. 100 Betaproteobacteria 150,22 143,23 K-41 4,4 Comamonadaceae család 100 Betaproteobacteria 147,12 202,53-203,8 K-47 3,3 Planctomycetaceae család 97 Planctomycetacia 423,68 136,45 K-54 2,2 Methylotenera sp. 95 Betaproteobacteria 185,65 385,96 K-83 1,1 Xanthomonadaceae család 100 Gammaproteobacteria 242,79 55.0-55.85
Klónkönyvtár eredményei /4/ Flavobacterium sp. 5% 3% 2% 2% 2% 2% 16% kitenyésztetlen törzsek "P" Flavobacterium sp. Pedobacter sp. 5% Sediminibacterium sp. 9% 13% Flavobacterium sp. nem azonosítható Zoogloea sp. 11% 9% kitenyésztetlen törzsek 1, 2 Bacteroidetes phylum Thauera sp, 11% 10% Flavobacterium sp. Simplicispira sp. Hydrogenophaga sp.
Klónkönyvtár eredményei /5/ Sphingobacteriales order 3% 4% 3% 3% 2% 2% 1% 1% 1% 37% Sphingomonadaceae family Acinetobacter Zoogloea sp. Gammaproteobacteria class Chitinophagaceae family 5% Comamonadaceae family Comamonas sp. 5% Pseudomonas sp. 5% Planctomycetaceae family Thaurea sp. 9% Methylotenera 19% Prosthecobacter sp. Achromobacter Xanthomonadaceae family