Western blot/immunoblot Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 14-15 Enzim/ Fluorochrome 2 0 t 1 0 t Katona Éva g Western lotting fehérje/g preparálás (1) Fehérje tisztítás/extrahálás -Totál protein standard lízis puffer degradáció megakadályozására -a mintákat mindig 4 0 C-on centrifugáljuk -proteáz inhibitor pl. Pefabloc (Roche diagnostics) legyen a rendszerben fehérje tartalom meghatározás : radford reagens Standard C assay (Pierce) Western lotting Elektroforézis (2) Poliakrilamid gél a fehérjéket denaturáljuk (disszociáljuk): anionos detergens (SDS), redukáló ágens és hő a polipeptidek kötődnek az SDS-hez: negatív töltés SDS-polipeptid komplexek a méretük alapján vándorolnak a gélben a polipeptid módosulásai pl. foszforiláció és glikoziláció hatással lehet Western lotting Elektroforézis (3) Western lotting Elektroforézis (4) SDS-PGE-et diszkontinuous puffer rendszerben végezzük Minta puffer és tömörítő gél Tris-HCl (ph:6.8) Szeparáló gél Tris-HCl (ph:8.8) Puffer tartály Tris-glycine (ph:8.3) tömörítő gél (akrilamid <5%) PH=6.8 szeparáló gél (akrilamid >5%) PH=8.8 Összetétel : is : az akrilamid monomereket keresztköti SDS : denaturáló reagens, Tris-HCl : klorid ion front vezeti a fehérjéket a pozitív elektród felé monium perszulfát : szabad gyököt biztosít TEMED : stabilizálja a polimerizációt 1
Western lotting Protein transzfer (5) Western lotting Membrán típusok (6) - Nedves transzfer - Félszáraz transzfer 3MM papír membrán Gél 3MM papír + Nitrocellulóz (pórus méret 0.45 µm) standard membrán Nylon membránok Nagyobb affinitással kötik a proteineket, magas háttér Polyvinylidene fluoride (PVDF) nagy affinitású kötés, előkezelés methanollal z immobilizált protein láthatóvá tehető ponceau S festékkel (nylon membránoknál nem) - Western lotting blokkolás (7) Western lotting Detektálás (8) z üres membrán felszín blokkolása Torma peroxidáz (HRPO) 5% zsírszegény tejpor, bovine serum albumin, LOTTO lkalikus foszfatáz 6% kazein, 1% polyvinylpyrrolidone, 10mM EDT PS-ben, 1 óra 65 0 C hőkezelés, tárolás 4 0 C-on Izotóppal jelzett antitestek Enzimekkel konjugált antitestek Horseradish peroxidase (HRPO) lkaline phosphatase iotinált antitest + avidin-biotinált enzim komplexe Fluorochrome-jelzett antitestek : FITC, PE, EC5, PC5 második antitest nem speifikus kötődésének gátlása Normál szérum abból az állatfajból, melyben a második antitest készült Western lotting enzim konjugátumok (9) Western lotting Detektálás (10) Hosrseradish peroxidase/lkaline phosphatase 1. Kromogén detektálás: HRP: Diaminobenzidine (D)-barna csapadék P: CIP/NTP- liláskék precipitátum 2. Kemiluminescens detektálás HRP: Luminol- az oxidált luminol kék fényt emittál ECL reagens (Pierce) P: MPPD a defoszforilált termék fényt bocsát ki 2
Hibalehetőségek : Nem-specifikus kötődés - hiperimmun antiszérum a cél antigénen kívül más antigének ellen is tartalmaz IgG-t -z antiszérum alacsony affinitással más, nem cél antigénekhez is kötődhet -Elfogadhatatlanul magas hátteret ad az antiszérum Immunkromatográfia Immunkromatográfia iotinált elfogó antitest ranykolloiddal/ színes partikulummal jelzett antitest avidin jelző antitest epitópjának megfelelő szintetikus peptid DETEKTÁLÁS Kontroll: z arannyal jelzett anti-marker M2 (monoklonális antitest 2) a szintetikus peptidhez kötôdik Negatív reakció: streptavidinnel fedett felszínhez csak a biotinált anti-marker M1 kötôdik Pozitív reakció: streptavidinnel fedett felszínhez biotinált anti-marker M1-markerarannyal jelzett anti-marker M2 komplex kötôdik Marker: a kimutatandó antigén 3
CRDIC REDER CRDIC REDER Teszt paraméterek Cardiac T Quantitative Heparinos teljes vér Mérési tartomány: 0.1-2.0 µg/l Mérési idô: 12 perc Cardiac M Heparinos teljes vér Mérési tartomány: 30-700 µg/l Mérési idô: 8 perc Cardiac D-Dimer Heparinos teljes vér Mérési tartomány: 0.1-4 mg/l Cut-off: 0.5 mg/l Mérési idô: 12 perc IMMUNOSSY KIFEJLESZTÉSE, OPTIMLIZÁCIÓJ ÉS VLIDÁLÁS EGYMÁSR ÉPÜLŐ LÉPÉSEK SOROZT KRITIKUS TÉNYEZŐK FELMÉRÉSE Szenzitivitás, produktivitás, mérési tartomány, reagens ár, stb. REGENS ESZERZÉSE ntitest, analit standardok, minták, kontroll minták, jelzés, szubsztrátok MÉRŐMŰSZER TESZTELÉSE Kalibráció, lámpa és PMT tesztelés, linearitás MÓDSZER KIFEJLESZTÉSE z elsődleges assay paraméterek megállapítása, reagens és mátrix megfelelősége, jel-zaj arány, adat értékelés PÉLD MÓDSZER OPTIMLIZÁCIÓJ Optimalizálandó faktorok kiválasztása, mátrix hatás megállapítása, precíziós profilok készítése MÓDSZER VLIDÁLÁS Stabilitás, reprodukálhatóság (optimális és rutin hiba), automatizáció, torzítás, recovery, módszer összehasonlítás CÉLKITÛZÉS Immunassay kidolgozása a humán plazma XIII-as faktor meghatározására, mely mind kutatási mind rutin diagnosztikai célokra alkalmas. kidolgozott módszerek jellemzése módszerek alkalmazása DOKUMENTÁCIÓ 4
FXIII formák KRITIKUS TÉNYEZŐK Szenzitivitás, produktivitás, mérési tartomány, reagens ár, stb. Plazmában Sejtekben megakaryocyták thrombocyták monocyták macrophagok Szenzitivitás: kritikus Legyen alkalmas nagyon alacsony plazma FXIII kimutatására öröklött deficiencia ill. egyéb testfolyadékok esetén is. Produktivitás: kevésbé kritikus (Nem sürgősségi vizsgálat) Mérési tartomány: nem igényel túl széles mérési tartományt (a várható érték plazmában a normál érték 60-140%-a között van, az extrém érték viszonylag ritka) Reagens ár: Lényeges, de a szükséges antitestek nem megvásárolhatók Specificitás: kritikus Cél: a módszer a FXIII 2 2 komplex mennyiségét mutassa ki Egyéb testfolyadékokban? Kidolgozandó módszer: FXIII- és FXIII- alegységre specifikus monoklonális ellenanyag pár alkalmazásán alapuló ELIS MÉRŐMŰSZER TESZTELÉSE Kalibráció, lámpa és PMT tesztelés, linearitás ELIS olvasó készülék Szakszervíz kalibrálja, hitelesíti. IMPORTNT PRMETERS FOR DEVELOPMENT OF N IMMUNOSSY 1. Primary capture antibody 2. Secondary detection antibody 3. Plate type 4. Coating buffer 5. locking buffer/diluent buffer 6. Wash buffer 7. Coating antibody concentration 8. Coated antibody stability 9. Timing of each step in the immunoassay 10. Secondary antibody concentration 11. Reporter concentration 12. Readout 13. Instrument linearity REGENS ESZERZÉSE ntitest, analit standardok, minták, kontroll minták, jelzés, szubsztrátok MÓDSZER KIFEJLESZTÉSE z elsődleges assay paraméterek megállapítása, reagens és mátrix megfelelősége, jel-zaj arány, adat értékelés ntitest: saját készítésű monoklonális antitestek a FXIII- és FXIII- ellen nalit standardok és kontroll minták: tisztított FXIII preparátumok FXIII ag koncentráció értékkel bíró standard és kontroll plazma a kidolgozáskor még nem állt rendelkezésre Jelzés: biotinnal jelöltük a FXIII- specifikus antitestet HRPO enzimmel jelöltük a FXIII- specifikus antitestet Szubsztrát: TM (felhasználásra kész oldat, SIGM) Egyéb szükséges anyagok: ELIS plate, pufferek 5
módszer elve reakció komponensei iotinált anti-fxiii- elfogó antitest FXIII Streptavidinnel fedett felszín HRPO-jelzett anti-fxiii- jelzô antitest Reakció MÓDSZER OPTIMLIZÁCIÓJ Optimalizálandó faktorok: ntitestek koncentrációja: 1 µg/ml mindkét t esetén plazma minta hígítása: 1:1000 z antitestek és hígított standard, kontroll ill. minta térfogata: 70-70 µl Inkubálási hőmérséklet: szobahő Inkubálási idő: 1 óra Szubsztrát térfogata: 200 µl Szubsztrát inkubálási ideje: 30 perc Specificitás, linearitás vizsgálata Mérési tartomány megállapítása Szenzitivitás megállapítása Mátrix hatás megállapítása plazma FXIII ELIS specificitása és linearitása O.D. 450 nm 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Protein koncentráció µg/l 2 Mérési tartomány: 0.95-40 ng/ml Detektálási határ (a legkisebb kimutatható mennyiség): 0.95 ng/ml Régi módszer: a 0 standard (háttér) abszorbanciájának átlaga+3sd, n=20 Új módszer (NCCLS EP17- protokol): 1, limit of blank (Lo): - legalább 60 vak mérés eredménye - ha az eredmények eloszlása normál, Lo= átlag + 1.645 x SD blank - ha az eloszlás nem normál, Lo= a 95. percentilisnél található érték 2, limit of detection (LoD): 60 x lemérünk egy olyan mintát, melynek az analit koncentrációja az Lo és 4xLo érték között van - ha az eredmények eloszlása normál, LoD= Lo + 1.645 x SD minta - ha az eloszlás nem normál, transzformáljuk az adatokat, vagy nem parametrikus módszert alkalmazunk meghatározást a szabad alegységek koncentrációja nem befolyásolja. Mátrix hatás vizsgálata fibrinogén és egyéb plazma komponensek nem zavarják a plazma FXIII ELIS meghatározást RECOVERY (visszanyerés) Plazma FXIII concentráció (mg/l) hozzáadás hozzáadott hozzáadás visszanyerés előtt után FXIII deficiens 0.061 1.5 1.48 1.42 (94.7%) 0.061 15.0 15.06 15.0 (100.0%) Normál 1 17.5 15.0 32.3 14.8 (98.7%) Normál 2 24.5 15.0 40.3 15.8 (105.3%) Normál 3 24.8 15.0 37.5 12.7 (84.7%) Normál 4 28.5 15.0 42.8 14.3 (95.3%) átlag: 97.5 % MÓDSZER VLIDÁLÁS Stabilitás: minta és reagensek eltarthatósága Reprodukálhatóság (optimális és rutin hiba) utomatizáció - Torzítás - Recovery Módszer összehasonlítás Referencia tartomány megállapítása 6
plazma FXIII ELIS módszer reprodukálhatósága Optimális Hiba X ± SD = 19.4 ± 0.38 mg/l CV: 2% n=20 X ± SD = 1.94 ± 0.064 mg/l Rutin Hiba CV: 3.3% n=20 X ± SD = 19.4 ± 1.06 mg/l CV: 5.5% n=10 X ± SD = 2.38 ± 0.21 mg/l CV: 8.7% n= 9 plazma minta eltarthatósága -20 C-on történő tárolás során FXIII koncentráció mg/l friss, citrátos egy hónap -20 o C plazma tárolás után n=11 24.8 24.5 (98.8%) FXIII aktivitás és a FXIII 2 2 ELIS meghatározások korrelációja (n=1012) plazma FXIII koncentráció referencia tartományának megállapítása FXIII aktvitás (U/L) 300 250 200 150 100 50 0 y = 6.1064x + 22.219 r = 0.896 0 10 20 30 40 50 FXIII koncentráció (mg/l) gyakoriság 25 20 15 10 5 0 FÉRFIK (n=87) K-S d=0.07221, p> 0.20 ; Lilliefors p> 0.20 Shapiro-Wilk W=0.97630, p<0.3937 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 mg/l plazma FXIII gyakoriság 30 25 20 15 10 5 0 NÕK (n=102) K-S d=.06457, p>.20; Lilliefors p>.20 Shapiro-Wilk W=.98243, p<.6518 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 mg/l plazma FXIII n átlag ± SD referencia tartomány mg/l átlag ± 2SD % Férfiak: 87 20.8 ± 3.7 13.4-28.2 64-136 Nôk: 102 21.1 ± 3.4 14.3-27.9 68-132 Totál: 189 21.0 ± 3.5 14.0-28.0 67-133 7