Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai alkalmazások Nyitrai Miklós; 2011 február 21. FRET Emlékeztető: az abszorpció definíciója I 0 I anyag OD = A = - log (I / I 0 ) = ε (λ) c x Röv: optical density I = I 0 10 -ε(λ) c x Fl. emlékeztető Aleksander Jablonski (1898-1980) lengyel fizikus A Jablonski diagram Abszorbció Fluoreszcencia Foszforeszcencia Definíciók Lumin.-fluor.-foszfor. Spektrum Élettartam Kvantumhatásfok Anizotrópia Fotonok és molekulák kölcsönhatása Lecsengési folyamatok Fotonok és molekulák kölcsönhatása fényszóródás abszorpció gerjesztő fény fluoreszcencia foszforeszcencia Energia hő (belső konverzió) Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms) Fluoreszcencia kioltás Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer alap állapot gerjesztett állapot relaxáció Fluoreszcencia kioltás Belső konverzió Energia transzfer (hő) 1
Hogyan képzeljük el a lecsengési folyamatok hatását? gerjesztés gerjesztés A sebességi állandók értelmezése? Virtuális tartály k 1 k 2 (+k 3 k 4 k 5 k... k i ) lecsengés lecsengés Steady-state esetben annyi folyik ki mint amennyi befolyik. Az egyes lecsengések valószínűsége: k i / k összes gerjesztés A fluoreszcencia értelmezése? Mi történik, ha újabb lecsengési út válik lehetővé? gerjesztés k f / (k 0 + k f ) k f / (k 0 + k f + k ú ) (Φ =N emitt /N absz ) k 0 k f k 0 k ú k f lecsengés Fluoreszcencia intentzitás Fl. intenzitás csökkenés! Például fluoreszcencia kioltás! Hogyan értelmezhető a fluoreszcencia élettartam? Emlékeztető: lecsengési görbe! gerjesztés Mi a fluoreszcencia kioltás? k 0 k ú k f k 0 k ú Egy újabb lecsengési út fl. élettartam csökkenést okoz! k f A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral kapcsolatba lépve annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő). Kioltó: a kioltásért felelős molekula! Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió! Például fluoreszcencia kioltás! 2
Fluoreszcencia kioltás típusai Dinamikus kioltás Ütközés a gerjesztett állapotban lévő fluorofór és egy másik, az oldatban lévő nem fluoreszkáló molekula között a fluorofór gerjesztett állapotának deaktivációja és visszatérés az alapállapotba. nem kémiai reakció! Diffúzió által befolyásolt! Sztatikus kioltás Nem fluoreszkáló (sötét) komplexek kialakulása az alapállapotban lévő fluorofór és a kioltó között a gerjesztett állapotban lévő molekulák száma csökken. A fluoreszcencia emisszió anélkül csökken, hogy a fluorofór élettartama megváltozna. Létrejöttében a diffúziónak nincs szerepe. Ha kioltás valószínűsége közel 1: erős kioltó A kioltás mérése A fluoreszcencia intenzitást mérjük különböző kioltó koncentrációk mellett. A kioltás mérése és értelmezése A fluoreszcencia intenzitást (élettartamot) mérjük különböző kioltó koncentrációk mellett. A Stern-Volmer egyenlet F 0 / F = τ 0 / τ = 1+K SV [Q] = 1+ k q τ 0 [Q] A meredekség: K SV F 0 F 1 F 2 Kioltó koncentráció fluoreszcencia intenzitás F 0 / F kioltó koncentráció kioltó koncentráció Eredmények értelmezése Hogyan választható külön a sztatikus és dinamikus kioltás? Kísérletileg meghatározható a Stern-Volmer állandó (K SV ). K SV = k q τ 0 Mi a különbség a hatásukban? A fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi a bimolekuláris sebességi állandó (k q ) értéke. k q k q = 1 x 10 10 M -1 s -1 diffúzió kontrollált kioltás < 1 x 10 10 M -1 s -1 sztérikus elfedettség F 0 / F = τ 0 / τ = 1+K SV [Q] NEM érzékeny a sztatikus kioltásra! 3
A kioltók típusai Semleges kioltók: Akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok jellemzése Példa: Triptofán fluoreszcencia kioltása az aktin monomer és polimer formájában Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt elektrosztatikus viszonyok monitorozása [a fehérje töltése fontos (Lys, Arg, His, Asp, Glu)] Aktin-monomer Kioltási eredmények akrilamiddal 4-es alegység 2-es alegység monomerben filamentumban 3-es alegység 1-es alegység akrilamid (mm) Kioltási eredmények céziummal Adatok filamentumban monomerben cézium klorid (mm) 4
Az aktin monomerhez kötött ε-atp vel végzett kioltási kísérlet ε-atp kofilin nélkül F0/F F0/dF 4-es alegység 2-es alegység 3.5 14 12 3 10 ABP Fo/F 2.5 2 1.5 Fo/dF 8 4 1 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.0 akrilamid (M) 2 0 0 10 20 30 40 50 0 70 80 90 1/akrilamid (1/M) 3-es alegység 1-es alegység Nukleotidkötő zseb ε-atp kofilin nélkül ε-atp kofilin jelenlétében 1 alfa 0.19 K1 35.00 1 0.9 beta 0.81 K2 1.71 0.98 alfa 0.08 0.9 K1 35.00 1-(dF/Fo 0.8 0.7 0. 1-(dF/Fo 0.94 0.92 0.9 0.88 beta 0.92 K2 0.18 0.5 0.8 0.4 0 10 20 30 40 50 0 70 80 90 1/akrilamid (1/M) 0.84 0.82 0.8 0 10 20 30 40 50 0 70 80 90 1/akrilamid (1/M) Módosított Stern-Volmer Egyenlet (Lehrer-egyenlet) Kombinált Statikus és Dinamikus Kioltás Több mint egy fluorofór populáció, eltérő hozzáférhetőséggel. F 0 / ΔF = 1/α + 1/(α K SV [Q]) α : a kioltó által hozzáférhető fluorofór aránya K SV = 5 M -1 meredekség: 1/(αK SV ) A fluorofór kioltása mind ütközéssel mind komplexek kialakulása révén jön létre ugyanazon kioltó által. metszéspont: 1/α 5
A fluoreszcencia kioltásának egy speciális módja: Fotonok és molekulák kölcsönhatása Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer (FRET) Fotonok és molekulák kölcsönhatása fényszóródás abszorpció Energia hő (belső konverzió) Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms) Fluoreszcencia kioltás Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) - Theodor Förster, 1948 Hogyan kell érteni a dipól-dipól kölcsönhatást? A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiai követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. Apoláris molekula: ha a molekulán belül a töltéseloszlás egyenletes Poláris molekula: ha a molekulán belül a töltéseloszlás nem egyenletes (a pozitív és negatív töltések középpontja nem esik egybe ) Dipólus-molekula: a két pólussal rendelkező (poláros) molekula. A FRET létrejöttének feltételei Mit értünk itt spektrális átfedésen? Fluoreszcens donor molekula. A donor és akceptor molekulák alkalmas orientációja. Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között. Megfelelő távolságtartomány: a donor és akceptor molekula közötti távolság (R) 2-10 nm!
Példa spektrális átfedésre További FRET paraméterek hν G hν D - D + k t ~ 1/R E R - A + hν A k t = konst. * J(λ) n -4 k f R - κ 2 J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.), k f : a fluoreszcencia emissziójának sebességi állandója, R: a donor és az akceptor molekula közötti távolság, κ 2 : orientációs faktor (alkalmasan 2/3) FRET donor acceptor pairs A Förster-féle kritikus távolság: R 0 R 0 = 0.211 [η -4 Q 0 κ 2 J(λ)] 1/ κ 2 (κ-négyzet) = orientációs faktor, a donor emissziós vektorának és az akceptor abszorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít várható érték 0 4 között általában a k 2 = 2/3 (gyors mozgások miatti átlagolódás következtében) η = a közeg törésmutatója (1.33-1.) Q 0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiányában J(λ) = átfedési integrál Donor BFP BFP CFP GFP FITC Alexa488 Fluorescein Fluorescein Acceptor GFP YFP YFP Rhodamine Rhodamine Alexa555 Cy5 Texas Red A Förster-féle kritikus távolság értékek Ebben a távolság tartományban alkalmazható a módszer! A FRET hatásfoka E = 1 (F DA / F D ) Tipikus értékek: Donor Akceptor R o (Å) Fluoreszcein Tetramethylrhodamine 55 IAEDANS Fluoreszcein 4 EDANS Dabcyl 33 Fluoreszcein Fluoreszcein 44 BODIPY FL BODIPY FL 57 Fluoreszcein QSY 7 and QSY 9 dyes 1 ahol F DA : a donor intenzitása akceptor mellett; F D : a donor intentzitása akceptor nélkül. Számolható élettartamokkal is! E = 1 (τ DA / τ D ) 7
Távolságmérés FRET Segítségével (Molekuláris Mérőszalag) Förster Távolság Az a távolság melyen a FRET hatásfok felére csökken (transzferhatásfok 0.5). E = R 0 R 0 + R FRET hatásfok R0 = R0 + R E FRET a Jablonski diagrammon A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekulának történő energiaátadással! A FRET hatásfokának távolságfüggése hν G hν D - D + k t ~ 1/R E R - A + hν A E = R0 R0 + R A FRET Jablonskisémája Alkalmazható távolságmérésre! Molekuláris mérőszalag! A FRET hatásfokának távolságfüggése A FRET legfontosabb alkalmazási lehetőségei FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donorakceptor párok esetén Molekulák közötti kölcsönhatások létrejöttének tanulmányozása Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása FRET 8
Egy alkalmazás alapgondolata Cameleons: Ca 2+ indicators based on CaM + GFP mutants A módszer sejtbiológiai vizsgálatokban is alkalmazható Fuorescence resonance/förster energy transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy between two molecules, which can occur if they are very close to each other (< 10 nm), see Fig.. Therefore FRET makes it possible to measure if two molecules, for example a ligand and a receptor, interact with eachother. For FRET to happen the fluorescence emission spectrum of the donor has to overlap with the adsorption spectrum of the acceptor and the donor and acceptor transition dipole orientations must be approximately parallell. The transfer can be measured by looking at the quenching of fluorescence of the donor in presence and absence of the acceptor, or by excitation of the donor and then looking at the fluorescence of the acceptor. Atsushi Miyawaki Fig. Upper Left: The acceptor and donor fluorophores must be closer than ~ 10 nm for the energy transfer to occur. Lower Left: The emission spectrum of the donor must overlap with the excitation spectrum of the acceptor. Right: An example of the acceptor bleaching FRET technique with CFP as the donor and YFP as the acceptor. Interaction - FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET: NKA IP 3 R Donor ProteinA CFP Excitation 430-450 nm < 5-10 nm Acceptor ProteinB YFP Emission >570 nm NKA IP 3 R Hogyan történik egy mérés? Before After Donor GFP-NKA Photobleaching of acceptor removes FRET detected as increased donor signal Distance < 12 nm 1. Alkalmas fluorofórok kiválasztása, jellemzése. 2. Fluoreszcencia intenzitás mérése. 3. FRET hatásfok számolása. Acceptor Cy3-IP 3 R Donor diff Ouabain binding to NKA shortens the distance stronger interaction increased FRET efficiency 15-25% 4. Távolság meghatározása. 9
Példa alkalmazásra: 9-Anthroylnitrile kötése a miozin S1-hez 12 szerinből 1 jelölhető fluorofórral a miozin S1-en belül 9-anthroylnitrile (ANN) kötése a miozin S1-hez ANN-el potenciálisan jelölhető 12 db szerin aminosav (donor)? Melyik? Akceptorral jelölhető, ismert pozíciójú aminosavak ANN kötése a miozin S1-hez Összefoglalás FRET A Ser-181-hez kapcsolódott a fluorofór! 10