Definíciók IMMUNHISZTOKÉMIAI MÓDSZEREK Klinikai Kutató MSc Képzés Debrecen, 2013. 03. 20. Dr. Csonka Tamás DEOEC Pathologiai Intézet Immunkémia Immunhisztokémia Immunciokémia Immunfluoreszcencia Epitóp paratóp Elsődleges antitest Másodlagos antitest Jelölő rendszerek Kettős jelölés Immunhisztokémiai reakció kivitelezése Fixálás Preanalitikai Rögzítés módja, időtartama Szövettípus, mérete Antigénfeltárás hatékonysága, eszköze módja Analitikai Reagens minősége, affinitása Jelző/előhívó rendszer Reagens hígitása Inkubációs idő, hőmérséklet Postanalitikai Kontrollok +/- Reakció értékelése, értelmezése Keresztkötő pl. formalin, glutáraldehid Amino, imino, amid, karboxil csoport kovalens keresztkötése Fehérje térszerkezet torzul, epitophoz nem lehet hozzáférni Koagulációs aceton, metanol Víz helyetesítéssel denaturlája a fehérjét Kevésbé gátol, de a struktúra jobban károsodik Kettő keveréke pikrinsavas-ecetsavas formalin Aldehid rezisztens Antigén Aldehid érzékeny Antigén Mérettől függő 4-16 óra 4%-os formaldehidben Paraffin vagy epoxi gyantába ágyazás Metszetragasztás APES (3-aminopropiltrietoxiszilán) 2%-os acetonos oldata (2h 56 0 C szárítás) Acetonos rögzítés (enyhe koagulációs) Friss-fagyasztott Sejt/szövettenyészet Aspirációs citológia Vérkenet Előnye hogy a lipidek egy részét kioldja => javítja a reagensek penetrációját Hátránya alaposan a tárgylemezre kell szárítani a mintát (2h vagy overnight szobahő); minden lépés <30p 1
Pre-analitikai szakasz hibái Elkésett, vagy túl rövid fixálás következményei: 1. Fixálás: módja, időtartama, szövet típusa, mérete Túl rövid fixálás neutrális pufferelt formalinban (NPF)ban Elkésett fixálás Más fixálószer alkalmazása, nem NPF Túl hosszú fixálás NPF oldatban nem probléma! 2. Megfelelő dekalcinálás: Agresszív dekalcinálás 3. Megfelelő víztelenítés 4. Metszetkészítés: Metszési hibák, szétterített, szétfőzött metszet Antigén veszteség Növekvő háttérreakció Kockázat: bizonytalan immunreakció Gyenge a metszetek tapadása a lemezhez Standard feltárással tovább károsodik a morfológia Kockázat: paraffinblokkban is antigénveszteség tapasztalható Dekalcinálás hatása az immunhisztokémiára Metszetek vastagsága, szárítása, és annak hatása Erős savak: gyors dekalcinálás-10% HCL - IHC+ Gyenge savak: közepes -10% Formic acid- IHC++ Kálcium kelát: lassú dekalcinálás -5-10% EDTA-IHC+++ 3-4 um metszeteket készítünk UltraPlus lemezekre metszetek szárítása 1-2 óra 60 C-on, vagy száríthatjuk 37 Con éjszakán át, majd 1 óra 60 C-on Ha a metszet tapadásával probléma van akkor 16 óra 60 C -on elfogadható, de néhány antigén kimutathatósága csökken: OR, PR, Ki67, HMB45, Melan-A, S100 poly Antigén feltárás Antigén feltárás Csak formalinos fixációnál Kevert fixálásnál rövidebb ideig HIER - Mechanizmusa pontosan nem ismert feltehetően enyhe de általános hidrolízis Proteáz emésztésnél specifikus és erőteljes peptid-kötés hasítása Pufferek: 0.01-0.1M ph6 citromsavas-citrát ( + 0,1% Tween detergens) 0.1-0.5M ph8-10 Tris-HCl 0.1M ph8 EDTA-NaOH Gyári feltárók, pl.: DAKO TRS Heat inducet antigen retrieval HIER Mikrohullámú sütőben: 100 0 C, 800-900W, 1l puffer, 20-25perc Kukta: 120 0 C, 1 atm túlnyomással, 3l puffer, max. nyomás után 2-4perc Ezt kövretően érdemes TBS-sel mosni Emésztés: Proteinase K Trypsin Pepsin Pronase 2
Antigén feltárás Enzimes antigén feltárás: idő és hőmérséklet függése Optimalizálni kell a hőmérsékletet, az időt, a ph-t (puffert) Hőmérséklet szabályozás = hőmérséklet idő: 121ºC/1 perc 100ºC/20 perc 95ºC/40 perc 60ºC/24 óra Antigén feltárás Blokkolás EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) Tris/EDTA puffer, ph 9-es puffer. 3-in-1 módszer - előmelegítés 65 C-ra, 20 97oC - lehűlés 65 C-ra Deparrafinál, hidratál, és antigén feltáró hatással is bír. Endogén peroxidáz Metanolos 0,5% H2O2, 20-30perc Deparaffinálás után Szöveti Fc receptor, pozitív töltésű szöveti molekulák, szabad aldehid csoportok, hidrofób csoportok Nagy koncentrációjú indiferens fehérje, pl.: 1-5% BSA, FCS, más állati szérum, sovány tejpor Szöveti biotin (ABC módszernél; vese, máj, GIT) Biotin mentes módszer Endogén alkalikus foszfatáz Levamisol immun-alkalikus foszfatáz módszernél Formaldehid fixált, fagyasztott metszeteknél Aspecifikus immunfluoreszcens reakció (fokozott hidrofóbia miatt) Endogén peroxidáz blokkolás: Antitestek, inkubációs körülmények Néhány antigén érzékeny az endogén peroxidáz blokkolásra, ha a H202 koncentrációja magas. Használjunk általánosan alkalmazott Dako peroxidáz blokkoló oldatot A blokkolást a primer antitesttel való inkubálás után végezzük Blokkolást a deparaffinálás után, hosszabb ideig, kisebb koncentrációjú H2O2-ben végezzük.0.15-0.30 % H202 Ált. IgG, némely esetben IgM Alosztályspecifikus jelzett antitestek kettős jelölésnél Mosásnál TBS, PBS Reagensek hígitása: 1% BSA, 0.1% Na-azid pufferben Peroxidázzal konjugált antitestnél azidos TBS nem használható Antitestek tárolása: Hígitva 4 0 C Aliquotokra osztva -20 0 C!Nem fagyasztjuk vissza! Inkubáció: Szobahő, over-night (2-5x magasabb hígitásban) 4 0 C, over-night (alacsony affinitás esetén) 3
Antitestek, inkubációs körülmények Immunhisztokémiai jelölőmódszerek Antitestek hígitása: Monolonális, ascites eredetű: 50-néhány100x Sejtkultúra felülúszóból származó: 10-50x Poliklonális antitesteknél: 100-néhány1000x Direkt módszer Indirekt módszer Enzim-immunkomplex módszer (PAP) Avidin-biotin enzimkomplex módszer (ABC, S-ABC) Enzimmel jelölt avidin módszer EPOS módszer EnVision módszer Streptavidin-biotin-peroxidáz komplex EnVision módszer (DAKO) Bitoin: 244Da, H-vitamin Streptavidin: 60kDa, neutrális izoelektromos pont, 4 biotint köt meg Inkubációs lépések: 1 primer antitest 2 biotinnal jelölt antitest 3 S-ABC komplex (1:3 arány strepatividin:biotinált-peroxidáz) Antitesthez kapcsolt számtalan biotin, peroxidáz-biotinja révén még több kötés Biotinnal jelölt anti-egér és anti-nyúl keverék Lehet anti-kecske, antitengerimalac, anti-patkány Kétlépéses indirekt jelzőrendszer ~400kDa dextrán lánc 100 enzim, több10 antitest Egy antitest kötődése nagyszámú enzimet köt Van peroxidáz és alkalikus foszfatáz jelölt formája Lehet anti-egér+anti-nyúl Ig egyáránt rajta EPOS ha a dextrán lánchoz a primer antitest kapcsolódik Envision Evision Flex plusz EnVision Flex+ Jelerősítés: 3 lépéses módszer EnVision FLEX+ Mouse (egér) (Kód: K8021) erősítés 4-5x EnVision FLEX+ Rabbit (nyúl) (Kód: K8009) erősítés 2-3x. Biotin mentes! 3-5 x érzékenyebb! 4
Immunaray-ezüst módszer (IGSS) Mai detektáló rendszerek: Antitesten keresztül kötött kolloidális arany hidrokinon jelenlétében ezüstkiválást katalizál A kivált fémezüst tovább katalizál Fénymikroszkópban fekete ezüst csapadék Ultrastruktúrális vizsgálatokra is alkamas EnVision Flex/Flex+-Dako UltraView-Ventana Optiview-Ventana UltraVision LP- Thermo autostainer- UltraVision One-Thermo Refine- Leica ImPress-Leica Super Sensitive-Biogenex Super Picture-Invitrogen-3rd Gen IHC Detection Kit HiDef Detection HRP Polymer Quanto- Thermo autostainer- Mach 4-Biocare Optiview ampl Reakció termék láthatóvá tétele Reakció termék láthatóvá tétele Immunperoxidáz H2O2 szubsztát DAB vagy AEC kromogén Az elbomló szubsztát oxidálja a kromogént, melyből polimerizált csapadék lesz DAB Co,Ni,Cu-val komplexet képez, ami mélyíti a színt DAB-fém komplex argilofil ezüstel erősíthető Immun-alkalikus foszfatáz Naftol-foszfát vagy indol-foszfát szubsztát Diazónium, tetrazónium só kromogén A szubsztráttól megfosztott naftol csapadékot (azofesték) képez a di/ tetrazóniummal. Alkoholban vagy xilolban kioldódik! IGSS Metszetnek kloridion mentesnek kell lennie alapos desztvizes mosás Fizikai előhívó jó fényérzékenységű legyen ezüst acetát és hidrokinon citrát pufferes oldata (ph3.5) Immunfluoreszcens UV és látható fény gerjeszti őket Más hullámhoszú fényt sugároz ki (emisszió) Fontos a kisugárzott fényre specifikus színszűrő Pl.: AMCA (~350nm;~450nm), FITCH (~480nm;~530nm) TRITC (~550nm;~5765nm), Cy5(~650nm;~670nm) Az immunfesték gyorsan halványul (fading) spec. Metszetfestő anyagok használata Konfokális lézer scanning mikroszkópia új lehetőségek Kettős jelölések Kontroll Immunenzimatikus módszerek kombinálása Fénymikroszkóppal vizsgálható Feltétel: különböző sejteken, vagy különöböző sturktúrákban Szekvenciálisan kell elvégezni a reakciókat Immunfluoreszcens módszerek kombinációja Együttes expresszió is azonosítható Fluoreszcens mikroszkóp, eltérő abszorpciós és emissziós festékek, megfelelő színszűrők Abban az esetben ha kereszt reakció nem várható (nyúl, egér) az reagensek összekeverhetőek. Pozitív kontroll Belső kontrollok Külső kontrollok kimutatható formában biztosan tartalmazó szövet/tenyészet A vizsgálandó mintával azonos módon kell kezelni Negatív kontroll Antitest tisztított antigénnel való kimerítése Azonos állatból származó indiferens Ig-k Normál szérum 5
Immunfestő automaták 6