Stroma-hám interakciók a vastagbél regenerációs és tumorképződési folyamataiban

Stroma-hám interakciók a vastagbél regenerációs és tumorképződési folyamataiban Doktori tézisek Valcz Gábor Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Molnár Béla, a MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Zalatnai Attila, Ph.D., egyetemi docens Dr. Tóth Erika, Ph.D., főorvos Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kovalszky Ilona, a MTA doktora, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Szaleczky Erika, Ph.D., szakorvos Dr. Szmola Richárd, Ph.D., egyetemi tanársegéd Budapest 2012

BEVEZETÉS A vastagbél patológiás folyamataiban, mint például a gyulladást követő gyógyulás és a vastagbélrák (colorectalis carcinoma/crc) kialakulása, alapvetőek az ún. stroma-hám interakciók. Ezek a folyamatok magukban foglalják a sejtvándorlással és fenotípus változással járó, valamint a szabályozó molekulák mozgásával járó folyamatokat. A vastagbél hámregenerációs folyamataiban a szöveti (lokális) őssejteken kívül a csontvelői eredetű őssejtek is részt vesznek. Feltételezhetően, ezen sejtek vándorlásának köztes állomásai a nyiroksejt aggregátumok, ahonnan a csontvelői őssejtek tovább vándorolva kötőszöveti sejtté (pl. fibroblaszt, miofibroblaszt) alakulnak, vagy a mesenchymális - epitheliális átalakulás révén a vastagbél hámrétegébe épülve segíthetik annak gyógyulását. A csontvelői őssejtek a kötőszöveti vándorlásuk során, a nyomásviszonyok megváltozásának és különböző szövetspecifikus szabályozómolekulák hatására részlegesen elköteleződnek hámsejt irányba. A szakirodalom nem tér ki a csontvelői őssejt vándorlás és a korai elköteleződés, valamint a nyiroksejt aggregátumok kapcsolatára a hámregenerációs folyamatokban. A vastagbélrák kialakulása során jellemző sejtfenotípus változással járó folyamat az epitheliális - mesenchymális átalakulás (epithelial to mesenchymal transition/emt). Az EMT során a hámsejtek elveszítik hám-szerű tulajdonságaikat (pl. hasáb sejtalak, apikális - bazális sejtpolaritás, cytokeratin termelés) és a mesenchymális sejtek tulajdonságait veszik fel (pl. alfa-simaizom aktin termelés, orsó-sejtalak és a mozgékonyság megjelenése). Az EMT szerepet játszik a rákos őssejtek szaporodási tulajdonságainak szabályozásában azáltal, hogy a hámsejtekből származó mesenchymális sejtek a rákos őssejt abnormális mikrokörnyezetének alkotói lehetnek. Az EMT folyamata döntően a transzformáló növekedési faktor-β (transforming growth factor-β/tgf-β) receptor II (TGF-βRII) és/vagy Toll-like receptor 9 (TLR9) aktiváción keresztül megy végbe. Ez utóbbi esetben a receptort metilálatlan CpG szigeteket tartalmazó DNS darabok is aktiválhatják, amelyek mennyisége a vastagbélrákos páciensek plazmájában nagymértékben megnövekszik. A hámsejtek szabályozómolekula termelése ugyancsak szerepet játszhat a rákos mikrokörnyezet kialakításában azáltal, hogy a normális sejtarányokat megváltoztatva az aktív hámsejtosztódást befolyásoló sejttípusok (pl. miofibroblasztok) számát növeli. Ezekben a folyamatokban elsődleges lehet a hámsejtek TGF-β és osteopontin (OPN) termelése. A tudományos irodalomban nem található 2

egyértelmű adat arra nézve, hogy miként változik az epitheliális - mesenchymális átalakulások aránya, valamint az ezt szabályozó TGF-βRII és Toll-like receptor 9 expressziója a vastagbél adenoma - carcinoma szekvenciája (ACS) során. 3

CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálataim során a vastagbél nyálkahártya hámrétegében végbemenő sejtfenotípus változásokat és egyes, vélhetően a rákos őssejt mikrokörnyezetét befolyásoló fehérje expressziós változásait figyeltem meg. Célkitűzéseimet az alábbi négy pontban foglaltam össze: 1. A csontvelői eredetű sejtek és a nyiroksejt aggregátumok a vastagbél hámregenerációs folyamataiban betöltött szerepének vizsgálata. 2. A csontvelői eredetű őssejtek korai (a stromális vándorlás során kialakuló), hámirányú elköteleződésének kimutatása CDX2 hám marker és Musashi-1 őssejt marker segítségével. 3. A hámrétegben végbemenő sejtátalakulási folyamatok arányának meghatározása α- simaizom aktin (miofibroblaszt marker) és cytokeratin (hám marker) segítségével a vastagbél adenoma - carcinoma szekvencia során. 4. A sejtátalakulási folyamatokat befolyásoló fehérjék (TGF-βRII, TLR9 és OPN) expresszió változásának vizsgálata az adenoma - carcinoma szekvencia során. 4

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Vizsgálataimat a II. sz. Belgyógyászati Klinika Sejtanalitika Laboratóriumában végeztem. A csontvelői őssejtek hámba épülésének vizsgálatakor, a férfi csontvelővel transzplantált nőbetegekből származó mintákat használtunk fel (egészséges n=5, aspecifikus gyulladást mutató n=5). A mintákon fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) jelölést végeztünk az X- és Y- kromoszómák centromerájára specifikus alfa-szatellita próbakeverékkel, majd a metszeteket digitálisan archiváltuk. Ezután a fedőlemezt eltávolítottuk és cytokeratin hám marker, valamint CD45 lymphocita specifikus ellenanyagok segítségével azonosítottuk a csontvelői eredetű (XY-FISH+), CD45 negatív sejteket. A tárgylemez ismételt szkennelését követően lehetővé vált a két digitális metszet párhuzamos kiértékelése virtuális mikroszkóp segítségével. A sejtek korai, hám irányú elköteleződésének kimutatására CDX2 hámsejt specifikus és Musashi-1 őssejt marker ellenanyagokat használtunk, amelyeket kettős fluoreszcens immunhisztokémiai jelöléssel tettünk láthatóvá. Az epitheliális - mesenchymális átalakulása kimutatása a vastagbélrák fejlődésének különböző szövettani stádiumaiban került sor (egészséges n=8, low grade adenoma n=8, vastagbélrák n=8). A sejtátalakulási folyamat kimutatásához anti-α-simaizom aktin (α-sma) és anti-cytokeratin elsődleges ellenanyagokat használtunk, amelyeket kettős fluoreszcens festéssel tettünk láthatóvá. Az átalakulási folyamatokban résztvevő, osztódó, a hámrétegben elhelyezkedő sejteket Ki-67 proliferációs marker és α-sma kettős fluoreszcens festéssel azonosítottuk. A metszeteket minden esetben digitálisan archiváltuk. A sejtek pontos arányát a digitális mikroszkópba épített marker counter modul segítségével határoztuk meg. Az E-cadherin és az osteopontin immunhisztokémiai kimutatását hagyományos, átmenőfényes metszeteken végeztük el, és szemikvantitatív módon egy pontozási rendszer (ún. scorolási séma) alkalmazásával, digitális mikroszkóppal értékeltük. A Toll-like receptor 9 kimutatását szintén hagyományos, átmenőfényes immunhisztokémiai módszerrel végeztük el. A digitális mikroszkóp segítségével pontosan megadtuk a pozitív és a negatív sejtek egymáshoz viszonyított arányát. A TGFβRII fehérje szintű expressziós változását microarray chiptechnika segítségével mrns szinten is vizsgáltuk. 5

XY-FISH, α-sma/ck E-cadherin TGFβRII TGFβRII TLR9 OPN fehérje CD45/CK fehérje fehérje fehérje fehérje mrns fehérje N 5 8 8 6 6 8 13 Gy 5 - - - - - - Ad - 8 8 6 6 8 13 CRC - 8 8 6 6 8 13 A kísérletekben felhasznált, az egyes szövettani állapotokhoz tartozó mintaszám. A kromoszómák kimutatása XY-FISH-módszerrel, a fehérjék kimutatása immunhisztokémiai módszerrel, az mrns expresszió mérése microarray chiptechnika segítségével történt. Szövettani állapotok: N: normális, Gy: aspecifikus gyulladást mutató, Ad: adenoma, CRC: vastagbálrák. 6

EREDMÉNYEK CD45-, Y-FISH+ sejtek a vastagbél hámrétegében Szignifikáns különbséget (p<0.01) találtam a nyiroksejt aggregátumokat körülvevő kripták intraepitheliális CD45-, Y-FISH+ sejtarányában (1.0685±0.240%), összehasonlítva az egészséges (0.018±0.017%) és a diffúz gyulladást mutató területek (0.043±0.005%) hasonló sejtjeivel. A stromális sejtek CDX2 és Musashi-1 expressziója Vizsgálataink során a stromában jól látható CDX2 hám marker pozitivitást mutató sejteket találtam, amelyek nem voltak kapcsolatban a kriptákkal. Ezen sejtek kis hányada Y kromoszómákat hordozott (Y-FISH pozitivitást mutatott). A stromában található CDX2 pozitív sejtek egy része Musashi-1 őssejt markerre is pozitívnak bizonyult. Intraepitheliális α-sma pozitív sejtek arányának változása az ACS során A vastagbél hámrétegében található, miofibroblaszt-szerű átalakulást mutató CK+ sejtekben többnyire a magban, vagy a maghoz közeli, pontszerű α-sma expresszió volt megfigyelhető. Diffúz, sejtplazma festődés ritkán volt látható. Az intraepitheliális α-sma+/ck+ sejtek aránya szignifikánsan (p<0.05) megnövekedett a CRC mintákban (3.34±1.01%), összehasonlítva az egészséges (1.94±0.69%) és az adenomás mintákkal (1.62±0.78%). Az intraepitheliális sejtek 81.4-88%-a volt osztódási fázisban (Ki-67 pozitivitást mutatott). Az E-cadherin termelődésének változása az ACS során Az E-cadherin expressziója folyamatos csökkenést mutatott az ACS során. A szemikvantitatív kiértékelés során a szövettanilag ép mintákban erős membrán és citoplazma festődést találtunk (a jellemző score érték: +2). Adenomában mind a membrán, mind a citoplazma festődés csökkent, az egészséges mintákhoz viszonyítva (a jellemző score érték: 1 vagy 0). A 7

vastagbélrákos minták nem mutattak citoplazma festődést, a membrán festődése gyenge volt, néha eltűnt (fragmentált festődés) (jellemző score érték: -2). A TGF-β receptor II fehérje expresszió változása az ACS során A normális minták hámjában sejtmembrán és citoplazmatikus TGF-βRII fehérje termelés is kimutatható volt (jellemző score érték 0 és +1). Adenomában a citoplazmális TGF-βRII expresszió a sejtek apikális felére korlátozódott, esetenként hiányzott, a membrán festődése gyenge, szakadozott volt, ritkán teljesen el is tűnt (jellemző score érték: -2). Vastagbélrákban a normális hámnál erősebb citoplazma- és membránfestődés volt megfigyelhető (jellemző score érték +2). A TGF-β receptor II mrns szintű expressziós változása az ACS során A független mintákon elvégzett microarray vizsgálatok eredménye szerint az adenomában és a vastagbélrákos mintákban emelkedett szintű TGF-βRII mrns termelés volt megfigyelhető a normális mintákhoz képest. Az egészséges és a vastagbélrákos, valamint az egészséges és az adenoma minták között is szignifikáns különbség volt megfigyelhető (p<0.05). Az OPN termelődésének változása a vastagbél ACS során. A vastagbélrák kialakulásának minden szövettani stádiumában az OPN expresszió a hámsejtek sejtplazmájára korlátozódott, a magban nem találtunk kimutatható immunreakciót. Egészséges mintákban gyenge, diffúz citoplazma expressziót észleltünk. Adenomában mérsékelt, míg a vastagbélrákban erős citoplazmatikus OPN expresszió volt megfigyelhető. 8

KÖVETKEZTETÉSEK - A csontvelői őssejtek hámba épülése nem túl gyakori folyamat, még enyhe gyulladás esetén sem, a hámban ritkán szaporodnak, többnyire egyesével helyezkednek el. - A lymphoid aggregatumok részt vehetnek a vastagbélhám regenerációs folyamataiban, mint a csontvelői eredetű őssejtek bevándorlásának köztes állomásai. - A csontvelői eredetű őssejtek viszonylag korán, már a kötőszöveti rétegben való vándorláskor elköteleződnek hámsejt irányba, amit a CDX2 hám marker megjelenése alátámaszt. Ez az elköteleződés valószínűleg a mikrokörnyezet megváltozott nyomásviszonyainak és szabályozó-molekula összetételének eredménye. - A sejtátalakulási folyamatok már az egészséges vastagbélhámban is megjelennek, arányuk azonban a vastagbélrákban megnő. Az ilyen sejtátalakulási folyamatokra legtöbbször pontszerű, a magban vagy a mag közelében elhelyezkedő α-simaizom aktin expresszió jellemző. A citoplazmában a diffúz α-simaizom aktin termelődés sokkal ritkábban látható. A kezdeti fázisban (a hámréteg elhagyása) az epitheliális - mesenchymális átalakulás nem igényel α-simaizom aktinhoz kötött aktív sejtmozgást. Feltételezésünk szerint a fokozott proliferáció következtében a hámrétegben megnövekedő nyomásnak nagyobb szerepe van ezen sejtek kötőszöveti rétegbe juttatásában. - A pontszerű, magban elhelyezkedő α-sma expresszió, kezdődő epitheliális - mesenchymális átalakulásra utal, amely a mag morfológiájának megváltozásával újabb átírási folyamatokat indíthat el (ún. mechanotransductios folyamat). - A vastagbélhámban elhelyezkedő α-sma pozitivitást mutató sejtek nagy része osztódási fázisban van, amit a Ki-67 pozitivitás is alátámaszt. - A TGF-β receptor II fehérje termelődése párhuzamosan változik a sejtátalakulási folyamatok gyakoriságával, ami újabb bizonyítéka annak, hogy az EMT fő szabályozója a TGFβRII. - A TLR9 receptorok fokozott termelődése már az adenomában megfigyelhető, ám ezt nem követi az intraepitheliális α-sma sejtarány növekedése, amelynek az lehet az oka, hogy nem jelennek meg azok a CpG szigetekben gazdag DNS lánc darabok (mint ligandok), amelyek a vastagbél-tumorokban aktiválhatják ezeket a receptorokat. 9

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Értekezésem végén szeretném köszönetemet kifejezni mindazoknak, akik munkám során szakmai és személyes támogatásukkal segítségemre voltak: - Prof. Dr. Tulassay Zsolt akadémikusnak és Prof. Dr. Rácz Károlynak, hogy lehetővé tették számomra a kísérletek elvégzését; Tulassay Professzor úrnak külön hálás vagyok útmutatásáért, melynek segítségével törekedtem elsajátítani a magyar nyelvű közlemények elkészítésének fortélyait; - Témavezetőmnek, Dr. Molnár Bélának, akinek áldozatos segítőkészsége és támogatása által elsajátíthattam a helyes kutatói szemléletmódot; - Dr. Sipos Ferencnek, aki mindig pontos, precíz tudásra nevelt és akinek révén megismerhettem a publikálás szabályait; - Dr. Krenács Tibornak, aki bevezetett a szövettan és az immunhisztokémia cseppet sem egyszerű világába; - Kónyáné Farkas Gabriella szakasszisztensnek, hogy gyakorlati munkám során értékes segítséget nyújtott; - Prof. Dr. Masszi Tamás egyetemi tanárnak és Dr. Hagymási Krisztinának a csontvelőtranszplantált betegek vizsgálatában nyújtott segítségükért; - Dr. Solymosi Norbertnek és Dr. Wichmann Barnabásnak a statisztikai elemzésekben nyújtott segítségükért; - Udvardyné Dr. Galamb Orsolyának és Kalmár Alexandrának a chip elemzésben nyújtott segítségéért; - Balogh Zsófiának és Csizmadia Annamáriának az ivari kromoszómák kimutatásában nyújtott segítségükért; - Dr. Tóth Kingának, Dr. Leiszter Katalinnak, Dr. Patai Árpádnak, valamint Berczik Máriának támogatásukért és barátságukért; - A Sejtanalitikai Laboratóriumban dolgozó összes munkatársamnak támogatásukért; - Dr. Tóth Erikának, Dr. Zalatnai Attilának, Dr. Müllner Katalinnak és Dr. Igaz Péternek dolgozatom alapos áttekintéséért, javaslataikért és szakmai bírálatukért; 10

- Végül, de legkevésbé sem utolsó sorban Édesanyámnak és Édesapámnak, hogy megteremtették azt az erkölcsi és anyagi alapot, amely nélkül munkámat nem végezhettem volna el. 11

KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA A Ph.D. témához kapcsolódó elsőszerzős, angol nyelvű közlemények 1. Valcz G, Krenács T, Sipos F, Patai AV, Wichmann B, Leiszter K, Tóth K, Balogh Z, Csizmadia A, Hagymási K, Masszi T, Molnár B, Tulassay Z: Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J Clin Pathol. 2011;64:771-5. IF: 2,42. 2. Valcz G, Sipos F, Krenács T, Molnár J, Patai AV, Leiszter K, Tóth K, Solymosi N, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z: Elevated osteopontin expression and proliferative/apoptotic ratio in the colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma sequence. Pathol Oncol Res. 2010;16:541-5. IF: 1,48. 3. Valcz G, Krenács T, Sipos F, Leiszter K, Tóth K, Balogh Z, Csizmadia A, Müzes G, Molnár B, Tulassay Z: The role of the bone marrow derived mesenchymal stem cells in colonic epithelial regeneration. Pathol Oncol Res. 2011;17:11-6. IF: 1,48. 4. Valcz G, Sipos F, Krenács T, Molnár J, Patai AV, Leiszter K, Tóth K, Wichmann B, Molnár B, Tulassay Z: Increase of α-sma+ and CK+ cells as an early sign of epithelialmesenchymal transition during colorectal carcinogenesis. Pathol Oncol Res. 2011 (accepted for publication). IF: 1,48. A Ph.D. témához kapcsolódó társszerzős, angol nyelvű közlemények 1. Sipos F, Valcz G, Molnár B: Physiologic and pathologic role of local and immigrating colonic stem cells. World J Gastroenterol. 2011 (accepted for publication). IF: 2,24. 2. Sipos F, Müzes G, Valcz G, Galamb O, Tóth K, Leiszter K, Krenács T, Tulassay Z, Molnár B: Regeneration associated growth factor receptor and epithelial marker expression in lymphoid aggregates of ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol. 2010;45:440-8. IF: 1,96. 12

A Ph.D. témához kapcsolódó elsőszerzős, magyar nyelvű közlemények 1.Valcz G, Krenács T, Sipos F, Wichmann B, Tóth K, Leiszter K, Balogh Z, Csizmadia A, Hagymási K, Müzes G, Masszi T, Molnár B, Tulassay Z: A csontvelői eredetű őssejtek megjelenése az ép vastagbélhámban és a gyulladást követő hámregenerációban. Orv. Hetil. 2009;150:1852-7. 2. Valcz G, Krenács T, Molnár B, Tulassay Z: A myofibroblastok szerepe a vastagbél gyulladásos és daganatos folyamataiban. Orv Hetil. 2009;150:597-602. 3. Valcz G, Sipos F, Krenács T, Spisák S, Tóth K, Molnár B, Tulassay Z: Az őssejtek jellemzése, mozgása és terápiás lehetőségei a humán vastagbélben. Magy Belorv Arch. 2009;62:272-8. A Ph.D. témához nem kapcsolódó társszerzős, angol és magyar nyelvű közlemények 1. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Tóth K, Valcz G, Patai VA, Molnár J, Molnár B, Tulassay Z: Az öregedés mikroszkópos és molekuláris jelei a vastagbélben, valamint ezek lehetséges szerepe az időskori vastagbélrák kialakulásában. Orv Hetil. 2010;151:885-92. 2. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Spisák S. Tóth K, Valcz G, Kalmár A, Műzes Gy, Molnár J, Molnár B, Tulassay Z: Az öregedés jelei az emésztőrendszerben. Magy Balorv Arch. 2010;63:19-24. 3. Tóth K, Galamb O, Spisák S, Wichmann B, Sipos F, Valcz G, Leiszter K, Molnár B, Tulassay Z: The Influence of Methylated Septin 9 Gene on RNA and Protein Level in Colorectal Cancer. Pathol Oncol Res. 2011;17:503-9. IF: 1,48. 4. Janzsó G, Valcz G, Thuma A, Szoke B, Lendvai Z, Abrahám H, Kozicz T, Halasy K: Cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide- immunopositive neuronal elements in the lateral septum: rostrocaudal distribution in the male rat. Brain Res. 2010;1362:40-7. IF: 2,63. 13

5. Galamb O, Spisák S, Sipos F, Tóth K, Solymosi N, Wichmann B, Krenács T, Valcz G, Tulassay Z, Molnár B: Reversal of gene expression changes in the colorectal normal-adenoma pathway by NS398 selective COX2 inhibitor. Br J Cancer. 2010;102:765-73. IF: 4,83. 6. Galamb O, Sipos F, Spisák S, Galamb B, Krenács T, Valcz G, Tulassay Z, Molnár B: Potential biomarkers of colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma progression: mrna expression profiling and in situ protein detection on TMAs reveal 15 sequentially upregulated and 2 downregulated genes. Cell Oncol. 2009;31:19-29. IF: 4,17. Az elsőszerzős cikkek impakt faktora: 6,86 Összes impakt faktor: 21,99 14