Chip-technológia bioinformatikai szemmel I. SZE Bioinformatika 2010.11.10.

Chip-technológia bioinformatikai szemmel I. SZE Bioinformatika 2010.11.10. MTA SZBK Funkc. Genomika Laboratórium www.szbk.hu/~chiplab Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

Kromoszómák genetikai állomány hordozói sejt DNS Gének információ hordozók mrns AAAAAA AAAAAA AAAAAA Fehérjék sejtfunkciók ellátása

Molekuláris kapcsolók és hálózatok: a rendszerbiológia elemei JELÁTALAKÍTÁS KAPCSOLÁS RNA JELTOVÁBBÍTÁS Kulcsszavak: kapcsolók

Molekuláris kapcsolók és hálózatok: a rendszerbiológia elemei Moduláris egység: együttes expresszió Transzkripció szintű szabályozás RNS szintű szabályozás Kulcsszavak: kapcsolók és modulok

Génhálózatok, skála-független tulajdonság, redundancia és érzékenység

Sejthálózatok és génhálózatok, kapcsolatok és jelek

Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések Rendszerbiológia biológia lényege szövet, szerv szint G T P daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek Minőségi és mennyiségi változások funkciók felderítése G T P sejtosztódás, differenciáció, sejthalál sejt szint

Environmental stimuli, treatments, infections Funkcionális genomika lényege monitor quantitative and qualitative alterations P P P P P P P T analysis of active genes AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA T G G

Az 1990-es években egy forradalmian új technika, fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére. Csip-technológia A biocsipek nagyszámú (több ezer) cdns, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek A biocsipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Mire alkalmasak a chipek? G Genom Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció, Genom amplifikációk DNS-chipek AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA mrns T Transzkriptom Gén kifejeződés megváltozása, Splice variánsok azonosítása Fehérjék P mirns Kis szabályozó RNS-ek kifejeződése Proteom Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások DNA-chip Lab.BRC, Szeged Fehérje-chipek

Microarray Célmolekula Minta Microarray technológiák a funkcionális genomikában Fragmentek Szubcelluláris Sejtek Szervek Organizmusok Közösségek DNS, RNS Fehérjék Sejtek Szövetek Genomika Proteomika Citomika

A DNS-csip technológia komplementer nukleinsavláncok hibridizációján alapul

Dot-blot technika Radioaktív génspecifikus próba Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Hibridizáció Teljes RNS jelölése A pozitív RNS minták jelölődnek Reverz dot-blot technika Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek DNS-chip technika DNA-chip Lab.BRC, Szeged 100-20,000 Génspecifikus minta Hibridizálás

macroarray A csipek hordozó szerinti osztályozása nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab) radioaktív jelölés kis minta sűrűség (100-1000 pont/cm 2 ) microarray üveglemezen több 10.000-500.000 génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés közepes mintasűrűség (5000 pont/cm 2 ) chip üveglemezen több 500.000-2.000.000 génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés nagy minta sűrűség (10.000pont/cm 2 )

Egy csipkísérlet általános lépései cdns klón és/vagy DNS szekvencia nyomtatás biológiai minta szövetből, sejtkultúrából Makroarray Mikroarray Chip RNS, DNS, fehérje néhány 100, vagy több 1.000, 100.000 gén, fehérje Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás X jelölt minta adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése

DNS-chipek/DNS-microarrayek készítése Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged

Nyomtatótű a MicroArrayer robothoz 100 micron 180 micron spot 65 nl 1nL/spot DNA-chip Lab.BRC, Szeged

DNS-chipek minőségellenőrzése

DNA-chip Lab.BRC, Szeged Human-I Mouse-I Rat-I DNS-chip

CHIPKÉSZÍTÉS Oligonukleotid alapú chip készítése in situ szintézis Affymetrix DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Maskless arrays (Nimblegen) http://www.nimblegen.com/technology/manufacture.html

Alternative Technologies to Develop High Density Oligonucleotide Microarrays inkjet-printed microarrays (e.g. Agilent) maskless array synthesizer (e.g. Nimblegen)

DLP projectors *DLP technology was developed by Texas Instruments. *The technology uses tiny micro mirrors mounted on a computer chip. *The mirrors tilt slightly at speeds as fast as 7,000 times per second, to allow varying shades of light to be reflected. *Color is generated by a color wheel divided in to the 3 primary colors spinning at ultra high speeds. www.projectionlogic.com Pictures from Wikipedia

Probe length: range of 60- mers(50-75mer (ChIP-chip) 60mer (CGH) Probe Tm: kept constant by modifying the lenghts Probe density: 2.1 million probes/array (2*10 8 bp with a 100bp resolution) Always the current annotation used!

Génkifejeződés tanulmányozása cdns vagy oligonukleotid chip transzkriptom analízise aktív-inaktív gének detektálása bonyolult adat és statisztikai analízis aktív gének vizsgálata Jelölt cdns hibridizáció AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA mosás mrns detektálás DNA-chip Lab.BRC, Szeged biológiai anyag Adat analízis: relatív aktivitás mérése a színessel jelölt gének aktívak a feketék nem

Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet RNS tisztítás Cy5 dctp jelölt cdns cdns írás RNS-ből (reverz transzkripció) Hibridizáció, mosás Szkennelés Cy3 dctp jelölt cdns DNA-chip Lab.BRC, Szeged

DNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata RNS cdns cdns-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Két színnel történő jelölési technika DNS-chip kísérletben kontrol beteg szövet/sejt extrakció RNS extrakció adatanalízis jelölt cdns szintézis hibridizálás adatfeldolgozás

cdns könyvtárak, klónok Pozitív klónok SZEKVENÁLÁSA Egyedi PCR amplifikátumok Gélelektroforézis, géldokumentáció Klón név, méret, -pozíció Expressziós KISÉRLETEK Képek, adatok Új klónok névjegyzéke DNA-chip Laboratory, BRC., Szeged Átrendezés 384-es lemezek

CARP Gene database & bioinformatics tools for microarray selection acgctcgactacgactactactgactacgact acgactcacgctcgacgactacgactagcat cagcatcgactccgcgcacatcagctactatt ctactgacgagctacgcgcagcagcggagc atctactactctgacgagctattcagctactcta NCBI: over 10.000 uncurated sequences CarpBase: over 15.000 expressed sequence tags (ESTs) Probe Design 15.000 gene-specific oligonucleotide sequences homology search Blast sequence comparisons EST contig construction DNA-microarray construction 15.000 cured ESTs, functional groups, gene families, annotation

Carp DNA-microarray format Analysis of 8 carps in 1 microarray experiment 15.000 gene analysis each

Gene expression study of carps in response to different diets And stress conditions Hypoxia stress Selenium deficiency Confinement stress Sample collection (gill, blood, liver) RNA preservation transportation RNA preparation cdna conversion (banking for future studies) DNA-microarray HTS-QRT-PCR Laboratory of Functional Genomics.BRC, HAKI, Szarvas

Lézer szkenner Cy5 Képanalízis Lézer szkenner Cy3 beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet Cy5 dctp jelölt cdns kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet Cy3 dctp jelölt cdns

Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata Mycobacterium tuberculosis-ban cdns-chip technikával 1. cdns-chip készítése 2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból 3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-l-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével 4. Adatfeldolgozás Kezeletlen, kontroll baktériumok 3. Hibridizáció Isoniaziddal kezelt baktériumok RNS izoláció, jelölt cdns készítése Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban. EREDMÉNYEK: - Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték PNAS (1999) 96, 12833-12838 Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel.

halolajjal etetett N-3 politelítetlen zsírsavakat tartalmazó diéta hatásának vizsgálata cdns-chip technológiával kontroll Génexpressziós változások RNS cdns szinaptikus plaszticitás citoszkeleton jelátviteli folyamatok energia metabolizmus membrán asszociáció ioncsatorna képzés transzkripciós faktorok Pozitív hatás a mentális funkciókra, Tanulás, memória patkány cdns-chip 3200 génspecifikus minta 6400 mintapont

in old rat hippocampus there are a few clones exhibiting changes one clone induced dramatically Puskás, L.G., Kitajka, K., et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1580-1585. Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged

DNS-chipek képelemzése

log 2 (ratio) Ábrázolási módszerek 2. log2 arány B 4 3 2 transthyretin 1 0-1 -2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Spot label

Adatfeldolgozás, statisztikai analízis R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk) R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1))) R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF) R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,"")))) R1 R1M R1MN R1MNA MRATM MRATMNMRATMNA Plate code Clone name Accesion No 0.9296 0.9296 0.6942 1.038 0.7769 0.75441617 MO7/2 W36984 1.035 MO7/3 W36520 1.574 1.574 1.1755 1.2588 1.357 1.0157 1.12949102 MO7/5 Mouse s-adenosylmethionine synthetase W29782 mrna 1.21 1.21 0.9037 0.927 1.227 0.9184 0.93787425 MO7/6 W14960 0.5451 0.5451 0.4071 0.4337 0.5814 0.4352 0.47144461 MO7/7 W17570 1.049 1.049 0.7834 0.7928 1.107 0.8286 0.82148204 MO7/8 W14332 0.9534 0.9534 0.712 0.866 0.9839 0.7365 0.86148952 MO7/11 W07874 1.1457 1.1457 0.8557 0.8842 1.163 0.8705 0.87050898 MO7/13 W08720 0.9712 0.9712 0.7253 0.7543 0.969 0.7253 0.75449102 MO7/14 EST W18366 1.3814 1.3814 1.0317 0.921 1.409 1.0546 0.95247006 MO7/15 W07997 1.1676 MO7/16 W18521 1.1205 1.1205 0.8369 0.8544 1.098 0.8219 0.84618263 MO7/17 ESTs, Highly similar to GLYCOGEN PHOSPHORYL W18457 1.1963 1.1963 0.8935 0.8628 1.199 0.8975 0.88398204 MO7/18 W15566 0.8856 0.8856 0.6614 0.7541 0.8721 0.6528 0.73731287 MO7/19 W33809 1.1279 1.1279 0.8423 0.7949 1.163 0.8705 0.83083832 MO7/20 W16187 1.352 1.352 1.0097 0.9327 1.329 0.9948 0.93263473 MO7/21 AA052395 0.953 0.953 0.7117 0.7797 1.004 0.7515 0.79491018 MO7/22 TALIN W17813 1.2679 1.2679 0.9469 0.9844 1.246 0.9326 0.95583832 MO7/23 Pale ear W29855 1.1082 1.1082 0.8276 0.806 1.163 0.8705 0.80827096 MO7/24 W17959

log 2 ratio Génexpressziós arányok Corynebacterium glutamicum-ban aerob és anaerob körülmények között 7 5,6 4,2 2,8 1,4 0-1,4-2,8-4,2 Corrected (1000) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase permease Starvation-inducible DNA-binding_protein transcriptional regulator Malate/lactate dehydrogenase Phosphoenolpyruvate carboxylase Methionine synthase_ii 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 NADH dehydrogenase ribosomal protein L16, S19 sensory histidine kinase F0F1-type_ATP synthase Myo-inositol-1- -phosphate synthase ABC-type transporter Acetyl-CoA hydrolase Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

-4x -4x +4x -4x -4x -2x Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

Génexpressziós változások Ac915-tel kezelt KO-egér májkarcinómában Tumorigenesis: DEN, 15 naposan egyszeri 50 ul-es kezelés, 4 hónap normál táp Kezeletlen kontroll Kezeletlen Ac915 kezelés: Egészséges szövet izolálás Tumor izolálás Egészséges szövet izolálás

Funkcionális elemzés Ac-915 tumor / induced tumor DAVID bioinformatics WEB alapú rendszer Input: gén lista Funkcionális csoportok (GO terms, pathways, tissue expression pattern etc.) Géncsoportosítás azonos funkció szerint Szingnifikancia analízis, p-value

Overexpresszált gének. Ac-915 tumor / induced tumor Cyp2c54 Cyp2j9 Cyp2e1 Cyp2c55 Cyp2c37 Ptgs1 Cyp4a12b cytochrome p450 cytochrome p450, family 2, subfamily j, polypeptide 9 cytochrome p450, family 2, subfamily e, polypeptide 1 cytochrome p450, family 2, subfamily c, polypeptide 55 cytochrome p450, family 2. subfamily c, polypeptide 37 prostaglandin-endoperoxide synthase 1 cdna sequence bc060945

Represszált gének. Ac-915 tumor / induced tumor Term Count % PValue Genes Myh11, Arhgef11, Myo7a, Epb4.1l2, Dlg1, Arpc2, Tagln, Trpm7, GO:0007010~cytoskeleton organization Tubd1, Snap23, Rdx, Ndel1, Birc5, Actg2, Krt1, Ppp4c, Pfn2, Tbce, 28 7.31% 1.17E-05 and biogenesis Wasl, Lcp1, Tubb4, Cenpj, Vill, Tuba1a, Fmn1, Capn3, Dnaic1, Rhoq, GO:0015630~microtubule cytoskeleton 16 4.18% 0.00664 Cetn3, Dynlt3, Tubb4, Cenpj, Nek2, Akap9, Cenpf, Tubd1, Tuba1a, Cdc2a, Ndel1, Birc5, Brca1, Npm1, Dnaic1, Ppp4c, GO:0007049~cell cycle 29 7.57% Gadd45a, Rras, Dlg1, Ncapd2, Cdca3, Anxa1, Cdc2a, Birc5, Brca1, Psmd13, Npm1, Tgfa, Rbm7, Jun, Pcnp, Btg3, Cetn3, Tsc2, Mns1, 9.93E-04 Ccna2, Maff, Nek2, Cdkn2c, Cenpf, Ddit3 (DNA-damage inducible transcript 3), Txnip, Ccnb1, Ube2c, Pttg1, Btg3, Cetn3, Dlg1, Ccna2, Nek2, Ncapd2, Cenpf, Cdca3, Cdc2a, Birc5, GO:0000278~mitotic cell cycle 14 3.66% 0.00237 Ccnb1, Ube2c, Tgfa, Pttg1, Arhgef11, Cetn3, Birc5, Ccnb1, Ccna2, Nek2, Ube2c, Ncapd2, Cdca3 GO:0051301~cell division 11 2.87% 0.02743 (cell division cycle associated 3), Pttg1, Cdc2a, Arhgef11, Ing2, Tsc2, Wasl, Tubb4, Myo7a, Egfr, Epb4.1l2, Dlg1, GO:0000902~cell morphogenesis 21 5.48% 0.00541 Igfbp4, Ctnna1, Rdx, Ndel1, Alcam, Brms1l, Igfbp7, Rhoq, Cdc42se1, Tbce, Btg1, Pak2, Pla2g4a, Snapin, Myo7a, Egfr, Snap23, Tff3, Pdpk1, Rab7, Sec23ip,

Genomi átrendeződések és változások vizsgálata csiptechnikával

01 p12-13.3 01 p13-p21 01 p33-34.2 01 p34.2 01 p36.31 01 q21 01 q21.1 01 q21.2-22 01 q21.3 01 q24-q25 01 q31-q32 02 p13-p12 02 q13 02 q34-q35 03 p21.1-9 03 p21.3 03 q 03 q21.1-q21.2 04 p16.3 06 p21.3 06 p21.31 06 q27 07 p15.3-7p14 07 p21.3 08 p23 08 q21.2-q21.3 09 p12-13.3 09 p13 09 q21.2 09 q32-q33.3 10 p11.2 11q23 12 p13 12 q 13 q32.2 14 q24-q31 16 q23.1 17 p13 17 p13 18 p11.1-q11.2 18 q21.3 19 p13.2 19 p13.2 19 q13.12 19 q13.4 19 q13.4 19 q13.43 20 q11.22 20 q13.33 21 q22.1 22 q13.1 Xp11.3-p11.23 Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása Paraffinba ágyazott minták normál daganat DNS PCR Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása 9 Génátrendeződési arányok 4-1 -6-11 Tüdő génarány agy génarány -16

Log 2 ratio Log 2 ratio CGH nagyfelbontású (385K) teljes genom array-vel Nő vs. férfi gdns Chromosomes 1-22, X, Y 1 and 2 copy gains Pajzsmirigy tumor

Szabályozóelemek, transzkripciós kötőhelyek azonosítása ChIP (kromatin immunprecipitációval) és DNS-chip hibridizációval DNS-fehérje kölcsönhatás igazolása DNS-chip hibridizálás

1. SNP 3 pozíció 2. SNP 2 pozíció Pontmutációk (SNP) detektálása Jelölt DNS Oligonukleotid alapú chipek egy nukleotid eltérés azonosítása hibridizáció CCATGG Vad típus CCCTGG Mutáns GCTACC Vad típus GTTACC Mutáns DNS mosás A G T C A G T C detektálás DNA-chip Lab.BRC, Szeged 1. SNP 2. SNP Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T

Mutációk, SNP-k detektálása oligonukleotid chipekkel Vad típus, teljes komplementer Mutáns, nukleotid eltérés mosás Detektálás + - DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Mutációk detektálásának specificitása CypTC CypTCb CypHH19 CypHH19b CypHH17 CypHH17b CypSSb CypSS CypTC CypTCb CypHH19 CypHH19b CypHH17 CypHH17b CypSS CypSSb Komplementer 1 mutáció 2 mutáció 3 mutáció DNA-chip Lab.BRC, Szeged

Nagysűrűségű oligonukleotid alapú DNS-chipek

Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

DNS-chip technika korlátai Oligonukleotid chipek, mutáció, SNP analízis: - minta felsokszorozása, multiplex PCR - kis mintaszámnál költségek - csak ismert szekvenciákra alkalmazható cdns-chipek, génexpresszió-vizsgálatok: - eredmények megbízhatósága kb. 60-80% homológ szakaszok kereszthibridizációja, torz normalizáció, jelölési technikák hibája, szélsőségesen kis és nagy intenzitású adatok (háttér-telítődés) miatt. DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Egyedi genomi eltérések detektálása? Újgenerációs szekvenálási stratégiák

Szekvenálás DNS-chip technológiával NNNNNNNNNN 4 N variáció 8nt: 65.536 12nt: 16.777.216 Problémák - Kódvisszafejtés nem mindig egyértelmű - Ismétlődő szakaszok problematikája - Hibridizáció miatti hibák

Új generációs szekvenálási módszerek SOLID (Applera) Sequencing by oligonucleotide ligation detection 70.000.000 adatpont/reakció Egyedi molekulák felsokszorozása gyöngyökön, emulziós PCR-ral LIGÁLÁS - HIBRIDIZÁLÁS CGTCGCGCACTGTGCAA GCAGCGCG GACACGTT

Átfogó fehérjekifejeződés és fehérjemódosítások vizsgálata fehérjecsip technikával

Protein microarrays on epoxide surfaces for direct labeling and analysis of total protein extracts on traditional epoxide glass surface resulted in high background, low specificity, low sensitivity Solution: use of secondary antibodies and strong blocking buffers HAS, BRC, Laboratory of Functional Genomics

Fehérje-chipek - eltérően kifejeződő vagy módosított fehérjék azonosítására Kezeletlen, kontroll Kezelt bár ígéretes technológia, mégsem annyira megalapozott, mint a DNS-csip módszer Antitestek, amelyek a jelátviteli és egyéb folyamatokban résztvevő fehérjéket ismeri fel Signal transduction Ca associated Cell stress Cell cycle/nuclear Cell cycle Cytoskeleton Neurobiology Apoptosis Egyes fehérjékre, fehérjecsaládokra összpontosít MTA SZBK, Funkcionális Genomika Laboratórium

Tüdőtumor fehérjecsipes vizsgálata cdk5 Caspase 7 chk1 HSP90 3 2.5 Adaptin cdc26 CyclinE 2 1.5 1 0.5 0 100 200 300 400 500 Synaptotagmin Caspase11 Nicastrin MTA SZBK, Funkcionális Genomika Laboratórium

M Reproducibility and sensitivity of DNA and protein microarrays DNA microarray 2.0 1.0-1.0-2.0-3.0 8 9 10 11 12 13 14 15 Protein microarray 0.6 0.4 0.2 0-0.2-0.4 Laboratory of Functional Genomics.BRC, Szeged -0.6 10 11 12 13 14 15 16 A

Specificitás és érzékenység meghatározása Caspase 9 100ng/ml 30ng/ml 3ng/ml High level buffer Low level

alacsonyabb kifejeződés Magas koleszterin tartalmú diéta hatása agyi fehérjekifejeződési mintázatra Cy5 Normál Cy3 magas koleszterin Cy3 átlag, normalizált értékek Cy5 HAS, BRC, Laboratory of Functional Genomics

Magas koleszterin tartalmú diéta hatása agyi fehérjekifejeződési mintázatra 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1-1 -1.1-1.2-1.3-1.4-1.5-1.6-1.7 Phospolipase c gamma 1 PKC beta, gamma NAK synuclein 0 50 100 150 200 250 300

Confirmation DNA and protein microarray results DNA microarray Norm.Fluoro. 10-0.5 10-1 10-1.5 cyt C cyt F farnesyl F farnesyl C 10-2 10-2.5 actin C, F synuclein F synuclein C clathrin F clathrin C Quantitative real-time PCR Protein microarray a-synuclein HAS, BRC, Laboratory of Functional Genomics Ponceau Western-blot

Flow of genetic information Secretion from cell Cytoplasm Cell nucleus transcription translation Degradation Internal stimuli Degradation Activity Modification Cell membrane Transcriptional stimuli DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Genomikai kutatások eszközei DNS-chipek, microarrayek Új generációs szekvenátorok valós-idejű PCR SOLID/454

Nanokapilláris valós-idejű PCR 3.072 reakciótér 48x64 almátrix

Adott projektre tervezett gének vizsgálata nanokapilláris QRT-PCR-vel 48 almátrix 64 esszé almátrixonként 48 minta QRT-PCR microarray lemezenként AVIDIN Kft

AViBioT program az adatok normalizálása belső kontrollok alapján

Kooperáció: MTA SZBK, Comgenex zrt., Targetex Kft. 480 vizsgált, citotoxikus anyag szűrése toxikológiai panelen A normalizált génexpressziós értekeket hierarchikus klaszterezési eljárásnak vetettük alá. A referencia-minták közös klaszterben mutatkoztak, amely hasonló hatásmechanizmusra utal 480 minta (52 gén/minta) 10 lemezen: 1 koncentrációban (EC10) 1 időpontban (24 h) máj sejteken Összesen 24.960 QRT-PCR Vass L, et al. (2009) Toxicogenomics screening of small molecules using high-density, nanocapillary real-time PCR. Int J Mol Med.23:65-74.

mirns expresszió globális és közepes áteresztőképességű szűrése mirns QRT-PCR (Rotorgene) mir-9 mir-21 P1 P2 P1 P2 P1 P2 mirns microarray (Agilent) Patkány szív, Humán vastagbélrák Humán gliómák mir-23b Taqman mirns assay (Avidin) hsa-mir-31 y n n MIRNA-ID HUMAN MOUSE RAT DROSOPHILA CENORHABDITIS DANIO hsa-mir-32 y y y hsa-let-7a y y y n y n hsa-mir-34a y y y hsa-let-7b y y y n n n hsa-let-7c y y y n n n hsa-mir-92a y n n hsa-let-7d y y y n n n mmu-mir-93 y y y hsa-let-7e y y y n n n mmu-mir-96 y y y hsa-let-7f y y y n n n hsa-mir-98 y y y hsa-let-7g y y n n n n hsa-mir-100 y y y hsa-mir-1 y y n n n n hsa-mir-101 y y y hsa-mir-9 y y y y n n hsa-mir-103 y y y hsa-mir-10a y y y n n n hsa-mir-105 y n n hsa-mir-10b y y n n n n hsa-mir106a y n n hsa-mir-15a y y n n n n hsa-mir106b y y y hsa-mir-15b y y y n n n hsa-mir107 y y y hsa-mir-16 y y y n n n hsa-mir-122 y y y hsa-mir-17 y y y n n n hsa-mir-18a y y y n n n mmu-mir-124ay y y hsa-mir-19a y y y n n n hsa-mir-125b y y y hsa-mir-19b y y y n n n hsa-mir-126 y y y hsa-mir-20a y y y n n n hsa-mir-127 y y y hsa-mir-20b y y n n n n hsa-mir-128a y y y hsa-mir-21 y y y n n n hsa-mir-129 y y y hsa-mir-22 y y y n n n hsa-mir-130a y y y hsa-mir-23a y y y n n n hsa-mir-130b y y y hsa-mir-23b y y y n n n hsa-mir-132 y y y hsa-mir-24 y y y n n n hsa-mir-133a y y y hsa-mir-25 y y y n n n hsa-mir-133b y y y hsa-mir-26a y y y n n n hsa-mir-27a y y y n n n mmu-mir-134 y y y hsa-mir-27b y y y n n n hsa-mir-135a y y y hsa-mir-29a y y y n n n hsa-mir-136 y n y hsa-mir-29b y y y n n n mmu-mir-137 y y y hsa-mir-29c y y y n n n hsa-mir-138 y y y hsa-mir-30b y y y n n n hsa-mir-140-3py y y hsa-mir-30c y y y n n n hsa-mir-141 y y y hsa-mir-143 y y n

DNS-chipek diagnosztikai lehetőségei Új megoldások, tervek, ötletek I. (Új) alkalmazási területek Prenatális diagnosztika (multigénes betegségek azonosítása, kockázati tényezők, genetikai betegségek felfedése) Orvosi mikrobiológia (multidrog, antibiotikum rezisztencia kimutatása) Onkológia (kemoterápia kimenetelének jóslása, alosztályok meghatározása, tipizálás) Igazságügy (DNS-ujjlenyomat és embertípusok anozosítása) Alapkutatás (diagnosztikai jelentőséggel bíró, új genetikai markerek felfedezése) Pszichiátria (elmebetegségek, hajlamok, személyiségi jegyek megállapítása) Farmakogenetika (egyénre szabott gyógyszerek) Egy sejt monitorozása, új amplifikációs módszerek DNS-chip Labor, SZBK

Hagyományos és chip adatok egy adott klinikai kórképre Funkcionálsi Genomika Labor MTA SZBK

Gén expresszió globális szűrése néhány sejtből QRT-PCR DNA-microarray

Avicor - the chemical microarray company Kémiai könyvtár robotika Kémiai-csip Szabadalmaztatott felület

application hit identification target Avicor ChemArray 18K labeled target

application comparative hit identification target 1 labeled targets Avicor ChemixArray 18K target 2