Pollreisz Ferenc, Vékey Károly MTA Kémiai Kutatóközpont, Tömegspektrometriai Osztály

Tudományos Diákköri Dolgozat KISS ANDRÁS Zsírsavak HPLC-MS analízise vérplazmából Pollreisz Ferenc, Vékey Károly MTA Kémiai Kutatóközpont, Tömegspektrometriai Osztály Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008

1. Bevezetés...3 1.1. Zsírsavak biológiai szerepe, elhízás kutatás...3 1.2. A zsírsavak bioszintézise...4 1.3. A zsírsavak szállítása a vérben...4 2. Célkitűzések...7 3. Alkalmazott kísérleti módszerek...8 3.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)...8 3.2. Tömegspektrometria mint HPLC detektor...9 3.3. Tandem MS módszerek...11 4. HPLC-MS módszer kifejlesztése vérplazma zsírsavösszetételének meghatározására...13 4.1. Módszerfejlesztés stratégiája, elemei...13 4.2. A tömegspektrometria optimális vizsgálati körülményeinek meghatározása...13 4.3. Tandem tömegspektrometria...15 4.4. A kromatográfiás módszer fejlesztése...17 4.5. Mintaelőkészítés, extrakció...21 4.6. Az analitikai módszer reprodukálhatósága...23 4.7. A kidolgozott módszer összefoglalása, általános tapasztalatok...25 5. Vérplazma zsírsavösszetétele, korrelációja az elhízással és a diabétesszel...31 6. Összefoglalás, következtetések...35 7. Köszönetnyilvánítás...37 8. Irodalomjegyzék...38 2

1. Bevezetés Napjainkban az analitika egyre fontosabb szerepet játszik az életünkben. Az élelmiszeriparban és a környezetvédelemben megjelenő egyre szigorúbb szabályozások és egyes vegyületekre egyre alacsonyabb határértékek a nyomanalitika jelentős fejlődését indították el. Jelen dolgozat szempontjából talán ennél is fontosabb, hogy a biológiai, biokémiai kutatásokban is egyre nagyobb a jelentősége a minél érzékenyebb analitikai módszereknek. A technikai fejlődés jelentős hajtóereje, hogy a legmodernebb technikákat igénylő és felhasználó proteomikai kutatások egyre szélesebb körben terjednek el. A napjainkban nagy népszerűségnek örvendő biomarker keresésnek köszönhetően az orvosi diagnosztikában is kezdenek fontos szerepet kapni a különböző analitikai módszerek. Például az egyes anyagcsere betegségek hatékonyan és gyorsan szűrhetőek újszülött korban egy egyszerű tömegspektrometriás módszerrel, jelentősen megkönnyítve a diagnózist és lehetővé téve ezen betegségek hatékony kezelését 1. Az lipidek biológiai funkcióinak feltárásában is megnövekedett az igény a nagyműszeres technikák, köztük a tömegspektrometria alkalmazása iránt, mely szelektivitása és érzékenysége révén segítséget nyújt a kis koncentrációban jelen levő lipidek (zsírsavak, foszfolipidek, prosztaglandinok, szteroidok) vizsgálatában. 1.1. Zsírsavak biológiai szerepe, elhízás kutatás A zsírsavak az emberi szervezetben számos fontos szerepet látnak el. Ezek közül talán a legfontosabb az energiatárolás. A zsírsavak részben a táplálékkal jutnak be a szervezetbe, részben pedig a szervezet szintetizálja ezeket. Felszívódást követően a zsírsavak a zsírszövetbe kerülnek, ahol átalakulnak trigliceridekké, majd így tárolódnak egészen addig, amíg a szervezet az energiaszükségletét szénhidrátokból fedezni tudja. Amikor a szénhidrátok elfogynak, akkor a zsírszövetben található lipáz enzimek elhidrolizálják a triglicerideket, és a felszabaduló zsírsavak szabad zsírsavként a vérben jutnak el az egyes sejtekhez, amelyek a citoplazmában β-oxidációval lebontják őket. A palmitinsav teljes lebontása során 8 acetil- CoA, 7 FADH 2 és 7 NADH keletkezik, amely molekulák eloxidálása során 131 ATP keletkezik, amiből két ATP a folyamat aktiválására használódik fel Ezek az adatok jól szemléltetik, hogy ez az energiatárolás milyen hatékony módját jelenti. A zsírsavak a 3

különböző membránok felépítésében is fontos szerepet játszanak. A membránokat felépítő foszfolipidek és szfingolipidek és ezzel a membrán tulajdonságait ugyanis az őket felépítő különböző zsírsavak aránya határozza meg. Harmadsorban számos fontos vegyület szintézisének kiindulási anyagát a különböző zsírsavak vagy a zsírsavak lebontásának termékei jelentik. Ebbe a körbe tartoznak a különböző szteroid hormonok, valamint a koleszterin és az epesavak is. Érdemes még megemlíteni a zsírsavak metabolizmusa során keletkező úgynevezett ketontesteket, amelyek szénhidráthiány esetén az agy legfontosabb energiaforrását jelentik, mivel az agy nem képes a zsírsavakat közvetlenül felhasználni. A többszörösen telítetlen ω-3 és ω-6 zsírsavak metabolizmusának termékei a napjainkban egyre nagyobb érdeklődésre számot tartó eikozanoidok, amely vegyületcsalád a prosztaglandinokat, leukotriéneket, tromboxánokat és prosztaciklineket foglalja magába. Ez a vegyületcsalád többek között a különböző gyulladásos folyamatokban, valamint az immunválasz során játszik fontos szerepet 2. 1.2. A zsírsavak bioszintézise Az emberi szervezetben a zsírsavak szintézise főként a májban, zsírszövetben valamint a laktáló (tejtermelő) emlő mirigyeiben történik, de kis mértékben a vesében és a sejtek citoplazmájában is lejátszódik. A szintézis acetil-coa-ból indul ki, amely elsősorban a szénhidrátok metabolizmusából keletkezik. A zsírsavszintézist egy multifunkcionális enzimkomplex, a zsírsav-szintáz végzi. A szintézis végterméke leggyakrabban palmitinsav, de a tejben rövidebb láncú zsírsavak is találhatóak, amelyek szintén keletkezhetnek a szintézis során. A hosszabb szénláncú és telítetlen zsírsavak a palmitinsavból keletkeznek lánchosszabbítással az elongáz enzimek hatására, a kettős kötéseket pedig a különböző deszaturáz enzimek alakítják ki. A deszaturáz enzimek viszont nem tudnak a zsírsavak ω vége és egy meglévő kettős kötés között újabb kettős kötést kialakítani. Ez az oka annak, hogy az igen fontos ω-3 és ω-6 zsírsavakat táplálékkal kell bevinni a szervezetbe 2. 1.3. A zsírsavak szállítása a vérben A zsírsavak, valamint a belőlük keletkező trigliceridek apoláros molekulák, ezért a szállításuk nagyrészt lipoproteinek formájában történik, így ugyanis a vér vizes közegében nem válnak ki. A lipoproteinek fehérjékből (úgynevezett apoproteinek), foszfolipidekből, trigliceridekből, koleszterinből, valamint koleszterin-észterekből állnak. A lipoproteinek különböző lipid tartalmúak lehetnek, ez befolyásolja a denzitásukat, ami alapján számos 4

csoportjukat különböztetik meg, ezek denzitás szerinti növekvő sorrendben: kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), intermediate density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL), high density lipoprotein (HDL). A különböző lipoproteineknek különböző biológiai funkciója van, így pl. a kilomikron feladata a felszívódott trigliceridek szállítása a májba és az egyéb szervekhez. A VLDL szintén triglicerideket szállít, de nem felhasználás, hanem raktározás céljából a zsírszövetekbe. A vérben számos zsírsav található foszfolipidek formájában is. Ezek egyrészt a vér alakos elemeinek (vörösvérsejtek, vérlemezkék) membránját építik fel, másrészt a lipoproteinek külső burkának fontos alkotóelemei. A vérben a zsírsavak egy kis része nem triglicerid, hanem szabad zsírsav formájában van jelen. Ezek a zsírszövetben található trigliceridek hidrolízise során keletkeznek, és elsősorban az albuminhoz kötődve szállítódnak a sejtekhez. A vérben egy részük ténylegesen szabad formában van jelen, ez egyensúlyban van az albuminhoz kötött formával. A sejtek a ténylegesen szabad formában lévő zsírsavakat veszik föl, amelyek pótlódnak az albuminzsírsav komplexekből. Éhezés esetén a szervek energiaellátásának a nagy részét a zsírsavak β- oxidációja fedezi, ennek következtében ilyenkor jelentősen megnő a vérben a szabad zsírsavak mennyisége 2. A különböző zsírsavak fogyasztásának hatását az emberek egészségére széles körben vizsgálták. Jól ismert példa erre a halakban nagy mennyiségben található és a szív- és érrendszeri betegségek megelőzésében fontos ω-3 zsírsavak példája 3-5. Vizsgálták azt is, hogy az ω-3 zsírsavak fogyasztása milyen hatással lehet egyes pszichiátriai betegségekre, és arra az eredményre jutottak, hogy az ω-3 zsírsavak fogyasztása jótékony hatású egyes depressziós megbetegedések esetén 6. A zsírsavakkal kapcsolatos másik népszerű kutatási irány a zsírsavak felszívódásának hosszú távú kinetikája. Mind a vér egyes lipid frakcióinak, mind a zsírszövetnek a zsírsavösszetételében a táplálkozás hatására hosszú távon bekövetkező változásokat számos kutatásban vizsgálták, amelyek többé-kevésbé jól kontrolláltak voltak 7-12. Az irodalomban számos példa található arra is, hogy a különböző tényezők, mint életkor 13-16, nem 13, 17, 18, dohányzás 19-21, testmozgás 22-24 hogyan befolyásolják a vér lipid frakcióinak vagy a zsírszövetnek a zsírsavösszetételét. Az esetek nagy részében azonban a kísérleti alanyok táplálkozását nem tudták befolyásolni, ennek köszönhetően az irodalomban sokszor egymásnak ellentmondó eredmények találhatóak. Arra is számos adat található, hogy a vér különböző lipid frakciói vagy a zsírszövet zsírsavösszetétele mennyire jól jellemzi a táplálék zsírsavösszetételét 8, 11, 25-31. Ezen kísérletek alapján úgy tűnik, hogy a vér különböző lipidfrakcióinak zsírsavösszetétele főleg rövid távon jellemzi jól a táplálék 5

zsírsavösszetételét 8, 11, 27, 28, 30, ilyen időtartamú vizsgálatok esetén használható jól. A zsírszövet zsírsavösszetétele ezzel szemben kb. egy éves időtartam átlagos zsírsavbevitelét tükrözi 31, habár egyes kísérletek alapján ennél gyorsabban is megjelenhetnek benne változások a táplálkozás megváltozásának hatására 32, 33. Egyes kutatások alapján úgy tűnik, hogy a zsír különböző zsírszövetek közötti eloszlása valamint egyes az elhízással járó megbetegedések között kapcsolat lehet 34, 35. Azt tapasztalták ugyanis, hogy akiknél jelentős mennyiségű zsírszövet található az izmokban vagy a májban, azok körében nagyobb számban fordulnak elő diabéteszes esetek 34. 6

2. Célkitűzések Napjainkban nagy erőfeszítések irányulnak arra, hogy felderítsék az elhízás genetikai hátterét, megismerjék a közrejátszó biokémiai folyamatokat, a szervezetben esetlegesen bekövetkező molekuláris változásokat. Ez jelentősen elősegítené az elhízás megelőzését és gyógyítását. Egy hazai kutatási együttműködés (OBEKON) keretében ezeket a molekuláris változásokat kívánjuk felderíteni genetikai, proteomikai és metabolomikai vizsgálatok segítségével. Mi a projekten belül a zsírsavak és a zsírsavanyagcsere kapcsolatát vizsgáljuk az elhízással és egyes az elhízással együtt járó betegségekkel, mint amilyen a diabétesz (cukorbetegség). Elsődleges célunk egy olyan módszer kidolgozása, amely segítségével bonyolult mátrixokban, így elsősorban vérplazmában meg tudjuk mérni az egyes zsírsavak mennyiségét. Mivel a plazmában a szabad zsírsavak mennyisége igen alacsony (), olyan mintaelőkészítést és ezt követő mérési módszert kell kidolgoznunk, mely érzékeny, és e mellett jelentős a szelektivitása is. A módszertől elvárjuk, hogy képes legyen megfelelő hatékonysággal elválasztani a szervezetben található legfontosabb zsírsavakat. Ehhez a feladathoz extrakciót követő HPLC-MS mérési módszert választottuk, ennek paramétereit kívántuk optimálni és meghatározni a módszer analitikai jellemzőit. Vizsgálataink második fázisa a kidolgozott módszer alkalmazása az elhízással kapcsolatos biokémiai orvos-biológiai és klinikai kutatásokban. Ennek során elhízott, de nem diabéteszes valamint elhízott és diabéteszes betegeket hasonlítunk össze. Meghatározzuk plazma minták szabad zsírsav, valamint (hidrolízist követően) teljes zsírsav összetételét. Az egyes betegekre kapott adatokat statisztikai módszerek segítségével elemezzük. Azt kívánjuk megállapítani, hogy van-e kapcsolat a vizsgált betegségek és az egyes emberek vérplazmájában előforduló zsírsavak összetétele között. 7

3. Alkalmazott kísérleti módszerek 3.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Zsírsavak kromatográfiás elválasztására korábban kizárólag gázkromatográfiát használtak (GC) 36, 37. Bár ez a módszer kiváló tulajdonságokkal rendelkezik, alkalmazását napjainkban számos területen, így pl. zsírsavak analízise területén is sok esetben felváltja a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC). Ennek oka részben az, hogy a HPLC széles polaritási tartományban használható, valamit nagy molekulatömegű vegyületek (pl. fehérjék) is jól vizsgálhatók. A HPLC további előnye, hogy biológiai eredetű minták esetén gyakran nincs szükség származékképzésre, mely jelentősen lerövidítheti a mintaelőkészítést. A fordított fázisú folyadékkromatográfiás technika a folyadékkromatográfiás technikák közül a legelterjedtebb, mivel használatával mind poláris, mind apoláris komponensek elválasztása lehetséges. A fordított fázisú módszereknél az eluens polárosabb mint az állófázis, és az állófázis és a vizsgálandó molekulák között apoláris kölcsönhatások lépnek fel. A fordított fázisú oszlopok leggyakrabban szilikagél alapúak, amelyet oktadecil (C18) csoportokkal módosítanak. Emellett előfordulnak fenil és C8-as oszlopok is 1. A zsírsavak elválasztására legelterjedtebben használt folyadékkromatográfiás módszerek fordított fázisú, C18-as oszlopok használatán alapulnak. Ezekkel az oszlopokkal és gradiens elucióval kiváló elválasztás érhető el, akár a mostanában egyre nagyobb jelentőségű cisz és transz izomerek elválasztása is lehetséges. Erre nagyon jó példa az egyik legfrissebb, acetonitril valamint víz eluenseket és két C18-as oszlopot használó HPLC-MS/MS módszer 38. Az irodalomban néhány speciális kromatográfiás módszer zsírsavak elválasztására történő alkalmazhatóságáról is beszámolnak. Ilyenek a korábban zsírsavak GC mérés előtti frakcionálására is használt 39 ezüstion oszlopok használatán alapuló módszerek 40. Ezekkel viszont jó tulajdonságaik mellett számos probléma is van. Az ezüstionok kicserélődnek az oszlop és a mobilfázis között és proton-kation kicserélődés is fellép. Ennek kiküszöbölésére próbálkoztak fordított fázisú oszlopok használatával, az ezüstionokat pedig a mobil fázishoz adták 41, de ez a módszer nem terjedt el széles körben a korrozív mobil fázis miatt. Találni néhány példát 100 szerves oldószert használó izokratikus, fordított fázisú HPLC módszerekre is az irodalomban 42. Ezek felett viszont eljárt az idő, mivel a hosszú kromatográfiás futás mellett nem lehetséges a hosszú és rövid szénláncú zsírsavak egyidejű elválasztása, ezen vegyületek nagy polaritásbeli különbsége miatt. 8

3.2. Tömegspektrometria mint HPLC detektor A HPLC-vel talán leggyakrabban kapcsolt detektorokat az UV detektorok jelentik, de jó tulajdonságaik mellett, a biológiai minták vizsgálatára nem a legjobb választást jelentik. A HPLC-MS csatolás jelentősége manapság egyre nő, köszönhetően nagy érzékenységének, szelektivitásának és annak, hogy vegyületek szerkezetéről közvetlen információt nyújt. A gázkromatográf-tömegspektrométer csatolást könnyű megvalósítani, így gyakorlatilag a GC berendezések megjelenése óta alkalmazzák tömegspektrométert GC-detektornak. A HPLCtömegspektrométer kapcsolás már sokkal problémásabb, a megoldást az 1980-as évek végén megjelenő, légköri nyomású ionforrások jelentették. Ezekkel lehetségessé vált oldatok tömegspektrometriás vizsgálata, így a folyadékkromatográf-tömegspektrométer csatolás is. A tömegspektrometria alkalmazása, bár nagy mértékben kiszélesíti a kromatográfia alkalmazhatóságát, egyben a módszerfejlesztést is korlátok közé szorítja. A tömegspektrométerek érzékenységének optimuma főleg electrospray (ESI) ionforrás használata esetén alacsony áramlási sebességeknél van, ugyanis az ionforrás csak ilyen körülmények között tudja megfelelő hatékonysággal porlasztani és ionizálni a minta oldatát. A kisebb áramlási sebességek miatt kisebb (1-2 mm) átmérőjű oszlopok terjedtek el a HPLC- MS mérésekhez. A másik megszorítás a kromatográfiában gyakran használt pufferekre valamint ionpár-képzőkre vonatkozik. Kerülni kell a nagyon elterjedt foszfát-pufferek használatát, mivel az ESI források rosszul tűrik a nagy só koncentrációkat, helyettük kevés és illékony puffert célszerű használni, például ammónium-formiátot vagy acetátot. Lehetőleg kerülni kell a trietilamin használatát is, mivel lecsökkenti egyéb komponenesek ionizációjának a hatásfokát, erős ionszupressziós hatása lehet. A tömegspektrométer érzékenysége miatt a HPLC berendezésnek és az alkalmazott anyagoknak is sokkal szigorúbb feltételeknek kell megfelelniük. Egyrészt a használt oldószereknek kell tisztábbnak lenniük, másrészt jobb minőségű, kisebb pulzálással rendelkező HPLC pumpák használata válik szükségessé. A tömegspektrométer kiváló szelektivitása következtében a kromatográfiás felbontás kevésbé szigorú követelmény, mint az UV detektorok alkalmazása esetén. HPLC- MS vizsgálatok esetén ezért rövidebb HPLC oszlopok alkalmazása terjedt el, ami a kromatográfiás futásokat jelentősen lerövidítheti 1. A HPLC-MS vizsgálatokhoz legtöbbször elektrospray (ESI) ionizációs módszert használnak, munkánkban mi is ezt használtuk. Az ESI ionforrás egy fém kapillárisból áll, amire nagy feszültséget kapcsolva a kapillárison átáramló folyadék porlasztódik, és 9

sokszorosan töltött cseppek keletkeznek. A porlasztás hatékonyságát porlasztó gáz és fűtés alkalmazása tovább javítja. A töltött cseppekből az oldószer folyamatosan párolog és a töltések taszítása miatt kisebb cseppekre esik szét. Az ionok a töltött cseppekből két folyamattal keletkezhetnek. Vagy a töltött ion távozik a cseppből a töltések taszítása miatt ( ion evaporation model ), vagy az összes oldószer elpárolog és egy sokszorosan töltött ion marad vissza ( charge residue model ) (1. ábra). áramforrás 1. ábra Az ionképződés folyamata electrospray ionizáció során Ezeknek a folyamatoknak a következménye az ESI egyik fontos tulajdonsága, hogy az ionizáció során többszörösen töltött ionok keletkezhetnek. A hagyományos szerkezetű ESI ionforrások a 10-100 µl/perc áramlási sebesség tartományban nyújtják a legjobb érzékenységet. Létezik még nano-esi ionforrás is, mely a sokkal kisebb nl/perc tartományban működik. Az ESI módszer kiválóan alkalmazható erősen poláros és ionos vegyületek ionizációjára mind pozitív, mind negatív módban, de teljesen apoláros anyagok (pl. szénhidrogének) vizsgálatára nem alkalmas. Kis és nagy molekulatömegű minták egyaránt mérhetőek vele. A vizsgálati körülmények változtatásával a tömegspektrométerben észlelt fragmentáció jelentősen befolyásolható. Lágy ionizációs körülmények alkalmazása esetén csak a molekulaion észlelhető; az ütközési energiát megnövelve a vizsgált vegyület jelentős mértékben fragmentálódik. Az előbbi elsősorban molekulatömeg-analízisre, az utóbbi szerkezetvizsgálatra alkalmas. HPLC-MS kísérletekben az ESI mellett más ionizációs módszerek, így pl. atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) is alkalmazható. Az APCI forrás hasonlít az ESI forrásra, de az ionizációt koronakisülés idézi elő. A módszer előnyei az ESI ionizációval 10

szemben, hogy nagyobb áramlási sebességekkel is használható, valamint apolárosabb vegyületek is mérhetőek. 3.3. Tandem MS módszerek A lágy ionizációs módszereknek, mint amilyen az electrospray ionizáció, megvan az a hátrányuk, hogy nem vagy csak alig fragmentálják a vizsgálni kívánt ionokat. Bár ennek számos előnye van (különösen bonyolult keverékek vizsgálata esetén), ilyen esetben azonban csak molekulatömeg információt kapunk az egyes komponensekről. Ez gyakran nem elegendő az egyes anyagok azonosítására. Ennek a kiküszöbölésére jelentek meg a tandem-ms berendezések. Ezeknek két alapvető fajtájuk van. Ioncsapda valamint ionciklotron rezonancia analizátoros berendezésekben időben felbontva lehet MS/MS kísérleteket végezni, míg kvadrupól, TOF valamint szektor analizátoros és hibrid készülékekben térben elkülönülve végezhető MS/MS mérés. Ezen utóbbi csoportban két analizátor van egymás után kapcsolva. A két analizátor között egy ütközési cella található, amibe valamilyen ütköző gázt, például argont vagy nitrogént vezetnek. Ütközőgáz (N 2 ) ionforrás detektor 2. ábra Hármas kvadrupól berendezés sematikus rajza Az első analizátor által kiválasztott ionok ebben a cellában, úgynevezett ütközés indukált disszociációs (CID) folyamatokban vesznek részt, mely során fragmensionok képződnek. A második analizátor ezeket a fragmenseket választja szét tömeg/töltés szerint. A tandem MS készülékeknek nemcsak az az előnyük, hogy szerkezeti információt adnak a vizsgálni kívánt vegyületről, hanem lehetővé teszik az érzékenység és szelektivitás növelését is. Az MS/MS scan funkciók közül a legérzékenyebb és legjobb szelektivitású az MRM módszer. Ennek során az első analizátort egy adott anyaion tömegére állítjuk, míg a második analizátort az anyaion egy jellemző fragmensének a tömegére. Így a tömegspektrométer a SIM módszerhez hasonlóan egy adott tömegű komponenst sokkal hosszabb ideig tud mérni, 11

mivel nem egy nagyobb tömegtartományt scannel, hanem csak néhány kiválasztott tömeget, így egy adott tömegre sokkal hosszabb mérési idő jut. Ha a vizsgálni kívánt anyagra jellemző MRM csatornákat sikerül definiálnunk, akkor kicsi az esélye, hogy a háttér molekulái közt van olyan szennyező, ami ugyanakkora tömegű anyaion fragmentálása során ugyanolyan tömegű fragmenst ad, mint a vizsgálni kívánt anyag, ennek köszönhetően jelentősen lecsökken a háttér, megnő az érzékenység és a szelektivitás. 12

4. HPLC-MS módszer kifejlesztése vérplazma zsírsavösszetételének meghatározására 4.1. Módszerfejlesztés stratégiája, elemei A módszerfejlesztés három fő kérdés, a tömegspektrometria, a kromatográfia és a mintaelőkészítés köré csoportosul. Vizsgáltuk ezen túlmenően a kidolgozott módszer reprodukálhatóságát és azt, hogy mennyire alkalmas zsírsavak kvantitatív meghatározására. A módszerfejlesztéshez 16, szervezet számára fontos és egy izotópjelzett zsírsavból álló standard oldatot használtam. Az oldat a zsírsavháztartás szempontjából fontos C10:0, C12:0, C14:0, C16:1, C16:0, C18:2, C18:1, C18:0, C18:0(D3), C20:5, C20:2, C20:1, C20:0, C22:6, C22:0, C24:0 és C26:0 típusú zsírsavakat tartalmazta ekvimoláris mennyiségben. A fenti, gyakran használt jelölésben a C utáni szám a zsírsav szénatomjainak a számát, míg a kettőspont utáni szám a kettős kötések számát jelenti. A C18:0(D3) deutérium jelzett sztearinsav, melyet a mérések egy részénél belső standardnek használtunk. Az egyes vizsgálatokhoz a törzsoldatot hígítottuk, tipikus esetben az egyes komponensekre nézve 5 µm/l koncentrációjú oldatot használtunk. A módszerfejlesztés során egészséges önkéntestől származó vérplazmát is felhasználtunk. 4.2. A tömegspektrometria optimális vizsgálati körülményeinek meghatározása Méréseinket az MTA KK Tömegspektrometriai Osztály Waters Quattro Micro, hármas kvadrupól típusú tömegspektrométerén végeztük; az optimálás során jelentős mértékben építettem az Osztály korábbi eredményeire 43. A zsírsavak mérésére egyaránt használható APCI és ESI ionizáció, mind pozitív mind negatív módban. Az első lépés annak eldöntése volt, hogy melyik ionizációs módszert válasszuk a minél nagyobb érzékenység érdekében. Megjegyzem, hogy az ESI és az APCI ionforrások érzékenysége nem csak a vizsgálandó minta fizikokémiai jellemzőitől, de az alkalmazott készülék típusától is jelentős mértékben függ. A Waters típusú készülékek esetén az ESI, a Sciex/Applied Biosystems gyártmányoknál az APCI ionforrás tulajdonságai kedvezőbbek. Az érzékenység vizsgálatához 50 µm-os sztearinsav oldatot használtunk, direkt injektálással (10 µl flow injection ). A pozitív ionizációs mód egyik ionforrás használata esetén sem vált be igazán, csak a zsírsav Naadduktját sikerült detektálni, azt is csak kis intenzitással. 13

Negatív módban mind ESI, mind pedig APCI ionizáció esetén ennél sokkal jobb eredményeket értünk el: jól látszott a de-protonált molekulaion, és az érzékenység is jobb volt, mint pozitív ionizáció esetén. A molekulaionok intenzitása, a kémiai háttér, és a mérések robusztussága vonatkozásában az ESI ionizáció jobbnak mutatkozott, mint az APCI, ezért úgy döntöttünk, hogy a mintákat ESI negatív ionizációval fogjuk mérni. Ezt bizonyítják a 3. ábrán látható tömegspektrumok is. Ezek közül a felső, ESI negatív módban felvett spektrumban a zsírsavak intenzitása körülbelül egyforma, és nagyjából egy nagyságrenddel nagyobb, mint az APCI ionizációval felvett spektrumban. ESI-, MeOH elu, MeOHban 080227_FA_STD_ESI- 246 (4.547) Sm (Mn, 1x1.00); Cm (245:254-225:234) 100 279.2 309.3 281.2 171.0 253.2 199.1 283.3 307.3 255.2 339.4 367.4 395.4 Scan ES- 6.93e6 227.2 311.3 172.0 200.2 228.2 256.2 284.3 312.3 323.2 340.4 368.4 396.5 0 080227_FA_STD_APCI- 185 (3.419) Sm (Mn, 1x1.00); Cm (184:188-157:165) 100 395.4 Scan AP- 6.22e5 0 309.3 279.2 281.2 307.3 339.4 283.3 253.2 367.4 311.3 255.2 199.1 227.2 396.5 171.0 340.4 368.4 284.3 312.2 323.2 265.3 160.8 241.3 293.3 353.3 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m/z 3. ábra Zsírsav standard tömegspektruma ESI (felső ábra) valamint APCI negatív ionizációval (alsó ábra), flow injection technikával felvéve Az előzetes vizsgálataink során több különböző koncentrációjú standardet próbáltam ki, és azt tapasztaltam, hogy néhány µmol/l-es koncentráció (vagyis néhányszor 10 pmol injektált anyagmennyiség) esetén jól használható a hagyományos, pásztázásos ( scanning mode ) detektálás. Az érzékenység növelésének egyik legegyszerűbb módja, ha pásztázás helyett úgynevezett SIM (Selected Ion Monitoring) módban használjuk a készüléket. Ekkor ahelyett, hogy egy viszonylag nagy tömegtartományt pásztáznánk az analizátorral, csak a számunkra érdekes néhány m/z értéket vizsgáljuk, így az egyes ioncsatornáknál sokkal több 14

időt tölt a készülék, jelentősen növelve a mérés érzékenységét. A SIM üzemmód használatával a kimutatási határ mintegy 1 pmol, egyes zsírsavak esetén ennél is kisebb. 4.3. Tandem tömegspektrometria Az irodalomban számos cikk található, amelyek alapján a zsírsavak nagy (kev) ütközési energia esetén, így pl. szektor készülékekben jól fragmentálódnak és a fragmensek jellemzőek a zsírsavakban található kettős kötések, valamint elágazások számára és helyzetére. A hármas kvadrupól (valamint a gyakori ioncsapda) berendezésekre jellemző kis ütközési energia esetén viszont ezek a vegyületek nem vagy csak alig fragmentálódnak. Ezen túlmenően, az ütközési energia növelésével a molekulaion intenzitása lecsökken, anélkül, hogy a fragmensek intenzitása növekedne. Az irodalomban néhány újabb cikk alapján úgy tűnik, hogy a zsírsavak egyes fémionokkal, például Li +, Ba 2+, Cu 2+ ionokkal 38, 44, 45, képzett adduktjai a kvadrupól készülékekre jellemző kis ütközési energián is fragmentálódnak. Ezen túlmenően, a fragmensionok jellemzik a kettős kötések számát valamint ezek pozícióját, így jól felhasználhatók a szerkezetvizsgálat során. A fragmentáció tanulmányozása céljából első lépésként az irodalomban már leírt, Ba 2+ -ionokkal képzett adduktokon alapuló módszert reprodukáltuk. Ehhez C18:0, valamint C20:2 zsírsav metanolos oldatát összekevertük Ba(Ac) 2 1 mm-os koncentrációjú vizes oldatával 9:1 arányban, majd direkt injektálással vettük fel az így készített oldatok tömegspektrumát ESI pozitív módban, hogy lássuk, valóban keletkezik-e Ba 2+ addukt. A tömegspektrometriás paramétereket úgy optimáltuk, hogy az addukt ionok csúcsának intenzitása minél nagyobb legyen. Ezután mindkét zsírsavat fragmentáltuk több ütközési energián is. A C18-as zsírsav 421 m/z értékű és C20:2-es zsírsav 445 m/z értékű Baadduktjának MS/MS spektruma a 4. ábrán látható. 15

5uM C18 MeOHban+ Ba(Ac)2 1 mm H2O-ban 9:1 aranyban ESI poz, MeOH elu 080806_PROD_421_C18BA 468 (8.650) Cm (457:478) 139.1 x10 100 405 377 349 321 293 265 237 209 0 C H 3 [Ba+OH] + 155.0 391 196.1 363 335 209.3223.2 223.8 307 279 251 223 196 251.3265.4 279.3 293.4307.2 321.5 420.4 334.9 349.2 371.3 419.3 O - O Ba 2+ [M-H+Ba] + 421.3 421.5 Daughters of 421ES+ 2.86e5 080806_PROD_445_C20_2_BA 332 (6.136) Cm (323:342) 209.0 100 [Ba+H] + 139.1 [Ba+OH] + 196.1 C H 3 347 155.0 251.2 138.3 179.2 223.1 347.1 264.9 279.4 165.1 293.3 237.2 307.5 445.5 0 m/z 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 333 307 293 279 4. ábra C18:0-as zsírsav 421 m/z értékű Ba-adduktjának és a C20:2-es zsírsav 445 m/z értékű Baadduktjának MS/MS spektruma 265 251 237 223 209 196 Daughters of 445ES+ 1.33e5 O - [M-H+Ba] + O Ba 2+ Ez a spektrum megegyezik az irodalomban leírttal, a spektrum a két kettős kötés pozícióját is jól jelzi. Problémát jelentett azonban a Ba(Ac) 2 oldatból származó háttércsúcsok megjelenése, ami a későbbiekben MRM módszer fejlesztését jelentősen zavarta. A probléma megkerülése érdekében több más fémiont is kipróbáltunk. Választásunk az irodalomban már leírt Cu 2+ ionok mellett a még nem vizsgált Mn 2+, Co 2+ és Zn 2+ ionokra esett. Mindegyik fémion esetén a megfelelő klorid 1 mm-os vizes oldatát használtuk, kivéve a rezet, amely esetén CuSO 4 oldattal dolgoztunk. A zsírsavak oldatát a fémsók oldatával a Ba(Ac) 2 esetén leírt arányban kevertük össze. Cu 2+ Zn 2+ ionok esetén addukt ionokat nem sikerült detektálnunk. A Mn 2+ és a Co 2+ ionokkal képzett zsírsavadduktokat a tömegspektrometriás paraméterek optimálása után megfelelő intenzitással sikerült detektálni, majd a fragmentációjukat is sikerült megfigyelni különböző ütközési energiákon. A tandem MS vizsgálatok során ugyan sikerült a szerkezetre jellemző fragmentációt észlelnünk, de a vizsgálatok érzékenysége nem volt annyival jobb a negatív ESI körülmények között észlelt eredményeknél, hogy érdemes lett volna foglalkozni a technikai megvalósítás problémáival. Mivel a vérben jelen levő szabad zsírsavak koncentrációja igen kicsi, vizsgálatainkat negatív ESI ionizációs módszerrel és a SIM mérési technikával folytattuk. 16

50nMC18+1mMCoCl2 9:1, MRM 342-->126 080822_C18_Co_MRMb Sm (Mn, 1x2) 5 µm-os zsírsavoldat 4.58 4.61 5.80 MRM of 2 Channels ES+ 342.3 > 126.2 8.16e3 Vak oldat 50 nm-os zsírsavoldat 1.01 2.45 1.69 3.47 1 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 Time 5. ábra MRM módszer tesztje C18:0 zsírsav Co-adduktjaival Kipróbáltunk mindkét fémion-adduktra több lehetséges MRM csatornát is, de tapasztalataink szerint a vak oldatok, amelyek a fémsók oldatainak és metanolnak a megfelelő arányú keverékei voltak, is adtak jelet. Ez erősen korlátozza a kimutatási határban a módszer használatával elérhető javulást. Ezt a jelenséget valószínűleg a rendszerben folyamatosan jelen lévő zsírsav szennyezések okozzák, amik vagy a berendezésből, vagy az eluensekből származnak. 4.4. A kromatográfiás módszer fejlesztése A zsírsavak elválasztására az osztályunkon korábban kifejlesztett, részlegesen elegyedő oldószerek használatán alapuló módszert használtuk kiindulási alapnak 43 (6. és 7. ábra). 17

IonSabre, 160-400Da, 0.2mL/p MeOH H2O 91 MetHex91, + 0.2AcOH each 070828_LC_50uM 14FASTD_Q1_6 Sm (Mn, 1x1) C20:2 Scan AP- 171.3 2.20e6 C18:1 C16:0 C20:1 C18:0 C18:2 C20:0 C16:1 C14:0 0 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 7.80 8.00 Time 6. ábra Az Osztályon korábban használt kromatográfiás módszerrel elért elválasztás 17 FA STD 50nM, A:MeOH:H2O 8:2, B:MeOH:Hex 9:1 + 0.2 AcOH each 081018_20uM_17_FA_STD_SIM C18:2 SIR of 17 Channels ES- 286.4 1.80e7 C18:1 C20:2 C20:1 C16:1 C16:0 C18:0 C20:5 C14:0 6.09 C22:6 0 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 Time 7. ábra A végleges kromatográfiás módszerrel elért elválasztás 18

Ennek során metanol:víz 9:1 illetve metanol:n-hexán 85:15 oldószereket használtunk, melyet korábban nagy szénatomszámú zsírsavak vizsgálatára dolgoztunk ki. A módszerfejlesztés célja az volt, hogy a kis szénatomszámú, C10:0-tól C16:1-ig terjedő tartományban javítsunk a kromatográfiás módszer felbontásán, mivel az emberi szervezet számára igen fontos C20:5 és C22:6 ω-3 zsírsavak retenciója ebben a tartományban várható. A módszerfejlesztéshez a korábban (4.1. fejezet) említett standard zsírsavkeveréket használtuk. A módszerfejlesztés során először az eluens erősségét csökkentettük le úgy, hogy az A elunsben a korábban használt metanol:víz 9:1 arány helyett 8:2-t, míg a B eluensben metanol:n-hexán 85:15 helyett 9:1-t próbáltunk ki. Ilyen körülmények között a hosszú szénláncú telített zsírsavak (C24:0, C26:0) retenciós ideje túlságosan megnő. Hogy a kromatográfiás ciklus ideje ne nőjön meg túlságosan, megnöveltük az áramlási sebességet a korábban használt 0,2 ml/percről 0,4 ml/percre. Ahhoz, hogy a kromatogram felbontása a teljes tartományban egyenletes legyen, a gradiensprogramot is módosítottuk. A futás elején a B eluens arányának növekedését a korábbi egy szakasz helyett egy meredekebb és egy kevésbé meredek szakaszra osztottuk. Az így módosított módszer esetén, elsősorban a nagyobb áramlási sebességnek köszönhetően, le tudtuk csökkenteni a kromatográfiás futás idejét a korábbi 25 perc helyett 20 percre. Kipróbáltunk egy másik kromatográfiás módszert is, ahol A eluensnek vizet, B eluensnek pedig acetonitrilt használtunk, de ebben az esetben az általunk használt nagy áramlási sebességek (0,3 és 0,6 ml/perc) ellenére túl nagy volt a retenciós ideje a C24:0 és C26:0 zsírsavaknak ( 8. ábra). 19

inj 5 um FA STD MeOHban,, A:H2O, B:ACN + 3 H2O + 0.2 AcOH each 080924_lingrad_ACN_14_FA_STD_5uM Sm (Mn, 1x1) C18:2 Scan ES- 199.4 1.50e7 C16:1 C16:0 C18:1 C10:0 C20:2 C12:0 4.66 C14:0 C20:1 C18:0 C22:0 szennyezés 19.20 0 Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 8. ábra Zsírsavstandard ionkromatogrammjai acetonitril tartalmú eluenssel mérve Az újonnan optimált kromatográfiás módszer esetén az A eluens metanol és víz 8:2 arányú elegye 0,2 ecetsavval, míg a B eluens metanol és hexán 9:1 arányú elegye szintén 0,2 ecetsavval. 20

A:MeOH:H2O 8:2, B:MeOH:Hex 9:1 + 0.2 AcOH each 081018_14_FA_STD_5uM C18:2 C18:1 C16:0 C16:1 C20:2 Scan ES- 171.3 1.26e8 C18:0 C20:1 C14:0 C20:0 C12:0 C10:0 1.82 C22:0 C24:0 C26:0 0 Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 9. ábra A végleges gradienssel mért ionkromatogrammok a zsírsavstandard oldatról Az általunk használt oszlop Purospher Star RP 18-e (125mm*2mm, 3µm) a méréshez használt HPLC a Waters Quattro Micro tömegspektrométerhez kapcsolt Waters 1525µ HPLC pumpa. A használt gradienst az 1. táblázat tartalmazza. t / min A eluens B eluens Áramlási sebesség 0 90 10 0,4 ml/perc 2 60 40 0,4 ml/perc 5 50 50 0,4 ml/perc 5,1 20 80 0,4 ml/perc 12 20 80 0,4 ml/perc 12,1 90 10 0,4 ml/perc 20 90 10 0,4 ml/perc 1. Táblázat A kromatográfiás mérések gradiens programja 4.5. Mintaelőkészítés, extrakció A zsírsavak plazmából történő minél jobb extrakciója érdekében három módszert próbáltunk ki, amelyek közül kettő az irodalomban gyakran használt módszer volt, amelyeket Dole 46 ill. Bligh és Dyer dolgoztak ki 47. A harmadik módszer az Osztályon korábban kidolgozott hexános extrakció volt. Az extrakciós módszereket vak mintával (desztillált víz), 21

az előzőekben említett, 16 zsírsavat tartalmazó standard oldattal, valamint plazmával próbáltuk ki. Az extrakció hatékonyságának teszteléséhez a plazmamintához izotópjelzett belső standardot (deuterált sztearinsav) illetve standard zsírsavkeveréket adtunk, míg a másik részlethez az extrakció és bepárlás után 16 zsírsavas standardot. Vizsgálataink során a plazmának mind a szabad zsírsavtartalmát, mind pedig a teljes zsírsavtartalmát tanulmányoztuk. Az utóbbi esetben a plazmát extrakció előtt hidrolizálnunk kell, hogy a különböző kötött formában (pl. trigliceridek, foszfolipidek, stb.) jelen levő zsírsavakat felszabadítsuk. Ezt savas hidrolízissel végeztük, az alábbi módon: A plazma 100 µl-es részletéhez 80 µl 5 M-os sósavoldatot és 200 µl acetonitrilt adtunk, majd ezt a keveréket 80 C-on 1 órán át termosztáltuk. A hexános extrakció során 100 µl mintát extraháltunk háromszor 500 µl hexánnal. Minden extrakciós lépés során öt percig rázattuk a mintákat, majd öt percig 13000-es fordulatszámon centrifugáltuk le őket, majd a szerves fázist lepipettáztuk. Az egyes extrakciós lépésekben nyert szerves fázisokat egyesítettük, majd nitrogén áramban szárazra bepároltuk. A szárazra párolt mintákat 100 µl metanol:víz 8:2 arányú elegyében feloldottuk, majd a fent ismertetett HPLC-MS módszerrel megvizsgáltuk. A Dole által leírt módszer 46 Puttmann és munkatársai által módosított verzióját alkalmaztuk 48. Mi az eredeti módszerhez képest két további extrakciós lépést iktattunk be az extrakció hatásfokának növelése céljából. Ennek során 100 µl mintához hozzáadtunk 500 µl Dole-oldatot, ami metanol, n-hexán valamint 2 mol/l koncentrációjú foszforsav oldat 40:10:1 arányú elegye. Ezután az így kapott elegyet 5 percig vortexeltük, majd további 200 µl hexánt és 300 µl vizet adtunk hozzá, amit öt perc centrifugálás követett 13000-es fordulatszámon. A felső, szerves fázist lepipettáztuk, majd a mintát még kétszer öt percig extraháltuk kétszer 500 µl hexánnal, minden egyes extrakciós lépés után öt perc centrifugálást beiktatva. Az így kapott szerves fázisokat egyesítettük, az előző módszerhez hasonlóan nitrogén áramban szárazra bepároltuk, a szárazra párolt mintákat 100 µl metanol:víz 8:2 arányú elegyében feloldottuk, majd a fent ismertetett HPLC-MS módszerrel megvizsgáltuk. A harmadik alkalmazott extrakciós módszert Bligh és Dyer írta le 47. Az előzőekhez hasonlóan 100 µl mintából indultunk ki. Ehhez 375 µl szerves oldószert adtunk, ami metanol és kloroform 2:1 arányú elegye, mely 2 g/l koncentrációban hangyasavat is tartalmaz. 5 perc vortexelés után további 125 µl kloroformot, valamint ugyanannyi vizet adtunk az elegyhez, majd 5 perc centrifugálás következett. A lecentrifugált mintáról leszedtük a kloroformos (alsó) fázist, majd a vizes fázist egyszer 1 ml és egyszer 0,5 ml kloroformmal újra extraháltuk 22

5 percig, minden extrakciós lépés után lecentrifugálva a mintát. A szerves fázisok egyesítése után az előző módszerekhez hasonlóan a minta bepárlása, majd metanol:víz 8:2-ben történő oldása következett. Az extrakció hatásfokát a következőképp határoztuk meg. 100 µl plazmához 50 µl 5 µm koncetrációjú standard oldatot adtunk (spike) a mintaelőkészítés előtt, egy másik kísérletben pedig a mintaelőkészítés után (bepárlás után). A mért csúcsterületekből az alábbi arányképzéssel kaptható az extrakció hatásfoka: E = A / B * 100, ahol E: a visszanyerés extrakció hatásfoka (), A: az előkészítés előtt spikeolt mintában egyes komponensekre mért csúcsterületek, B: a mintaelőkészítés után spike-olt mintában mért csúcsterületek. Biológiai minták esetén figyelembe kell venni a márixhatást is, melynek mértékét az alábbiak szerint határoztuk meg. A mintaelőkészítés után spike-olt mintában mért mennyiségeket összehasonlítottuk az 5 µm koncentrációjú standard oldatban mért mennyiségekkel. Ezen adatokból a mátrixhatás számolható: M = B / C *100, amelyben M: a mátrixhatás mértéke -ban kifejezve, B: a mintaelőkészítés után spike-olt mintában mért csúcsterületek, C pedig a standard oldatban mért csúcsterületek. A különböző mintaelőkészítési módszereket összehasonlítva, a módosított Doleextrakció alkalmazása mellett döntöttünk, mely a közepes és hosszú szénláncú zsírsavakra kismértékben jobb extrakciót eredményezett valamint a kémiai háttér e mintalőkészítés esetén volt a legkisebb. A Dole és a Bligh/Dyer-féle extrakciós módszerek hatékonysága hasonló, de gyakorlati szempontból a Dole módszer lényegesen kedvezőbb: Kisebb oldószerigényű, valamint könnyebben kivitelezhető. Ezen túlmenően a Bligh/Dyer módszer esetén az alsó fázist kell kivenni egy Eppendorf-edényből, így a minta könnyen elszennyeződhet a vizes fázissal vagy a plazmából kiváló, a fázishatáron elhelyezkedő fehérjékkel. 4.6. Az analitikai módszer reprodukálhatósága Mérés reprodukálhatóságának a meghatározása: Ehhez 100 µl plazmát extraháltunk Dole-módszerrel, majd az extrakció után kapott szerves fázist bepároltuk, 50 µl metanolban oldottuk és háromszor egymás után megmértük az általunk kidolgozott kromatográfiás módszerrel, SIM módban. Másik 100 µl plazmát a fent leírt módon hidrolizáltunk, majd a Dole-módszerrel extraháltuk és bepárlás valamint 100 µl metanolban történő oldás után három párhuzamos HPLC-MS mérésnek vetettük alá normál 23

scan módban. A mérések eredményei a 2. táblázatban láthatóak, az egyes zsírsavak relatív szórásaival, valamint a relatív szórások átlagával együtt. vizsgált zsírsavak 1. mérés Abszolút zsírsavmennyiségek Relatív zsírsavmennyiségek, 2. mérés 3. mérés Átlag Relatí v szórás () 1. mérés 2. mérés 3. mérés Átlag Relatív szórás () C12:0 4,9E+04 5,0E+04 4,7E+04 4,8E+04 3,5 0,7 0,6 0,6 0,7 3,2 C14:0 2,1E+05 2,2E+05 2,1E+05 2,1E+05 3,2 2,9 2,8 2,8 2,9 1,8 C16:0 2,1E+06 2,2E+06 2,1E+06 2,1E+06 3,5 28,9 28,7 28,8 28,8 0,4 C16:1 2,8E+05 2,9E+05 2,7E+05 2,8E+05 3,7 4,0 3,8 3,7 3,8 3,1 C18:0 6,7E+05 8,5E+05 8,0E+05 7,7E+05 12,4 9,3 11,1 10,9 10,4 9,2 C18:1 1,7E+06 1,8E+06 1,7E+06 1,7E+06 3,8 23,2 23,1 23,0 23,1 0,6 C18:2 2,0E+06 2,0E+06 1,9E+06 2,0E+06 2,4 27,3 26,3 26,6 26,8 2,0 C20:0 3,0E+04 3,4E+04 3,1E+04 3,2E+04 6,5 0,4 0,4 0,4 0,4 2,5 C20:1 2,6E+04 3,0E+04 3,2E+04 2,9E+04 11,7 0,4 0,4 0,4 0,4 10,5 C20:2 4,3E+04 4,5E+04 4,3E+04 4,4E+04 2,9 0,6 0,6 0,6 0,6 1,8 C20:5 1,8E+04 1,9E+04 1,7E+04 1,8E+04 4,6 0,2 0,2 0,2 0,2 3,1 C22:0 2,1E+04 2,0E+04 2,0E+04 2,0E+04 4,0 0,3 0,3 0,3 0,3 7,3 C22:6 4,8E+04 5,0E+04 4,5E+04 4,8E+04 5,7 0,7 0,6 0,6 0,6 4,8 C24:0 3,3E+04 3,5E+04 3,4E+04 3,4E+04 2,1 0,5 0,4 0,5 0,5 1,8 C26:0 1,5E+04 1,5E+04 1,3E+04 1,5E+04 6,9 0,2 0,2 0,2 0,2 6,7 Relatív szórások átlaga: 5,0 Relatív szórások átlaga: 4,0 2. Táblázat LC-MS mérés reprodukálhatóságának vizsgálata Látható, hogy a mérés jól reprodukálható, a mérési eredmények relatív szórásainak átlaga nem haladja meg az 5 -ot és az egyes zsírsavak relatív szórásai sem haladják meg a 10 -ot két esettől eltekintve. Ha a zsírsavak abszolút mennyisége helyett a relatív mennyiségükkel számolunk, akkor pedig még jobb eredményt kapunk, a mérés relatív szórása 4 alatt marad, és a zsírsavak relatív szórásai közül is csak egy haladja meg a 10 -ot. A mintaelőkészítés reprodukálhatóságának meghatározása: Ehhez három párhuzamos mintát vetettünk alá Dole-extrakciónak, valamint három párhuzamos mintát hidrolizáltunk és utána extraháltunk. Szintén vizsgáltuk az Eppendorf mosás reprodukálhatóságát. Ehhez három előzetesen kimosott Eppendorf-edényben 100 µl vizet extraháltunk. A mintákat SIM módban mértük. A mérés során kapott eredmények a 3. táblázatban láthatóak. 24

vizsgált zsírsavak 1. mérés 2. mérés Extrakció szórása 3, mérés Átlag Relatív szórás () 1. mérés 2. mérés Hidrolízis szórása 3. mérés Átlag Relatív szórás () C12:0 0,6 0,6 0,8 0,7 17,4 0,3 0,3 0,4 0,3 8,2 C14:0 3,1 3,0 3,4 3,2 7,0 2,3 2,5 2,2 2,3 6,0 C16:0 28,4 28,8 29,5 28,9 2,0 28,9 30,1 31,2 30,1 3,8 C16:1 4,3 4,1 4,7 4,4 7,0 1,6 1,7 1,6 1,6 3,0 C18:0 13,0 13,1 12,3 12,8 3,5 15,7 14,4 12,5 14,2 11,1 C18:1 21,9 22,4 20,6 21,6 4,4 16,2 16,9 17,4 16,8 3,6 C18:2 25,3 24,7 25,3 25,1 1,4 24,8 23,6 28,2 25,6 9,4 C20:0 0,6 0,5 0,6 0,6 6,5 1,6 1,6 0,9 1,3 31,4 C20:1 0,4 0,4 0,4 0,4 3,8 0,3 0,3 0,2 0,3 15,2 C20:2 0,4 0,4 0,4 0,4 5,2 1,8 1,9 1,1 1,6 26,0 C20:5 0,2 0,2 0,2 0,2 4,9 0,4 0,5 0,3 0,4 31,4 C22:0 0,3 0,3 0,3 0,3 7,8 2,4 2,3 1,4 2,0 26,2 C22:6 0,5 0,5 0,5 0,5 5,1 1,5 1,5 1,3 1,4 7,1 C24:0 0,5 0,5 0,6 0,5 6,9 2,3 2,3 1,3 2,0 31,2 C26:0 0,1 0,1 0,2 0,2 9,4 0,1 0,1 0,1 0,1 11,0 Relatív szórások átlaga: 6,3 Relatív szórások átlaga: 15,2 3. Táblázat Mintaelőkészítés reprodukálhatóságának a vizsgálata Megállapítható, hogy az extrakció jól reprodukálható, a relatív szórások átlaga a zsírsavak relatív mennyiségére 6.4 lesz. A problémát a hidrolízis nagy szórása jelenti. Ha relatív mennyiségekkel számolunk, akkor is csak 15,6 -ra csökkenthető le, de ami ennél is nagyobb problémát jelent, az a négy zsírsavnál is tapasztalható 30 feletti relatív szórás, így a továbbiakban szükséges lesz a hidrolízis reprodukálhatóságának javítása. 4.7. A kidolgozott módszer összefoglalása, általános tapasztalatok Munkánk során kidolgoztunk egy komplex, mintaelőkészítésből és HPLC-MS analízisből álló módszert humán plazma zsírsavösszetételének vizsgálatára. Nagyszámú önkéntes bevonásával történő vizsgálatok esetén általában korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre humán minta, ezért arra törekedtünk, hogy viszonylag kis mennyiségű mintát használjunk fel. A módszer alkalmazása során 2x 100 µl plazmát használunk fel a szabad ill. a teljes zsírsavprofil meghatározására (mely utóbbi esetben a plazma kötött zsírsavait elhidrolizáljuk, majd szabad zsírsav formájában határozzuk meg). Viszonylag egyszerű folyadék-folyadék extrakciót használunk metanol-hexán oldószerkeverékkel. Ez mind a rövid (C10), mind pedig a nagyon hosszú (C26) zsírsavak extrakciójára egyaránt alkalmasnak bizonyult. Eztrakciót követően HPLC-MS módszert használunk a vérben található zsírsavak 25

kimutatására. A vizsgálatokban 16, az emberi szervezetben ill. a táplálkozástudomány szempontjából jelentős zsírsav koncentrációját határoztuk meg. A HPLC elválasztás C18 típusú oszlopon, korlátozottan elegyedő oldószereket (metanol-víz, ill. metanol-hexán) alkalmazó speciális grádiensmódszerrel történt. A tömegspektrometriás méréseket negatív electrospray ionizációs módszerrel végeztük. Az érzékenység növelésére SIM üzemmódot használtunk. Az így kidolgozott módszer lehetővé tette a vérben kis koncentrációban jelen levő szabad zsírsavak kimutatását és közelítő mennyiségi meghatározását. Míg a szabad zsírsavak plazma koncentrációja a 10-5000 nmol/l tartományba esik. Az egyes zsírsavak kimutatási határa ennél 5-10-szer kisebb. Mivel a zsírsavak kimutatási határát elsősorban a kémiai háttér, ezen belül is főleg a környezetben előforduló zsírsavszennyezések szabják meg, a biológiai rendszerekben kis mennyiségben előforduló zsírsavak kimutatási határa igen jó (kb. 3-20 nm/l). A biológiai rendszerekben nagy mennyiségben előforduló zsírsavak kimutatási határa ennél lényegesen kedvezőtlenebb (kb. 100-200 nmol/l), de ez a feladat megoldását nem zavarja. 17 FA STD 50nM, A:MeOH:H2O 8:2, B:MeOH:Hex 9:1 + 0.2 AcOH each 081018_50nM_17_FA_STD_SIM 4.06 SIR of 17 Channels ES- 327.4 3.49e4 0.64 0.93 3.81 1.89 2.17 3.14 4.45 5.24 5.38 6.02 13.08 9.19 10.05 10.83 14.89 15.22 14.68 16.6417.64 17.89 18.96 19.46 19.63 10 081018_vakSIM6 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 SIR of 17 Channels ES- 4.06 327.4 7.98e3 3.81 13.04 2.14 3.17 0.75 0.96 1.67 0.07 1.43 2.67 2.39 4.20 4.38 5.63 5.45 6.02 6.09 9.83 9.51 9.02 8.73 10.19 10.01 10.65 10.87 11.69 11.58 12.26 13.29 13.90 14.61 16.43 19.85 15.11 19.28 16.28 17.28 18.4218.71 16.57 6.49 8.41 7.13 8.27 47 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Time 10. ábra C22:6-os zsírsav 50 nm-os standardjének (felső ábra) valamint vak mintának (alsó ábra az ionkromatogramja (injektált térfogat: 10 µl) (A jel/per zaj viszony kb. 20) 26

Ez lehetővé teszi mind a 16 kiválasztott zsírsav vérből történő kimutatását. Az analitikai módszer reprodukálhatósága ebben a koncentrációtartományban jobb, mint 5. Az extrakció és a HPLC-MS együttes reprodukálhatósága 5-10, a plazma hidrolízisének reprodukálhatósága 10-15. Ez lényegesen jobb, mint az egyes egyedi minták közötti eltérés (amit a következő fejezetben ismertetek részletesen). A mérési módszer zsírsavak kvantitatív meghatározást is lehetővé teszi. A meghatározott kalibrációs görbe mintegy 2 nagyságrenden belül közel lineáris (11. ábra). 800000 C20:5 zsírsav kalibrációs görbéje Csúcs alatti terület / önkényes egység 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0-100000 Y =9259,75376+36,36942 X [2008.Nov.Nov 12:37 "/Graph1" (2454774)] Polynomial Regression for C205_B: Y = A + B1 * X Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A 9259,75376 6310,26037 B1 36,36942 0,80695 ------------------------------------------------------------ R-Square(COD) SD N P ------------------------------------------------------------ 0,99754 14456,44616 7 <0.0001 ------------------------------------------------------------ 0 5000 10000 15000 20000 c / nmol/l. 11. ábra C20:5 zsírsav kalibrációs görbéje A módszerfejlesztés során néhány olyan jelenséget is észleltünk, mely munkánkat jelentősen megnehezítette. Ez ugyanakkor rendkívül tanulságos, amit a későbbi módszerfejlesztések során érdemes figyelembe venni a hatékonyabb és pontosabb munka érdekében. Ezek közül az elsőt a vak minta (azaz tiszta oldószer) injektálást követően a HPLC-MS kromatogramban megjelenő zsírsavcsúcsok jelentették. Megpróbáltuk a szennyezés forrását módszeresen, lépésről-lépésre felderíteni, de ennek ellenére nem tudtuk a szennyezésforrást egyértelműen lokalizálni. Mivel tanulságos, felsoroljuk az elvégzett 27

fontosabb műveleteket: (1) Kitisztítottuk, különböző oldószerekkel átmostuk a HPLC-MS berendezést, az ionforrást, a HPLC injektort, a HPLC oszlopot. (2) Bontatlan csomagolású, nagytisztaságú (LC-MS quality) oldószerekre tértünk át. (3) Vadonatújra cseréltük a HPLC oszlopot, a peek csöveket. (4) Áttértünk manuális injektálásra, és kikötöttük a HPLC-MS rendszer egyes elemeit. (5) Kicseréltük a teljes HPLC rendszert (áttoltuk a szomszéd laboratóriumból). (6) Kicseréltük a tömerspektrométert (a mi HPLC-nket toltuk át a szomszéd laborba). A hosszas vizsgálatok eredményeképp ugyan le tudtuk csökkenteni a HPLC-MS kromatogramokban észlelt zsírsavcsúcsok intenzitását, de még mindig jóval intenzívebbek voltak, mint az egyes ionkromatogramokban észlelt elektronikus vagy kémiai háttér. Szerencsére a zsírsavak nagy részénél a háttérből észlelt csúcsintenzitások lényegesen kisebbek, mint amit plazmamintákban észlelt, így ez vizsgálataink eredményét nem befolyásolta. A fenti eredményekből ugyanakkor azt a következtetést vontuk le, hogy egész környezetünk el van szennyezve különböző zsírsavakkal, és az analitikai módszer kimutatási határát alapvetően ez szabja meg. A másik, szennyezésekkel kapcsolatos problémával az extrakciós módszerek tesztje során szembesültünk. Azt tapasztaltuk, hogy a vak minták extrakciója során az általunk használt műanyag Eppendorf-edényekből is kioldunk zsírsavakat (12. ábra), ami főleg sztearinsav és palmitinsav szennyezést jelentett. 28

ritkan osztott Epp, inj MeOH, A:MeOH:H2O 8:2, B:MeOH:Hex 9:1 + 0.2 AcOH each 081013_Epp1_Dole_extr SIR of 17 Channels ES- 171.3 5.00e6 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Time 12. ábra Új Eppendorf-edény vak extrakciójának az eredménye ritkan osztott Epp, inj MeOH, A:MeOH:H2O 8:2, B:MeOH:Hex 9:1 + 0.2 AcOH each 081013_Epp1_mosott_Dole_extr SIR of 17 Channels ES- 171.3 5.00e6 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 13. ábra Hexánnal mosott Eppendorf-edény vak extrakciójának az eredménye Time 29