QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA 704500 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA 704500 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM F-Actin IgA enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a simaizom F-aktin komponense elleni IgA antitestek szemikvantitatív kimutatására szolgál humán szérumban. A lisztérzékenység klinikai tüneteit mutató betegekben az anti-f-aktin IgA antitestek kimutatása elősegítheti a jelentős bélboholy atrófia valószínűségének becslését. A teszt összegzése és magyarázata Az anti-f-aktin antitestek az úgynevezett simaizom ellenanyagok (smooth muscle antibodies, ASMA) fő komponensei. Ezek az ellenanyagok specifikusak a sejtváz F-aktin komponensére és hagyományosan rágcsálók májának, veséjének vagy gyomrának vékony metszeteiben mutatják ki őket indirekt immunfluoreszcenciával 1-3. Számos komponens ellen készülnek simaizom antitestek, melyek közül a legfontosabb az F-aktin, azonban immunofluoreszcenciával tubulin és intermedier filamentum elleni antitestek is kimutathatók. 4,5 Autoimmun hepatitiszes (AIH) betegekben az anti-simaizom reaktivitás elsősorban az anti-f-aktin antitesteknek, míg vírusos fertőzések, mint például fertőző mononukleózis, vírusos hepatitisz, kanyaró és mumpsz esetében a nem F-aktin elleni citoplazmatikus antitesteknek köszönhető. 4-8 Anti-F-aktin IgG antitesteket AIH betegek 52-85%-ban, primer biliaris cirrhosis-t (PBC) mutató betegek 22%- 7-9, 12-16 ban mutattak ki. Vérszérumban anti-f-aktin IgG antitesteket (általában alacsony titerben) az egészséges populáció 3-18%-ban írtak le. 17 Az autoimmun hepatitiszes betegekre jellemző anti-f-aktin IgG antitestekkel ellentétben az anti-f-aktin IgA antitestek a lisztérzékenység klinikumában jelentősek. Az újabb tanulmányok szerint az F-aktin elleni IgA antitestek erős korrelációt mutatnak a bélboholy atrófia mértékével lisztérzékeny betegekben 18-24. Clemente és mtsai, speciálisan kezelt enterocitákon az anti-f-aktin IgA antitestek kimutatására immunofluorescent assay-t (IFA) használva megállapította, hogy az ellaposodott nyálkahártyával bíró betegek 98.2%-a, szubtotál bélboholy atrófiát mutató betegek 89%-a, a részleges bélboholy atrófiát mutató betegek 30%-a, míg az endomysialis és szöveti transzglutamináz negatív kontrollok 0%-a volt pozitív anti-f-aktin IgA antitestekre. 25 Pedreira, S. és mtsai szerint kezeletlen lisztérzékeny betegek 95%-ban emelkedtek meg az anti-f-aktin IgA értékek egészséges kontrollhoz viszonyítva. 23 Ugyanezen csoport mutatta meg, hogy a magas anti-f-aktin titer értékek az intesztinális sérülés súlyosságával korrelálnak. Az anti-f-aktin antitest szint csökkenése gluténmentes diéta bevezetését követően azt sugallja, hogy ezen antitestek mérésének szerepe lehet a gluténmentes diéta sikeres teljesítésének monitorozásában. 22 Az F-aktin elleni vagy a simaizom antitestek kimutatására szolgáló immunofluoreszcens eljárások szubjektívek, eredményeik a használt szövettől, a konjugátum specificitásától, az eredmények felvételéhez használt mikroszkóp erősségétől, valamint a kísérletező technikai jártasságától függnek. Az először az 1980- as évek közepétől az 1990-es évek elejéig leírt, az F-aktin antitestek kimutatására szolgáló ELISA eljárások 4, 5, 7, 8 ugyanakkor egy jobban standardizálható, kevésbé technika-igényes és jobban automatizálható módszer potenciáljával bírnak. 7,9-12 A módszer elve Tisztított F-Actin antigént rögzítettek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához, olyan körülmények között, ami az antigén natív állapotát képes megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő F-Actin antitestek kikötődnek az immobilizált antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgA konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgA számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgA felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított F-Actin antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek F-Actin antigén ellenes IgA antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. F-Actin IgA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum F-Actin ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. F-Actin IgA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum F-Actin ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA, 1 üveg sárga színűre színezett, puffert, protein 1

stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 28 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. 2

A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 29 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 F-Actin ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL F-Actin IgA ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL F-Actin IgA ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgA Konjugátum, (kecske), anti-humán IgA 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a F- Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. A F-Actin antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgA Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A 3

POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. Az ELISA negatív kontroll és a F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. A F-Actin IgA ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az CLSI (NCCLS) Document C24-A3 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 30 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk a F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk a F-Actin IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x F-Actin IgA ELISA mérs. Pozitív (egység) F-Actin IgA ELISA mérs. Pozitív OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, kétes (átmeneti), vagy pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív < 20 Kétes 20.1 24.9 Pozitív > 25 1. Az anti-f-aktin IgA pozitív eredmény lisztérzékeny betegekben jelzi a súlyos bélboholy atrófia megemelkedett valószínűségét. 4

2. Egy negatív eredmény arra utal, hogy a mintában nincs F-Actin IgA antitest, vagy annak koncentrációja a teszt küszöb értéke alatt van. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott vélemény tartalmazza az alábbi kijelentést: Az itt következő eredmények az INOVA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA használatával keletkeztek. A különböző gyártók assay módszereivel kapott F-Actin IgA értékek nem használhatók felváltva. A közölt IgA értékek nagysága nem hasonlítható egy végpont-titer értékhez. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden lisztérzékeny beteg pozitív F-aktin IgA antitestekre. 3. Nem minden simaizom pozitív minta tartalmaz majd F-aktin antitesteket. 4. Az F-aktin antitestek észlelése májbetegekben óvatossággal diszkutálandó, hiszen ebben a betesegcsoportban az F-aktin IgG antitestek gyakran F-aktin IgA antitestekkel együtt vannak jelen, amely valószínűleg független a belek patofiziológiájától. Az F-aktin antitestek mérése csak lisztérzékeny betegekben végzendő el, segítségként a bélkárosodás felméréséhez. 5. Az eredményeket a klinikai adakok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 6. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Teljesítmény adatok Várható értékek Referencia tartomány A QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA kit-tel egy 500 darabból álló mintapanelt teszteltek, melyet látszólag egészséges személyektől (250 férfi és 250 nő) gyűjtöttek. Az életkor 18-tól 80 évig terjedt (medián=41). A teszt specificitása 92.2%-os volt (461/500). 39 mintából 3 ttg IgA antitestekre pozitívnak és ezzel feltételezhetően nem diagnosztizált lisztérzékeny betegnek bizonyult. A három minta egyike ugyanakkor endomysialis pozitív is, és ezzel látszólag bizonyosan valódi lisztérzékeny volt. A lisztérzékenység prevalenciáját az egészséges USA populációban 1:133-hoz arányúnak becsülték, ezért nem diagnosztizált beteg észlelése a normál csoportban nem váratlan. 26 Klinikai szenzitivitás és specificitás Mivel a QUANTA Lite TM F-Actin IgA teszt rendeltetése az intesztinális sérülés valószínűségének felmérése lisztérzékeny betegekben, a teszt érzékenységét és specificitását 450 olyan minta alapján számították, amelyek biopsziás eredményekkel is rendelkeztek. A 445 mintából 157 mutatott Marsh 3, és 288 mutatott Marsh 0, 1 és 2 patológiát. 27 N =445 Marsh Pontszám F-Actin IgA Egység M3a/b/c M0,M1,M2 Minden Poz (>24.9 egység) 76 14 90 Neg (<24.9 egység) 81 274 355 Minden 157 288 445 Kétértelmű, negatívnak értelmezett eredmények (i.e. nem pozitív) Klinikai szenzitivitás: 48.4% (76/157) (95% CI, 40.4% to 56.5%) Klinikai specificitás: 95.1% (274/288) (92.0 97.3%) Pozitív Előrejelzés éretéke: 84.4% Negatív Előrejelzés éretéke: 88.4% Hatékonyság: 78.7% Ha az elvégzett számításokban referencia indexként csak az M3c-t (teljes bélboholy atrófia) használják, az érzékenység 59.4%-os, a specificitás 91.3%-os, az alábbiaknak megfelelően. N =445 Marsh Pontszám F-Actin IgA Egység M3c Non-M3c Minden Poz (>24.9 egység) 60 30 90 Neg (<24.9 egység) 41 314 355 Minden 101 344 445 Kétértelmű, negatívnak értelmezett eredmények (i.e. nem pozitív) Klinikai szenzitivitás: 59.4% (60/101) (95% CI, 49.2% to 69.1%) Klinikai specificitás: 91.3% (314/344) (87.7 94.0%) Pozitív Előrejelzés éretéke: 66.7% Negatív Előrejelzés éretéke: 88.5 Hatékonyság: 78.7% Összehasonlítás egy előrejelző eszközzel A QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA-t egy FDA engedélyezett, a lisztérzékenységet jelző szöveti transzglutamináz (ttg) elleni antitestek kimutatására szolgáló eszközzel hasonlították össze. A pozitív százalék megegyezése 74/128=57.8%, míg a negatív százalék megegyezése 27/29=93.1% volt, amikor Marsh 3a, 3b vagy 3c lisztérzékeny betegeket teszteltek a két eszközzel. Amikor kizárólag Marsh 3c (teljes bélboholy atrófia) patologiát mutató személyeket teszteltek, a pozitív százalék megegyezése 60/98=61.2%, 5

míg a negatív százalék megegyezése 3/3=100% volt. Míg a legtöbb F-aktin IgA pozitív minta egyben ttg pozitív is, csak a súlyos intesztinális sérülést mutató betegek pozitívak F-aktin IgA-ra. Kereszt-reaktivitás 36 beteg autoimmun/fertőző betegség antitestet tartalmazó szérum, illetve specifikus betegség-stádiumra jellemző szérum, mint gyomor parietális sejt, RNP, SSA, SSb, Scl70, Jo1, glomerulus alapi membrán, LKM- 1, oldható máj antigén, centromer, kromatin, autoimmun hepatitisz, primer biliaris cirrhosis, hepatitisz B vírus, hepatitisz C vírus, primer szklerotizáló cholangitis keresztreaktivitását tesztelték a QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA-val. Néhány májbetegségből származó minta F-aktin IgA antitestre pozitívnak bizonyult. Az F- aktin IgA antitestek észlelése ebben a betegségcsoportban körültekintéssel interpretálandó, hiszen ezen betegségcsoportban az F-aktin IgG antitestek gyakran F-aktin IgA antitestekkel együtt vannak jelen, amely valószínűleg független a bél patobiológiájától. Precizitás és reprodukálhatóság Az intra-assay teljesítményt 6 minta egyenként összesen 7 futtatásával értékelték. 1. Táblázat Intra-assay Teljesítmény ból QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 Átlag egység 104.2 152 37 38.8 14 17.4 SD 2.4 7 0.3 1.5 0.4 0.4 CV% 2.3 4.6 0.9 3.8 3.0 2.6 Az interexperimentális teljesítményt 6 minta, a kit magas pozitív kontrollja (high positive control, HPC) és egy negatív kontroll (NC) duplikátumait vizsgálva értékelték naponta két ismétlést elvégezve (reggel és délután) három napon keresztül. 2. Táblázat: Inter-assay Teljesítmény -ért QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA HPC Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 NC Átlag egység 78.3 104.8 156.8 41.5 41.1 14.8 17.0 1.0 SD 4.7 6.6 5.8 1.7 2.6 0.7 0.8 0.1 CV% 6.0 6.3 3.7 4.2 6.4 5.0 4.7 10.5 6

Hivatkozások 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, 473-88 (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, 57-56 (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, 403-10 (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, 621-8 (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, 76-82 (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, 705-9 (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, 611-6 (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, 328-38 (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, 631-3 (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, 129-32 (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, 2731-6 (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, 1068-73 (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, 878-84 (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, 280-4 (2006). 16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, 107-8 (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, 818-23 (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, 917-20 (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47, 520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, 386-92 (2004). 23. Pedreira, S. et al. Significance of smooth muscle/anti-actin autoantibodies in celiac disease. Acta Gastroenterol Latinoam 35, 83-93 (2005). 24. Norman, G. L. et al. in Association of Medical Laboratory Immunologists (Chicago, Ill, 2007). 25. Clemente, M. G. et al. Enterocyte actin autoantibody detection: a new diagnostic tool in celiac disease diagnosis: results of a multicenter study. Am J Gastroenterol 99, 1551-6 (2004). 26. Fasano, A. et al. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 163, 286-92 (2003). 27. Antonioli, D. A. Celiac disease: a progress report. Mod Pathol 16, 342-6 (2003). 28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 29. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38): 2004. 30. CLSI (NCCLS). Feb 1999. Statistical quality control: Principles and definitions: Approved Guideline- Third Edition. CLSI Document C24-A3, Vol 26(25):1999 7

A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 624500HUN April 2008 Revision 0 8